4-1BB/4-1BBL-interaktio edistää lihavuuden aiheuttamaa rasvatulehdusta laukaisemalla kaksisuuntaista tulehduksellista signalointia adiposyyteissä/ makrofageissa

Abstract

Lihavuuden aiheuttamalle rasvatulehdukselle on ominaista makrofagien rekrytoituminen rasvakudokseen ja tulehduksellisten sytokiinien vapautuminen. 4-1BB, kostimulatorinen reseptori, moduloi tulehdusprosesseja vuorovaikutuksessa sen ligandin 4-1BBL:n kanssa immuunisolujen pinnoilla. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin, osallistuuko rasvasolujen ja makrofagien välinen 4-1BB/4-1BBL-vuorovaikutus lihavuuden aiheuttamaan rasvatulehdukseen. Havaitsimme, että 4-1BB ilmentyi adiposyyteissä ja että lihavuuteen liittyvät tekijät säätelivät sitä, mikä lisäsi myös 4-1BBL:n ilmentymistä makrofageissa. 4-1BB- ja/tai 4-1BBL-agonistit aktivoivat tulehdussignaalimolekyylejä (MAPK/IκBα ja MAPK/Akt) rasvasoluissa ja makrofageissa ja lisäsivät tulehdussytokiinien (MCP-1, TNF-α ja IL-6) vapautumista. Lisäksi 4-1BB/4-1BBL-vuorovaikutuksen katkaiseminen vähensi tulehdussytokiinien vapautumista kontaktikokulturoiduista adiposyyteistä/makrofageista. Nämä havainnot osoittavat, että 4-1BB/4-1BBL-välitteinen kaksisuuntainen signalointi rasvasoluissa/makrofageissa edistää rasvatulehdusta. 4-1BB ja 4-1BBL voivat olla käyttökelpoisia kohteita, joilla voidaan suojautua lihavuuden aiheuttamalta rasvatulehdukselta.

1. Johdanto

Lihavuuden aiheuttamaa tulehdusta pidetään mahdollisena syynä aineenvaihdunnan häiriöihin, kuten insuliiniresistenssiin, tyypin 2 diabetekseen ja sydän- ja verisuonitauteihin . Rasvakudos osallistuu aktiivisesti lihavuuden aiheuttamaan tulehdukseen rekrytoimalla makrofageja ja T-soluja ja vapauttamalla tulehdussytokiineja (monosyyttien kemotaktinen proteiini-1, MCP-1; tuumorinekroositekijä alfa, TNF-α; interleukiini-6, IL-6), jotka muokkaavat rasvasolujen erilaistumista, aineenvaihduntaa ja paikallisia/systeemisiä tulehdusreaktioita aiheuttaen ei-toivottuja aineenvaihdunnan epätasapainoa . Mielenkiintoista on, että viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että adiposyyttien ja makrofagien kokoviljely suorassa kosketuksessa johtaa selvästi lisääntyneeseen tulehdussytokiinien vapautumiseen , mikä osoittaa, että näiden solujen solupintamolekyylien välinen vuorovaikutus on tärkeää niiden tulehdusreaktioiden edistämisessä.

4-1BB (tunnetaan myös nimillä CD137 ja TNFRSF9) on klassinen esimerkki costimulatorisesta molekyylistä ja tunnettu tulehdusreseptori, jota aktivoituneet T-solut ilmentävät tulehduskohteissa . T-solujen 4-1BB:n stimulaatio johtaa solujen laajenemiseen, sytokiinituotantoon ja sytolyyttisten efektoritoimintojen kehittymiseen . 4-1BB-ligandi (4-1BBL, tunnetaan myös nimillä CD137L ja TNFSF9) ilmentyy voimakkaasti useimmissa immuunisoluissa ja monissa ei-immuunisoluissa, ja se voi vastaanottaa ja välittää käänteisiä signaaleja soluihin, kuten makrofageihin . Kertyvät todisteet osoittavat, että kaksisuuntaiset solupinnan 4-1BB/4-1BBL-vuorovaikutukset immuunisoluissa ovat kriittisiä erilaisten tulehdusreaktioiden käynnistämisessä ja moduloinnissa (esim. nivelreuma, autoimmuuni sydänlihastulehdus ja hematologiset maligniteetit) . Lisäksi 4-1BB/4-1BBL-välitteisiä vuorovaikutuksia esiintyy myös immuunisolujen ja muiden kuin immuunisolujen välillä, mikä taas vaikuttaa tulehdusreaktioihin. Esimerkiksi 4-1BB:n ja 4-1BBL:n vuorovaikutus endoteelisoluissa ja makrofageissa on osallisena verisuonitulehduksessa , ja näiden kahden molekyylin vuorovaikutus epiteelisoluissa ja luonnollisissa tappajasoluissa on osallisena munuaisten iskemia-reperfuusiovauriossa . Osoitimme aiemmin, että 4-1BB:n ja 4-1BBL:n ilmentyminen oli säännelty liikalihavuuden vuoksi tulehtuneessa rasvakudoksessa ja että 4-1BB:n ablaatio vähensi rasvakudoksen tulehdusta. Näin ollen oletimme, että rasvasolujen ja immuunisolujen, kuten makrofagien, 4-1BB:n ja 4-1BBL:n välisellä vuorovaikutuksella on merkitystä rasvakudoksen tulehduksessa liikalihavuudessa.

Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa, että 4-1BB ilmentyy rasvasoluissa ja että lihavuuteen liittyvät tekijät säätelevät sitä ylöspäin, ja osoitamme, että 4-1BB/4-1BBL-välitteisellä kaksisuuntaisella signaloinnilla rasvasoluissa/makrofageissa on ratkaiseva merkitys lihavuuden aiheuttaman rasvatulehduskaskadin käynnistämisessä ja edistämisessä.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Aineisto ja menetelmät

2.1. Aineisto ja menetelmät. Eläimet

C57BL/6-hiiriä (urospuolisia, 8 viikon ikäisiä) (Orient Ltd., Busan, Korea) ruokittiin runsasrasvaisella ruokavaliolla (HFD, 60 % kaloreista rasvaa (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA); liikalihavat hiiret) tai vähärasvaisella ruokavaliolla (LFD; 10 % kaloreista rasvaa (Research Diets); liikalihavuutta sairastamattomat hiiret) 9 viikon ajan. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Ulsanin yliopiston eläineettisessä komiteassa ja ne olivat National Institutes of Health -ohjeiden mukaisia.

2.2. Vasta-aineet

Alastomat hiiret pohjustettiin pristanilla ja injektoitiin vatsansisäisesti subkloonatulla hybridoomalla, joka tuotti agonistista monoklonaalista vasta-ainetta (Ab) 4-1BB:tä (3E1) vastaan askiitin muodostumisen aikaansaamiseksi . Monoklonaalinen Ab puhdistettiin askitesnesteestä affiniteettikolonnikromatografialla proteiini G-Sepharoosilla (Sigma-Aldrich). Rekombinantti 4-1BB Fc (r4-1BB Fc) ostettiin Adipogenilta (Soul, Korea). Antagonistinen monoklonaalinen Ab 4-1BBL:ää vastaan (TKS-1) ostettiin e-Bioscience (San Diego, CA, USA). Rotan immunoglobuliini G (Rat IgG) ja ihmisen IgG1 ostettiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA), ja niitä käytettiin kontrolleina.

2.3. Soluviljelmät ja käsittelyt

Hiiren makrofagosolulinja Raw264.7 saatiin Korean Cell Line Bankista (KCLB40071, Soul, Korea). Tätä solulinjaa ylläpidettiin RPMI1640:ssä (Gibco BRL, NY, USA), joka sisälsi 10 % (tilavuus/tilavuus) FBS:ää (naudan sikiöseerumi) (Gibco BRL, NY, USA), ja sitä inkuboitiin 37 °C:ssa kostutetussa 5 % CO2:ssa. 3T3-L1-preadiposyyttejä ylläpidettiin DMEM:ssä (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), jossa oli runsaasti glukoosia (Gibco BRL, NY, USA) ja 10 % FBS:ää. Konfluentteja 3T3-L1-preadiposyyttejä (päivä 0) inkuboitiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10 μg / ml insuliinia (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (deksametasoni, Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (3-isobutyyli-1-metyyli-ksantiini, Sigma-Aldrich) ja 10 %:n FBS:ää 2 päivää. Lyhyesti sanottuna 3T3-L1-solut erilaistettiin kypsiksi adiposyyteiksi inkuboimalla DMEM:ssä, jossa oli 10 % FBS ja 5 μg/ml insuliinia 2 päivän ajan. Kypsät adiposyytit säilytettiin tässä väliaineessa, ja elatusaine korvattiin tuoreella väliaineella 2 päivän välein. Vapaa rasvahappo (FFA, palmitiinihapposeos, Sigma-Aldrich) liuotettiin etanoliin, joka sisälsi naudan seerumin albumiinia (BSA, 25 μM), ja konjugoitiin BSA:n kanssa moolisuhteessa 10 : 1 ennen käyttöä. 3T3-L1-rasvasoluja (3 × 105 solua/kuoppa) tai Raw264.7-makrofageja (3 × 105 solua/kuoppa) 24-kuoppalevyissä käsiteltiin lihavuuteen liittyvillä tekijöillä (palmitiinihappo: pal, lipopolysakkaridi: LPS) 24 h tai 4 h ajan. 4-1BB:n stimuloimiseksi adiposyyteissä 24-kuoppalevyillä olevia 3T3-L1-adiposyyttejä inkuboitiin agonistisella 4-1BB Ab:llä (3E1, 1 μg/ml) tai rotan IgG:llä 48 tunnin ajan seerumittomassa väliaineessa. R4-1BB Fc:n tai ihmisen IgG1:n immobilisoimiseksi viljelylevyille r4-1BB Fc:tä tai ihmisen IgG1:tä inkuboitiin 24-kuoppalevyissä 37 °C:ssa 1 tunnin ajan CO2-inkubaattorissa ja kuopat huuhdeltiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Sen jälkeen levyjä inkuboitiin RPMI:ssä (10 % FBS) 37 °C:ssa 1 h CO2-inkubaattorissa ja kuopat huuhdeltiin PBS:llä. Raw264.7-makrofageja inkuboitiin 5 × 105 solua/kuoppa 24-kuoppaisissa litteäpohjaisissa levyissä, jotka oli esipäällystetty 100 ng/mL r4-1BB Fc:llä tai inhimillisellä IgG1:llä 24 tunnin ajan.

2.4. Stroomaalisten verisuonisolujen eristäminen rasvakudoksesta

Stroomaalisen verisuonifraktion (SVF) eristämiseksi rasvakudoksesta C57BL/6-hiirten (urospuoliset, 8 viikon ikäiset) epididymiaaliset rasvatyynyt hienonnettiin ja pilkottiin 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa tyypin 2 kollagenaasilla (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) DMEM:ssä (pH 7,4). Tuloksena saadut suspensiot sentrifugoitiin 500 g:n nopeudella 5 minuutin ajan. Pelletit suspendoitiin uudelleen erytrosyyttien lyysipuskuriin, ja suspensioita inkuboitiin huoneenlämmössä 3 minuuttia, minkä jälkeen ne sentrifugoitiin 500 g:n voimakkuudella 5 minuuttia. Kun suspensiot oli pesty DMEM:ssä, ne ohjattiin steriilien 100 μm:n nailonverkkojen (SPL Lifescience, Pocheon, Korea) läpi. Suodatetut solut siirrettiin 100 mm2 -maljoille, jotka sisälsivät DMEM:ää, jota oli täydennetty 10 %:lla FBS:ää ja 0,4 %:lla Fungizonea, ja niitä pidettiin inkubaattorissa 37 °C:ssa 5 %:ssa CO2:ssa. Solujen annettiin kiinnittyä ja kelluvat solut poistettiin imemällä, ja kasvatusmediaa täydennettiin joka päivä. SVF-solut kerättiin 2 päivän kuluttua. SVF-solut sijoitettiin 5 × 105 solua/kuoppa 24-kuoppalevyihin. Valuvat SVF:stä peräisin olevat preadiposyytit erilaistettiin adiposyyteiksi käsittelemällä DMEM:llä, joka sisälsi 10 μg/mL insuliinia (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX:ää (Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX:ää (Sigma-Aldrich) ja 10 % FBS:ää 2 päivän ajan. Kypsät adiposyytit pidettiin kasvatusmediassa, joka korvattiin tuoreella mediumilla 2 päivän välein. 4-1BB:n ja 4-1BBL:n ilmentymisen havaitsemiseksi SVF:stä peräisin olevissa adiposyyteissä, jotka altistuivat liikalihavuutta aiheuttaville tekijöille, näitä soluja inkuboitiin palmitiinihapolla 250 μM, LPS:llä 100 ng/ml 24 h ajan.

2.5. Peritoneaalisten makrofagien eristäminen

C57BL/6-hiiret (urospuoliset, 8 viikon ikäiset) ruiskutettiin vatsansisäisesti 3 ml:lla 3 %:n tioglykolaattilientä (Difco, Detroit, MI, USA) 4 päivää ennen lopettamista. Peritoneaaliset makrofagit kerättiin sentrifugoimalla MEM-mediassa (Minimum Essential Medium, Gibco), ja saatu pelletti pestiin ja suspendoitiin uudelleen MEM-viljelymediassa, jossa oli 10 % FBS:ää. Peritoneaaliset makrofagit puhdistettiin tarttumalla kudosviljelylevyihin 2 tunnin ajan. 4-1BB:n ja 4-1BBL:n ilmentymisen havaitsemiseksi peritoneaalisissa makrofageissa, jotka altistuivat lihavuustekijöille, näitä soluja inkuboitiin palmitiinihapolla 250 μM, LPS 100 ng/ml 4 h.

2.6. Adiposyyttien ja makrofagien yhteiskulttuuri

3T3-L1-adiposyyttejä kasvatettiin ja erilaistettiin 6 päivän ajan. Adiposyyttien ja makrofagien kokoviljely suoritettiin kahdella menetelmällä: suoran kontaktin kokoviljely ja transwell-kokoviljely. Suorassa kontaktissa Raw264.7-makrofagit (3 × 105 solua: 50 % makrofageja, 3 × 104 solua: 10 % makrofageja) tai peritoneaaliset makrofagit (3 × 105 solua) sijoitettiin 24-kuoppalevyihin, jotka sisälsivät 3T3-L1-adiposyyttejä (3 × 105 solua). Soluja kasvatettiin 24 tunnin ajan kosketuksissa toisiinsa ja ne kerättiin pois. Kontrollina adiposyyttejä ja makrofageja viljeltiin myös erikseen, jolloin solujen määrä kuoppaa kohti oli sama kuin kontaktijärjestelmässä, ja ne sekoitettiin sadonkorjuun jälkeen. Trans-kuoppajärjestelmässä soluja viljeltiin yhdessä käyttämällä trans-kuoppia, joissa oli 0,4 μm:n huokoinen kalvo (Corning, NY, USA) adiposyyttien (3 × 105 solua, alempi kuoppa) ja makrofagien (3 × 105 solua, ylempi kuoppa) erottamiseksi. Kun inkubaatio oli kestänyt 4 h, 8 h ja 12 h, supernatantit kerättiin.

2.7. Sytokiinitasojen mittaaminen

Sytokiinitasot viljelmien supernatanteista mitattiin entsyymisidonnaisilla immunosorbenttimäärityksillä (ELISA). Määrityksissä käytettiin OptEIA-hiiren TNFα-, hiiren MCP-1-sarjaa (BD Bioscience Pharmingen, CA, USA) ja hiiren IL-6- ja adiponektiinisarjaa (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) sekä IL-10-sarjaa (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Sytokiinitasojen arvot johdettiin standardikäyristä käyttäen käyränsovitusohjelmaa SOFTmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

2.8. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR)

Viljellyistä soluista uutettu kokonais-RNA transkriboitiin käänteisesti cDNA:n tuottamiseksi käyttäen M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI, USA). cDNA:n reaaliaikainen PCR-monistaminen suoritettiin kahtena kappaleena SYBR premix Ex Taq kitillä (TaKaRa Bio Inc., Foster, CA, USA) Thermal Cycler Dice -laitteella (TaKaRa Bio Inc., Japani). Kaikki reaktiot suoritettiin samalla menettelyllä: alkuperäinen denaturointi 95 °C:ssa 10 sekunnin ajan, jota seurasi 45 sykliä 95 °C:ssa 5 sekunnin ajan ja 60 °C:ssa 30 sekunnin ajan. Kaikki kiinnostavien geenien arvot normalisoitiin housekeeping-geenien arvoihin (36B4 adiposyyttien osalta; β-aktiini makrofaagien ja kokulttuurien osalta). Käytetyt hiiren alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1.

geeni Eteenpäin suuntautuva alukesekvenssi Käänteinen alukesekvenssi 4-…1BB CTCTGTGCTCAAATGGATCAGGAA TGTGGACATCGCAGCTACAA 4-1BBL CCTGTGTTCGCCAAGCTACTG CGGGACTGTCTACCACCAACTC MCP-1 GCATCCACGTGTTGGCTCA CTCCAGCCTACTCATTGGGATCA TNF- AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTTTG -6 CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA GCAAGTGCATCATCATCGTTGTTCATAC 36B4 TGTGTGTCTGCAGCAGATCGGGTAC CTTTGGCGGGATTAGTCGAAG – -aktiini CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC ATGGAGCCACCCGATCCACA

TAULUKKO 1

Taulukko 1

QRT-PCR-analyyseissä käytettyjen hiirten alukkeiden sekvenssit.

Tiedot analysoitiin Thermal Cycler Dice Real Time System -ohjelmistolla (Takara Bio, Inc.). Suhteelliset standardikäyrät luotiin piirtämällä syklin kynnysarvot (Ct). Kustakin näytteestä saatujen Ct-arvojen perusteella laskettiin kohdegeenien suhteelliset määrät käyttämällä standardikäyriä Takara Thermal Cycler Dice Real Time System -ohjelmistolla.

2.9. Kunkin näytteen Ct-arvojen perusteella laskettiin kohdegeenien suhteelliset määrät. Adiposyyttien ja makrofagien erottelu

Kokuljetetut 3T3-L1-adiposyytit ja Raw264.7-makrofagit, joita oli yhtä monta (kuten aiemmin on kuvattu), erotettiin toisistaan valmistajan protokollan mukaisesti CD11b MicroBeads -järjestelmällä (MACS; Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, USA). Lyhyesti sanottuna kokokulturoidut solut kerättiin, pestiin kahdesti puskurilla (PBS, jota täydennettiin 2 mM EDTA:lla ja 0,5 %:lla naudan seerumin albumiinilla-BSA:lla) ja inkuboitiin CD11b-mikrohelmien kanssa 15 minuutin ajan 4 °C:ssa. Pestyt ja resuspendoidut solut levitettiin MACS-pylvääseen, joka pidätti CD11b+-solut ja päästi negatiiviset solut (adiposyytit) läpi. Tämän jälkeen kolonni poistettiin erottimesta ja asetettiin sopivaan keräysputkeen. Pylvääseen pipetoitiin sopiva määrä pylväspuskuria positiivisten solujen (makrofagien) huuhtelemiseksi pois käyttämällä pylvään mukana toimitettua mäntää. Tällä menetelmällä saatiin 90-95 prosenttia puhtaita CD11b+-soluja virtaussytometrialla arvioituna.

2.10. Virtaussytometrinen (FACS) analyysi

3T3-L1-adiposyytit ja Raw264.7 makrofagit, joita oli käsitelty lihavuuteen liittyvillä tekijöillä (kuten aiemmin on kuvattu), trypsiinöitiin varovasti, pestiin kahdesti PBS:llä ja inkuboitiin Fcγ-reseptoria estävillä vasta-aineilla (24G2) 10 minuutin ajan jäällä, minkä jälkeen ne värjättiin fykoterytriinillä (PE) konjugoidulla anti-4-1BB:llä (eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-4-1BBL (eBioscience) tai anti-Rat (eBioscience), Golden Syrian Hamster IgG (eBioscience) ja anti-CD11b (eBioscience) kontrollina adiposyyttien/makrofagien portin määrittämiseksi. Tämän jälkeen solut pestiin FACS-puskurilla ja analysoitiin FACSCaliburilla (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) CellQuest-ohjelmistolla (BD Biosciences). Numerot kuvaajissa osoittavat positiivisten solujen prosenttiosuudet.

2.11. Western Blot -analyysi

3T3-L1-adiposyytit sijoitettiin 1 × 106 solua/kuoppa 6-kuoppalevyihin ja inkuboitiin 3E1:llä (1 μg/ml) tai rotan IgG:llä 3 h. Raw264.7-makrofagit sijoitettiin 1 × 106 solua/kuoppa 6-kuoppalevyihin, jotka oli päällystetty r4-1BB Fc:llä tai inhimillisellä IgG:llä 1 h ajan. 3E1-käsitellyt adiposyytit ja r4-1BB Fc:llä käsitellyt makrofagit huuhdeltiin PBS:llä, resuspendoitiin kaapimalla lyysipuskuriin (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM MgCl2, 0,5 % deoksikolaatti, 1 % IGEPAL ja proteaasinestäjien koktail) ja sentrifugoitiin 3000 rpm:n kierrosnopeudella 5 minuuttia. Näytteille, jotka sisälsivät 10-30 μg kokonaisproteiinia, tehtiin western blot -analyysi käyttäen polyklonaalisia vasta-aineita fosforyloitua IKK:ta (I kappa B -kinaasi alfa/beta; p-IKK α/β, Ser180/Ser181), IKKβ:n kokonaismäärää, p-p38 MAPK:ta (mitogeeniaktivoitunut proteiinikinaasi), p-JNK:ta (c-Junin aminoterminaalinen kinaasi), JNK:n kokonaismäärää, p-Akt:ia (proteiinikinaasi B; Ser473), Akt yhteensä (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) ja IκBα (ydintekijä-κB alfan inhibiittori; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) sekä β-aktiini (Sigma).

2.12. Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvoina ± SEM kolmesta riippumattomasta, kahtena kappaleena tehdystä tutkimuksesta. Tilastolliset vertailut suoritettiin käyttäen Studentin -testiä tai ANOVA:ta Duncanin moninkertaisen vaihteluvälin testillä. Erojen katsottiin olevan merkitseviä .

3. Tulokset

3.1. 4-1BB:n ja 4-1BBL:n ilmentyminen adiposyyteissä/makrofageissa ja rasvakudoksessa

Määritimme ensin 4-1BB:n ilmentymisen adipogeneesin aikana mRNA-tasolla qRT-PCR:llä. Havaitsimme, että 4-1BB-transkriptien tasot olivat suurempia SVF:stä peräisin olevissa adiposyyteissä erilaistumisen jälkeen (kuva 1(a)). Tärkeää on, että lihavuuteen liittyvät aineet, kuten palmitiinihappo ja LPS, säätelivät merkittävästi 4-1BB-transkriptien tasoja SVF:stä peräisin olevissa adiposyyteissä ja 4-1BBL-transkriptien tasoja peritoneaalisissa makrofageissa (kuva 1(b)). Transkriptien ylössäätely vahvistetaan 3T3-L1-rasvasoluissa ja/tai Raw264.7-makrofageissa (kuva 1(c)). FACS-analyysi osoitti myös, että 3T3-L1-adiposyyttien 4-1BB-proteiini ja Raw264.7-makrofagien 4-1BBL-proteiini (kuva 1(d)) lisääntyivät näiden lihavuuteen liittyvien tekijöiden vaikutuksesta. Lisäksi 4-1BB- ja 4-1BBL-transkriptiot lisääntyivät kokoviljellyissä adiposyyteissä/makrofageissa (kuva 1(e)) sekä HFD:llä ruokittujen lihavien hiirten epididymaalisessa rasvakudoksessa (kuva 1(f)).

3.2. Tulehdussytokiinien vapautuminen ja tulehdussignaalimolekyylien aktivoituminen 4-1BB- ja 4-1BBL-stimulaation vaikutuksesta adiposyyteissä ja makrofageissa, vastaavasti

Tutkittaessa, antaako adiposyyteihin kohdistuva 4-1BB tai makrofageihin kohdistuva 4-1BBL tulehdussignaalin, käsiteltiin kumpaakin solutyyppiä agonisteilla, jotka spesifisesti stimuloivat näitä molekyylejä; 3T3-L1-rasvasoluja käsiteltiin agonistisella 4-1BB-vasta-aineella (3E1) 48 tunnin ajan ja Raw264.7-makrofageja r4-1BB-Fc:llä 24 tunnin ajan, minkä jälkeen mitattiin tulehdussytokiinien tasot kyseisissä soluissa. Sekä rasvasolujen 4-1BB-stimulaatio että makrofagien 4-1BBBL-stimulaatio lisäsivät selvästi proinflammatoristen sytokiinien, kuten MCP-1:n, TNF-α:n ja IL-6:n tuotantoa mRNA- (kuvat 2(a) ja 2(c)) ja proteiinitasolla (kuvat 2(b) ja 2(d)). Adiponektiinin eritystä adiposyyteistä ei muuttanut 4-1BB-stimulaatio (tietoja ei ole esitetty). Makrofagien 4-1BBL-stimulaatio vähensi IL-10:n transkriptioita (kuva 2(c)), mutta IL-10-proteiinin vapautumisessa ei havaittu muutosta (kuva 2(d)).

Kuva 2

4-1BB- tai 4-1BBL-stimulaatio lisää erilaisten tulehdussytokiinien vapautumista adiposyyteistä tai makrofageista. 3T3-L1-adiposyyttejä ja Raw264.7-makrofageja käsiteltiin vastaavasti 1 μg/mL 3E1:llä ja 100 ng/mL r4-1BB Fc:llä 48-24 tunnin ajan. 3T3-L1-adiposyyteistä (a-b) ja Raw264.7-makrofageista (c-d) mitattiin tämän jälkeen MCP-1-, TNF-α-, IL-6- ja IL-10- transkriptiot ja proteiinit. IKKα/β:n (p-IKKα/β)/IKKβ:n, IκBα:n, p-p38:n, p-JNK/JNK:n, pAkt/Akt:n ja β-aktiinin fosforylaatio mitattiin läntisellä blottauksella. 3T3-L1-rasvasoluja inkuboitiin 1μg/mL 3E1:llä 3 tunnin ajan (e) ja Raw264.7-makrofageja 100 ng/mL r4-1BB Fc:llä 1 tunnin ajan (f). Densitometrian tulokset on esitetty prosentteina kontrollista. Tiedot ovat kolmen rinnakkain tehdyn riippumattoman kokeen keskiarvo ± SEM. ; ; ; ; (kontrolliin verrattuna).

Ymmärtääksemme molekyylimekanismeja, joilla 4-1BB ja/tai 4-1BBL aktivoivat tulehdussignaalin välittämistä adiposyyteissä ja/tai makrofageissa, tutkimme 4-1BB/4-1BBL-stimulaation vaikutuksia solunsisäisiin signaalimolekyyleihin. 4-1BB:n stimulaatio adiposyyteissä lisäsi p38 MAPK:n ja JNK:n fosforylaatiota sekä NF-κB:n ylävirran molekyylin IKK:n fosforylaatiota ja indusoi IκBα:n hajoamista (kuva 2(e)), kun taas 4-1BBL:n stimulaatio lisäsi Aktin ja p38 MAPK:n sekä JNK:n fosforylaatiota (kuva 2(f)), mutta sillä ei ollut vaikutusta IκBα-proteiinin hajoamiseen (kuva 2(f)) eikä IKK:n fosforylaatioon (tietoja ei ole esitetty). Yhdenmukaisesti aiempien raporttien kanssa , 4-1BBL-signalointi ei ainoastaan aktivoinut p38 MAPK:ta vaan myös indusoi Aktin aktivaatiota makrofageissa, mikä johti lisääntyneeseen tulehdussytokiinien ilmentymiseen.

3.3. Tulehduksellisten sytokiinien vapautuminen kontaktikokkiviljelyjärjestelmässä

Koska 4-1BB/4-1BBL-stimulaatio lisäsi tulehduksellisten sytokiinien vapautumista adiposyyteistä ja/tai makrofageista, tutkimme, onko solujen ja solujen välisellä vuorovaikutuksella pintamolekyylien, oletettavasti 4-1BB/4-1BBL:n, välityksellä merkitystä tulehdusreaktioiden käynnistämisessä ja laukaisussa. Viljelimme ensin 3T3-L1-adiposyyttien ja Raw264.7-makrofagien kokoviljelmiä suorassa kontaktissa ja havaitsimme, että IL-6-, MCP-1- ja TNF-α-tulehdussytokiinien tuotanto korreloi makrofagien lukumäärän kanssa viljelyssä (kuvat 3(a)-3(c)) ja lisääntyi ajan myötä (kuvat 3(d)-3(f)).

3.4. 4-1BB:n ja 4-1BBL:n välisen vuorovaikutuksen häirinnän vaikutus tulehdussytokiinien vapautumiseen kontaktikokkiviljelyjärjestelmässä

Testataksemme, osallistuuko 4-1BB/4-1BBL-välitteinen vuorovaikutus adiposyyttien ja makrofagien välillä tulehdusreaktioon kontaktikokkiviljellyissä 3T3-L1-adiposyytit/Raw264.7-makrofagit-kokkiviljelyssä, estimme vuorovaikutuksen neutraloivan vasta-aineen (TKS-1) avulla. Neutraloiva monoklonaalinen vasta-aine reagoi spesifisesti hiiren 4-1BBL:n kanssa, jolloin 4-1BBL ei voi sitoutua 4-1BB-reseptoriin ja voi keskeyttää 4-1BBL:n ja 4-1BB:n välisen vuorovaikutuksen. Näin ollen sekä 4-1BB-välitteinen signaali rasvasoluissa että 4-1BBL-välitteinen signaali makrofageissa voidaan vaimentaa TKS-1-hoidolla. Havaitsimme, että TKS-1-hoito vähensi merkittävästi IL-6:n, MCP-1:n ja TNF-α:n mRNA-tasoja kontaktikokulturoiduissa rasvasoluissa/makrofageissa (kuva 4(a)). Näiden tulehdussytokiinien ilmentymisen väheneminen vahvistettiin proteiinitasolla (kuva 4(b)). Lisäksi havaitsimme, että 4-1BB:n ja 4-1BBL:n välisen vuorovaikutuksen katkaiseminen vähensi tulehdussytokiinien vapautumista vatsakalvomakrofageista, jotka oli kokulturoitu adiposyyttien kanssa (kuva 4(c)). Tutkiaksemme 4-1BB- ja 4-1BB-signaloinnin suhteellista osuutta tulehdusgeenien ilmentymiseen yhteenkulturoiduissa adiposyyteissä/makrofageissa, erotimme makrofagit adiposyyteistä ja mittasimme tulehduksellisten sytokiinien transkriptien tasot näissä kahdessa solutyypissä (kuva 4(d)). Neutraloiva vasta-aine vähensi merkittävästi IL-6:n, MCP-1:n ja TNF-α:n mRNA-tasojen nousua sekä adiposyyteissä että makrofageissa (kuvat 4(e) ja 4(f)).

4. Pohdinta

Ylipainon aiheuttamalle rasvakudoksen tulehdukselle on ominaista makrofagien rekrytoituminen rasvakudokseen, ja makrofaagit ovat tärkeä tulehdusreaktioiden lähde. Adiposyyttien ja makrofagien välisen solu-solukontaktin katsotaan olevan tärkeä tulehdusreittien laukaisemisessa rasvakudoksessa , vaikka on epäselvää, mitkä molekyylit ovat mukana. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että yhteistimulatorisen reseptorin 4-1BB ja sen ligandin 4-1BBL:n sitoutuminen solu- ja solukontaktin kautta moduloi erilaisia tulehdusreaktioita . Aiemmassa työssä havaitsimme, että 4-1BB:n puutos vähensi rasvatulehdusta vähentämällä makrofagien rekrytointia ja tulehdussytokiinien vapautumista . Näiden löydösten perusteella oletimme, että 4-1BB/4-1BBL-välitteinen solu-solu-vuorovaikutus rasvasolujen ja makrofagien välillä saattaa olla tärkeää lihavuuden aiheuttaman rasvatulehduksen puhkeamisessa ja/tai ylläpitämisessä. Mielenkiintoista oli, että 4-1BB-transkriptiot rasvasoluissa ja 4-1BBL-transkriptiot makrofageissa olivat selvästi säänneltyjä liikalihavuuteen liittyvien tekijöiden (esim. FFA ja LPS) vaikutuksesta, ja niiden ilmentyminen lisääntyi voimakkaasti myös kontaktikokulturoiduissa rasvasoluissa/makrofageissa. Lisäksi näiden molekyylien säätelyyn liittyi lisääntynyt tulehdussytokiinien vapautuminen soluista. Nämä havainnot yhdessä liikalihavassa rasvakudoksessa tapahtuvan ylössäätelyn ja rasvatulehduksen vähenemisen kanssa 4-1BB-puutteellisilla liikalihavilla hiirillä viittaavat siihen, että 4-1BB ja 4-1BBL osallistuvat rasvasolujen/makrofagien aiheuttamien tulehdusreaktioiden syntyyn ja/tai edistämiseen.

Selvittääksemme, onko rasvasolujen 4-1BB tai makrofagien 4-1BBL vastuussa tulehdusreaktioita laukaisevista tulehdussignaaleista, stimuloimme soluja agonisteilla, jotka sitoutuvat spesifisesti joko 4-1BB:hen tai 4-1BBL:hen. Havaitsimme ensimmäistä kertaa, että 4-1BB:n stimulointi rasvasoluissa lisäsi selvästi tulehdussytokiinien MCP-1, TNF-α ja IL-6 vapautumista. Myös 4-1BBL-välitteisen käänteisen signaloinnin stimulointi, jonka tiedetään aktivoivan makrofageja , lisäsi tulehdussytokiinien tasoja. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että 4-1BB-signalointi johtaa MAPK/NF-κB-reitin aktivoitumiseen, joka on TNF-reseptoriin liittyvä tekijä (TRAF)-2-riippuvainen lymfosyyteissä . Rasvasoluissa havaitsimme, että 4-1BB:n stimulaatio aktivoi p38 MAPK:n, JNK:n ja IKK:n ja indusoi IκBα-proteiinin hajoamisen. Toisaalta 4-1BBL:n stimulaatio johti tulehdusta aiheuttavien signaalimolekyylien, kuten Aktin ja p38 MAPK:n, aktivoitumiseen makrofageissa, mikä on yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa . Vielä tärkeämpää on, että havaitsimme, että hoito 4-1BBL:ää neutraloivalla vasta-aineella vähensi tulehdussytokiinien vapautumista kokokulttuureissa sekä mRNA- että proteiinitasolla. Nämä havainnot viittaavat yhdessä siihen, että 4-1BB/4-1BBL-välitteinen vuorovaikutus rasvasolujen ja makrofagien välillä laukaisee kaksisuuntaisen tulehduksellisen signaloinnin ja on voimakas tulehdusreaktioiden aiheuttaja liikalihavassa rasvakudoksessa (kuva 5).

Kuva 5

Skeemaattinen esitys adiposyyttien ja makrofagien välisen 4-1BB/4-1BBL-välitteisen vuorovaikutuksen aikaansaamasta kaksisuuntaisesta signaalinsiirrosta. Tulehdussytokiinien (MCP-1, TNF-α ja IL-6) vapautuminen vastauksena kaksisuuntaiseen signalointiin näyttää osallistuvan rasvatulehdukseen.

Kiinnostavaa on, että 4-1BB/4-1BBL-vuorovaikutuksen katkaiseminen ei täysin tukahduttanut tulehdussytokiinien vapautumista kokokulturoiduista adiposyyteistä ja makrofageista. Tämä saattaa johtua muiden solupintamolekyylien läsnäolosta, jotka osallistuvat solujen ja solujen vuorovaikutukseen ja välittävät tulehdusreaktioita. Adiposyytit ja makrofagit ilmentävätkin pinnallaan monia tulehdusreseptoreita ja ligandeja . Esimerkiksi CD40:n ja herpesviruksen sisääntulovälittäjäaineen (HVEM), jotka ilmentyvät rasvasoluissa, katsotaan olevan makrofagien kontaktiriippuvaisen signaloinnin välittäjiä, ja näiden reseptorien ablaatio vähentää lihavuuden aiheuttamia tulehdusvasteita . Näin ollen on mahdollista, että 4-1BB:n ja 4-1BBL:n lisäksi myös muut reseptorit ja ligandit osallistuvat rasvasolujen ja makrofagien väliseen vuorovaikutukseen, joka johtaa tulehdusvasteiden käynnistymiseen ja ylläpitoon.

Johtopäätöksenä olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että 4-1BB:n ja 4-1BBL:n välittämä kontakti-riippuvainen vuorovaikutus adiposyyttien ja makrofagien välillä, joka synnyttää kaksisuuntaisia signaaleja, on ratkaisevassa roolissa rasvakudoksen tulehdussytokiinien vapautumisessa näistä soluista. 4-1BB ja 4-1BBL yhdessä muiden adiposyyttien ja makrofagien väliseen solu-solu-vuorovaikutukseen osallistuvien molekyylien kanssa voivat olla arvokkaita kohteita liikalihavuuden aiheuttaman rasvatulehduksen ehkäisemiseksi.

Interesseiden ristiriita

Tekijät ilmoittavat, ettei heillä ole eturistiriitoja.

Kiitokset

Tämä työ sai tukea Midcareer-tutkimusohjelmasta kansallisen tutkimussäätiön (National Research Foundation, NRF) apurahalla KOSEF (2009-0079485), jota rahoittaa opetus-, tiede- ja teknologiaministeriö (MEST), ja Korean kansallisen tutkimussäätiön (National Research Foundation, NRF) apurahalla Science Research Center -ohjelmasta (Center for Food & Nutritional Genomics) apurahalla (2012-000000643), joka rahoitetaan MEST:stä.