5-hydroksimetyylisytosiini ja sen mahdolliset roolit kehityksessä ja syövässä

5-hydroksimetyylisytosiinin kaksoisrooli DNA:n vakaana emäksenä ja DNA:n demetyloitumisen välituotteena

Tiedämme nyt, että 5hmC:n pitoisuustaso vaihtelee huomattavasti eri solutyyppien ja kudosten välillä ja on korkeimmillaan aivoissa, erityisesti neuroneissa . Koska 5hmC on 5mC:n hapettumistuote, on selvää, että 5hmC:n muodostuminen 5mC:stä alentaa automaattisesti 5mC:n tasoja missä tahansa nukleotidipaikassa tai jopa koko genomissa. Siksi oli välittömästi ilmeistä, että 5mC:n muuttuminen 5hmC:ksi voisi olla ensimmäinen vaihe DNA:n demetyloitumiseen johtavalla reitillä. Eri koejärjestelmistä on saatu todisteita siitä, että näin voi todellakin olla. Tämän demetyloitumisreitin lopputuloksena on muunnetun emäksen passiivinen tai aktiivinen poistuminen ja/tai metyyliryhmän häviäminen DNA:n sytosiinista (kuva 1). Passiivisessa demetyloitumisreitissä 5hmC:tä ei voi kopioida ylläpitävä DNA-metyylitransferaasi DNMT1, joka on entsyymi, joka levittää jo olemassa olevia metylaatiomalleja ja toimii hemimetyloituneissa CpG-kohdissa . Aktiivinen demetylaatioprosessi, joka käyttää 5hmC:tä välituotteena, on huomattavasti monimutkaisempi. Eräässä raportissa ehdotettiin, että DNA-metyylitransferaasit voivat muuntaa 5hmC:n sytosiiniksi . 5hmC:n deaminoituminen tuottaa 5-hydroksimetyyliurasiilia , jonka voivat poistaa emästen eksisiokorjausentsyymit, kuten tymiini-DNA-glykosylaasi (TDG) ja yksisäikeinen selektiivinen monofunktionaalinen urasiili-DNA-glykosylaasi (SMUG1) . Tällä hetkellä ei kuitenkaan tiedetä, kuinka tehokkaasti tällainen reitti toimii in vivo. 5hmC:n vaiheittainen hapettuminen TET-proteiineilla tuottaa 5-formyylisytosiinia (5fC) ja sitten 5-karboksyylisytosiinia (5caC) . Tämä 5caC, joka on havaittavissa pieninä pitoisuuksina DNA:ssa, voidaan sitten poistaa joko TDG-proteiinin DNA-glykosylaasiaktiivisuuden katalysoimalla emäksen eksisiokorjauksella tai dekarboksylaatiolla. Teoriassa dekarboksylaatioreitin pitäisi olla suotuisa, koska se ei edellytä DNA:n fosfodiesterisidosten rikkoutumista, jota tapahtuu TDG:n käynnistämässä emäksen eksisiokorjauksessa. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole tunnistettu dekarboksylaatiovaiheen entsymaattista aktiivisuutta, vaikka dekarboksylaatiota näyttääkin tapahtuvan.

Monissa kudoksissa kertyy huomattavia määriä 5hmC:tä, paljon enemmän kuin olisi odotettavissa, jos tämä emäs olisi pelkkä ohimenevä välivaihe DNA:n demetylaatioon johtavassa peräkkäisessä hapettumisreitissä. Siksi 5hmC saattaa olla epigeneettinen moduuli, jolla on omat ainutlaatuiset biokemialliset koodausominaisuutensa. Tämä funktio voi olla negatiivinen tai hylkivä, koska metyyliryhmän hapettuminen 5hmC:n valmistuksen aikana estää sellaisten proteiinien sitoutumisen, jotka muuten olisivat vuorovaikutuksessa 5mC:n kanssa. Vaihtoehtoisesti sen tehtävä voi olla positiivinen tai ohjaava, jos on olemassa proteiineja, jotka sitoutuvat erityisesti 5hmC:hen. Tähän mennessä useat eri proteiinit ovat osoittaneet kykenevänsä tunnistamaan 5hmC:n ainakin in vitro, mukaan lukien UHRF1 , MBD3 , MeCP2 ja useat muut proteomiikan avulla tunnistetut proteiinit. Niiden 5hmC:hen sitoutumisen biologinen merkitys ei kuitenkaan ole vielä täysin selvä. Useimmilla näistä proteiineista on myös muita tehtäviä, eivätkä ne siksi ehkä ole ainutlaatuisesti suunniteltu vuorovaikutukseen 5hmC:n kanssa.

5-hydroksimetyylisytosiinin rooli nisäkkäiden kehityksessä ja erilaistumisessa

5hmC:n toiminnallinen rooli nisäkkäiden genomissa on edelleen epäselvä. Nisäkkäiden elinkaaren alussa, munasolujen hedelmöittyessä siittiöillä, suurin osa isän (siittiöistä peräisin olevan) genomin 5mC:stä hapettuu 5hmC:ksi . Tämä hapettumisvaihe, jonka aiemmin ajateltiin heijastavan todellista DNA:n ”demetyloitumista” , on spesifinen isän genomille, kun taas äidin (munasolusta peräisin oleva) genomi pysyy suojattuna Tet-katalysoidulta hapettumiselta. Isän genomin hapettumista katalysoi Tet3, jota koodaa ainoa Tet-geeni, joka ilmentyy merkittävissä määrin munasoluissa ja zygooteissa . Tet3:n geneettinen tyrmäys hiirissä johtaa epäonnistuneeseen paternaalisen genomin hapettumiseen, heikentyneeseen kehitykseen ja perinataaliseen letaliteettiin.

Toinen tärkeä kehitysmuutos liittyy alkion sukusolujen (PGC) globaaliin DNA:n demetyloitumiseen, joka alkaa noin alkion 8,5-9,5. päivän tienoilla ja päättyy lähellä 13,5. päivää. PGC-solujen metylaation poistomekanismit ovat pysyneet suurelta osin epäselvinä ja kiistanalaisina. Pitkään on oletettu, että replikaatiosta riippumaton aktiivinen DNA:n demetyloituminen on keskeinen reitti, joka todennäköisesti osallistuu tähän vaiheeseen . Uudemmat tiedot puoltavat kuitenkin metylaation passiivista häviämistä, joka johtuu metylaation ylläpidon puutteesta DNA:n replikaation aikana . Tämä 5mC:n passiivinen häviäminen saattaa käynnistyä tehokkaasti muuntamalla 5mC 5hmC:ksi . Tet1 ja Tet2 ovat 5mC-oksidaaseja, jotka ilmentyvät eniten PGC:ssä tässä vaiheessa . Tet1- ja Tet2-puutteisten hiirten jälkeläisillä on puutteita DNA:n demetyloitumisessa painettujen geenien kohdalla . Molempien sukupuolten Tet1/2-puutteiset eläimet olivat kuitenkin hedelmällisiä, mutta naaraiden munasarjat olivat pienemmät ja hedelmällisyys heikentynyt. Tet1:n ja Tet2:n poistaminen voi tuottaa elinkelpoisia aikuisia, vaikka suurin osa tällaisista hiiristä kuolee alkionkehityksen aikana tai syntymän aikoihin ja osoittaa erilaisia kehityshäiriöitä . Tiedot viittaavat siihen, että Tet1/2:n aiheuttama 5mC-oksidaatio PGC:ssä ei ole ehdottoman välttämätöntä elinkelpoisten jälkeläisten tuottamiseksi. Tällä hetkellä saatavilla olevista tiedoista, jotka koskevat DNA:n demetyloitumista zygooteissa ja PGC:ssä, puuttuu edelleen 5hmC:n tarkempi analyysi DNA-sekvenssin tasolla, kuten voidaan tehdä esimerkiksi TAB-sekvensoinnilla . Tällaisten tietojen odotetaan selventävän 5hmC:n muodostumisen globaalia tai paikkakohtaista osallisuutta passiivisen (tai aktiivisen) DNA:n demetyloitumisen käynnistymiseen. Aiemmalla viittauksella emästen erkaantumisen korjausprosesseihin sukusolujen uudelleenohjelmoinnissa , joka jo itsessään aiheuttaisi valtavan riskin genomin eheyden säilymiselle, jos se toimisi globaalilla tasolla, voi olla useita muita selityksiä. Erään skenaarion mukaan emäksen eksisiokorjaustoiminnan esiintyminen voitaisiin selittää vaatimuksella torjua Tet-oksidaasiaktiivisuuden katalysoimat väärät, ei-kohdennetut hapettumisreaktiot metyloitujen CpG-kohtien guaniinien suhteen (guaniini on DNA:n emäs, joka on herkin hapettumiselle). Toisessa tilanteessa Tet-proteiinit voivat hapettaa 5hmC:tä edelleen, ehkä tietyissä sekvensseissä, muodostaen 5caC:tä, joka sitten poistetaan TDG:n käynnistämän emäksen eksisiokorjauksen avulla.

Koska 5hmC:tä on eniten aivokudoksessa, on tullut ensisijaisen tärkeäksi ymmärtää tämän modifioidun emäksen toimintaa aivoissa. Esimerkiksi ihmisen aivokuoren DNA:ssa 5hmC:n määrä on noin 1 % kaikista sytosiinistä tai 20-25 % kaikista 5mC-emäksistä . Tämä vastaa noin 6 000 000 5hmC-emästä haploidista genomia kohti. Nämä tasot viittaavat selvästi siihen, että 5hmC:llä on tärkeä toiminnallinen rooli nisäkkäiden aivoissa. Tähän mennessä raportoidut tutkimukset ovat osoittaneet, että aivokudoksissa 5hmC:tä on hyvin runsaasti geenialueilla, joko promoottoreissa tai vielä enemmän intragenisillä alueilla, niin sanotuissa geenirungoissa . On ajateltavissa, että 5hmC:n muodostuminen promoottoreihin, CpG-saarekkeisiin tai CpG-saarekkeiden rannoille (reunoille) toimii analogisesti korjausprosessin kanssa, joka hapettaa ja lopulta poistaa näiltä alueilta epäsopivan 5mC:n . 5hmC:n kertyminen promoottoreihin tai geenirunkoihin korreloi usein positiivisesti geenin aktiivisuuden kanssa. Tällä hetkellä ei tiedetä, miten geenirunkoon liittyvä 5hmC lisää transkriptien määrää. Yksi mahdollisuus on, että 5mC:n hapettuminen vapauttaa repressiivisen vaikutuksen transkriptioon, ehkä torjumalla vääränlaista intragenista anti-sense-transkriptiota. Muihin selityksiin voi kuulua se, että 5hmC:llä on DNA:n rakennetta horjuttava vaikutus, joka mahdollisesti suosii kaksoiskierteen avautumista transkriptiokoneiston toimesta.

5hmC, vaikka useat metyyli-CpG:tä sitovat proteiinit, kuten MBD1, MBD2 ja MBD4 , eivät tunnista 5hmC:tä, kykenee sitomaan MeCP2:ta, metyyli-CpG:tä sitovaa proteiinia, jota esiintyy runsaasti aivoissa ja joka on mutaantunut Rettin oireyhtymässä esiintyvässä neurologisessa häiriössä. Aikaisemmissa tutkimuksissa, joissa käytettiin MeCP2:n metyyli-CpG:tä sitovaa domeenia (MBD) täyspitkän proteiinin sijaan, ei todettu MeCP2:n sitoutuvan 5hmC:hen . Näiden ristiriitojen syyt eivät ole selvillä. MeCP2:n ja 5hmC:n välinen yhteys aivoissa on erityisen kiinnostava, koska 5hmC:n pitoisuudet ovat korkeimmat aivoissa ja MeCP2 on aivoissa runsaasti esiintyvä proteiini, jonka pitoisuudet vastaavat histoni H1:n pitoisuuksia. Näistä syistä voidaan olettaa, että MeCP2:n 5hmC-sitoutumisella on aivoissa pikemminkin genominlaajuinen kuin sekvenssispesifinen mekanistinen rooli.

Kuten äskettäin on osoitettu, 5hmC:n muodostuminen on kriittistä aivojen kehityksen kannalta. Emästä on runsaasti kehittyvissä neuroneissa, joissa sen määrä kasvaa suhteessa neuraalisiin kantasoluihin ja joissa se lokalisoituu spesifisesti hermosolujen erilaistumisen kannalta tärkeiden geenien geenirunkoihin . Tet3 ilmentyy voimakkaimmin hiiren kehittyvässä aivokuoressa, jota seuraa Tet2, ja Tet1:n tasot ovat hyvin alhaiset tässä kudoksessa. Tet2:n, Tet3:n ja 5hmC:n pitoisuuksien lisääntyminen erilaistuvissa neuroneissa käy yksiin Polycombin H3K27-metyylitransferaasi Ezh2:n vähenemisen ja H3K27me3:n häviämisen kanssa kriittisissä geeneissä. Tet2- ja Tet3-tasojen vähentäminen tai Ezh2-ekspression lisääminen johtaa epätäydelliseen tai estyneeseen neuronien erilaistumiseen . Siten 5hmC:n muodostuminen edistää hermosolujen erilaistumista moduloimalla tämän tärkeän kehityssiirtymän kannalta kriittisimpien geenien ilmentymistä.

5-hydroksimetyylisytosiinin menetys syövässä

Syövän 5hmC-tasot ovat voimakkaasti alentuneet suhteessa vastaavaan kasvainta ympäröivään normaaliin kudokseen . Käyttämällä nestekromatografia-massaspektrometriaa, anti-5hmC-vasta-aineisiin perustuvia immuno-dot blotteja ja immunohistokemiaa osoitimme kasvaimeen liittyvän 5hmC:n menetyksen keuhko-, aivo-, rinta-, maksa-, munuais-, eturauhas-, suolisto-, kohtu- ja melanoomasyövissä . Muut tutkijat vahvistivat tämän havainnon osoittamalla 5hmC:n häviämistä erityyppisissä kiinteissä kasvaimissa . Lisäksi TET2:n palauttamisen on osoitettu palauttavan 5hmC-tasot ja vähentävän melanoomasolujen metastaattista potentiaalia . Kun kudosleikkeet värjättiin samanaikaisesti vasta-aineilla 5hmC:tä ja Ki67-antigeenia vastaan, joka on merkkiaine, jota esiintyy vain proliferoivissa soluissa, havaittiin, että 5hmC:tä ja Ki67:ää ei esiinny lähes koskaan samanaikaisesti yhdessä solussa . Kliinisen diagnostiikan tasolla yhdistetty immunohistokemiallinen analyysi 5hmC:n häviämisestä ja Ki67-positiivisten solujen esiintymisestä voitaisiin kehittää syöpädiagnoosin biomarkkeriksi. 5hmC:n puuttuminen tai voimakas väheneminen kasvaimissa viittaa siihen, että proliferoivat solut menettävät 5hmC:tä. Useimmissa tapauksissa suurin osa kasvainmassasta on tyhjentynyt 5hmC:stä, vaikka Ki67-positiivisia soluja on harvoin, mikä viittaa siihen, että näillä kasvainsoluilla on ollut aiemmin proliferaatiota, joka on johtanut 5hmC:n häviämiseen, jota ei sitten ole palautettu. Replikaatiosta riippuvainen 5hmC:n häviäminen kuvastaa tilannetta, joka muistuttaa tilannetta, joka vallitsee istutusta edeltävissä alkioissa, joissa 5hmC:n alkuperäistä muodostumista isän DNA:ssa seuraa replikaatiosta riippuvainen tämän merkin häviäminen tai laimeneminen . Samoin globaali 5hmC-pitoisuus vähenee nopeasti, kun normaalista kudoksesta peräisin olevat solut sopeutuvat soluviljelyyn . Yksinkertaisin selitys on, että 5mC:n hapettuminen tuottaa DNA:han puolihydroksimetyloituneen CpG-kohdan, jota DNMT1 ei tunnista DNA:n replikaation aikana. Tällainen selitys on yhdenmukainen in vitro -tutkimusten kanssa, jotka osoittavat, että DNMT1 ei pysty toimimaan CpG-kohteissa, jotka sisältävät 5hmC:tä . Myös muut selitykset 5hmC:n vähenemiselle syövässä ovat kuitenkin mahdollisia. TET-proteiinien tasot voivat olla alhaisemmat kasvainkudoksessa kuin vastaavassa normaalissa kudoksessa. Vaikka emme havainneet johdonmukaisia eroja RNA-tasolla TET1:n, TET2:n tai TET3:n osalta keuhko- ja aivokasvaimissa suhteessa normaaliin kudokseen , muut ovat raportoineet alhaisemmista TET-geenien ilmentymistasoista syövässä . Lisämahdollisuutena on, että syöpäsoluissa on heikentyneitä aineenvaihduntareittejä, jotka osallistuvat TET-aktiivisuuden kofaktorin, 2-oksoglutaraatin, tuotantoon (ks. jäljempänä).

TET2:n mutaatio ihmisen syövässä

TET1 kuuluu proteiiniperheeseen, jolle on ominaista, että se edesauttaa 5mC:n muuttumista 5hmC:ksi nisäkkäiden DNA:ssa . TET-perheeseen kuuluu kolme tunnistettua perheenjäsentä: TET1, TET2 ja TET3. TET1 sijaitsee ihmisen kromosomissa 10q21.3, kun taas TET2 sijaitsee kromosomissa 4q24 ja TET3 kromosomissa 2p13.1 . TET1-entsyymi koostuu sinkkisormi-CXXC-DNA:ta sitovasta domeenista, kysteiinirikkaasta alueesta ja 2-oksoglutaraatti- ja rauta(II)-riippuvaisesta dioksygenaasi-domeenista (2OGFeDO) . TET3 sisältää myös N-terminaalisen CXXC-domeenin . TET2-geeni koki kuitenkin evoluution aikana kromosomaalisen geeni-inversion, jolloin sen CXXC-domeeni erotettiin katalyyttisestä domeenista ja luotiin uusi CXXC-domeenigeeni nimeltä IDAX/CXXC4, joka koodaa TET2:n negatiivista säätelijää . EST-profiilien ja ilmentymismatriisien perusteella TET1:n ilmentyminen on suurinta embryogeneesin aikana, eikä sillä ole merkittävää ilmentymistä aikuiskudoksissa. TET2 ilmentyy enimmäkseen hematopoieettisissa soluissa, ja TET3 näyttää ilmentyvän kaikkialla aikuisen ihmisen kudoksissa.

Leukemia on sairaus, jossa normaalin hematopoieettisten kantasolujen erilaistumisen aikana luuytimen hematopoieettisten esiasteiden klonaalinen laajeneminen häiriintyy tietyssä erilaistumisvaiheessa aiheuttaen epätasapainon erilaistumisen ja itseuudistumisen välillä. Hematopoieettisten esisolujen epätarkoituksenmukainen laajeneminen johtuu ensisijaisesti solujen kypsymisen estymisestä. Myelodysplastiselle oireyhtymälle (MDS) on ominaista sytopenia (alhainen verisolujen määrä), tehoton hematopoieesi jossakin solulinjassa ja lisääntynyt riski muuntua akuutiksi myelooiseksi leukemiaksi (AML) . AML:ssä epänormaalien valkosolujen nopea kasvu luuytimessä johtaa siihen, että muiden solulinjojen eri solujen tuotanto estyy.

TET2:n on todettu olevan mutaatioita myeloproliferatiivisia kasvaimia (MPN), MDS:ää, AML:ää ja kroonista myelomonosyyttistä leukemiaa (CMML) sairastavilla potilailla, ja se on yleisimmin mutaatioita aiheuttava geeni MDS:ssä. TET1:n tai TET3:n mutaatioita ei havaita MDS:ssä eikä TET2-mutaatio korreloi useiden muiden tunnettujen yleisten mutaatioiden kanssa . Mielenkiintoista on, että isositraattidehydrogenaasi 1/2:n (IDH1/2) mutaatioita esiintyy harvoin yhdessä TET2-mutaatioiden kanssa, mutta niillä on samanlaisia vaikutuksia kuin TET2-mutaatioilla hematopoieettisiin kantasoluihin (HSC) . Vaikka TET2-mutaatioihin liittyy AML:n kokonaiselossaoloaikojen lyheneminen verrattuna potilaisiin, joilla on villityyppinen TET2, TET2-mutaatiot MDS- ja MPN-potilailla edistävät AML:n etenemistä . TET2-geeni koostuu yhteensä yhdestätoista eksonista, jotka kääntyvät 2002 aminohappoa sisältäväksi proteiinituotteeksi . Myelooisissa syövissä TET2-mutaatioita on havaittu yleisimmin eksoneissa 3a ja 10, jotka ovat pisimmät eksonit . TET2-mutaatiot kohdistuvat MPN:n TET2-mutaatioihin sekä monipotentteihin että sitoutuneisiin progenitorisoluihin hematopoieettisessa linjassa, mikä viittaa siihen, että TET2:lla on tärkeä rooli myelopoieesissa . TET2:n deleetioita ja heterotsygotian menetystä tai yhden vanhemman disomiaa havaittiin (9 %:lla) MDS/AML-potilaista, joilla oli mutatoitunut TET2, jolloin on todennäköistä, että villityyppinen alleeli häviää rekombinaation aikana, jolloin mutatoitunut TET2 voi edistää toimintakadon fenotyyppiä. Kosmider ym. havaitsivat, että 50 prosentilla potilaista, joilla oli mutatoitunut TET2, oli geenivirheitä, jotka kohdistuivat molempiin TET2-kopioihin. TET2:n mutaatiot näyttävät johtavan toiminnan menetykseen, mikä viittaa siihen, että sillä saattaa olla kasvainsuppressiivinen rooli.

Mutantti TET2:n toimintakyvyttömyyden taustalla olevien vaikutusten ja sen roolin ymmärtäminen myelooisissa pahanlaatuisissa kasvaimissa on tämänhetkinen tutkimuskohde. Useat laboratoriot ovat luoneet ehdollisia Tet2:n knockout-hiirimalleja, joissa kriittiset Tet2:n eksonit on kohdennettu. Moran-Crusio ym. havaitsivat, että Tet 2-/- hiirille kehittyi pernomegalia 20 viikon iässä, ja ne osoittivat samankaltaisia fenotyyppejä kuin ne, joita havaittiin ihmisen CMML-potilailla, joilla oli mutantti TET2. Eri hiirimalleista saadut tiedot johtivat samanlaisiin havaintoihin. Tet2:n poistaminen ei ole alkiotappava. Tärkeä havainto, jonka Moran-Crusio ym. ja Ko ym. tekivät, on se, että Tet2-/-hiiristä peräisin olevilla hematopoieettisilla kantasoluilla on lisääntynyt kyky uudistaa hematopoieettista osastoa in vivo kilpailullisissa rekonstituutiotesteissä, joissa kilpailevat Tet2+/+-soluista peräisin olevat HSC:t. Tet2-/-hiirten eri elinten analyysi osoitti, että Tet2:n menetystä ei kompensoi Tet1- tai Tet3-ekspression lisääntyminen . 5hmC-tasot vähenivät merkittävästi Tet2-/-hiirten luuytimessä ja pernassa . Tet2-/-hiirissä HSC:n määrä lisääntyy ja myelooisten esiasteiden määrä lisääntyy hieman, mikä vinouttaa hematopoieesia kohti monosyytti-/makrofagisolujen kohtaloa . On ehdotettu, että aktiivinen Tet2 säätelisi normaalia hematopoieesia varmistaakseen HSC:iden oikean sukulinjajakauman ja hallitun erilaistumisen. Erityisen kiinnostavaa on TET2-mutaatioiden vaikutus 5mC:n tasoihin ja malleihin genomissa. Nykyiset tiedot ovat kuitenkin kaikkea muuta kuin selkeitä. Eräässä raportissa todettiin, että AML:n TET2-mutaatio liittyy DNA:n hypermetyloitumisfenotyyppiin, mutta toiset tiedot viittaavat siihen, että TET2-mutaatioita sairastavien potilaiden luuydinnäytteissä on alhaiset 5hmC-tasot ja DNA:n hypometylaatio. Tilannetta mutkistaa se, että hematopoieettisille pahanlaatuisille kasvaimille on usein ominaista mutaatiot useissa epigeneettisissä modifioijissa, kuten EZH2:ssa, IDH1:ssä, IDH1:ssä, IDH2:ssa, MLL:ssä, DNMT3A:ssa ja ASXL1:ssä, mikä mahdollisesti hämärtää suoraviivaisia yhteyksiä . Esimerkiksi eräässä tutkimuksessa kahdeksalla yhdestätoista potilaasta, joilla oli DNMT3A-mutaatioita (73 %) T-solulymfoomassa, oli myös TET2-mutaatioita .

Mutaatiot kofaktorireiteissä

5mC-oksidaasit ovat 2-oksoglutaraatti-riippuvaisia entsyymejä (kuva 2). Tätä kofaktoria tuottaa trikarboksyylihappokierrossa isositraatista IDH-entsyymi. Mielenkiintoista on, että useat ihmisen kasvaintyypit sisältävät mutaatioita IDH1-geenissä. IDH1-mutaatioita esiintyy erityisen usein II ja III asteen glioomissa, joissa niitä esiintyy jopa 70 prosentilla potilaista. IDH1- ja IDH2-mutaatioita esiintyy myös myelooisissa leukemioissa ja muutamissa muissa pahanlaatuisissa kasvaimissa, mutta niiden esiintymistiheys on pienempi. Nämä IDH1-mutaatiot eivät ole hajallaan koko geenissä, vaan ne esiintyvät lähes yksinomaan aminohappoasemassa 132. Tämä havainto viittaa siihen, että kyseisellä IDH1-mutanttiproteiinilla on toiminnan vahvistumisominaisuus. Yllättävä havainto oli, että IDH1:n kodonin 132 arginiini-histidiinimutaatio tuottaa reaktiotuotteena 2-oksoglutaraatin sijasta oncometaboliitti 2-hydroksiglutaraattia (2HG) . Näyttää siltä, että tämän mutantin suorittama isositraattihapetusreaktio on epätäydellinen ja tuottaa vain 2HG:tä. Lisäksi 2HG on monien, ellei kaikkien, 2-oksoglutaraatista riippuvaisten entsymaattisten toimintojen kilpaileva estäjä. TET-proteiinit edustavat yhtä tällaisten entsyymien luokkaa, ja osoitettiin, että 2HG on TET1:n ja TET2:n inhibiittori.

Yksi mielenkiintoinen korrelaatti sille, että IDH1-mutaatio on mutaationa esiintyvässä gliooman kasvaimessa, on se, että IDH1-mutanttien kasvaimiin liittyy melkeinpä aina runsaasti koko genomin laajuisia DNA:n metylaatiomuutoksia, jotka näkyvät laajalle levinneenä CpGsaarekkeisiin kohdistuvana hypermetylaationa . Tätä fenotyyppiä on kutsuttu CpG-saarekkeiden metylaattorifenotyypiksi (tai CIMP) . On houkuttelevaa olettaa, että IDH1-mutanttien glioomissa esiintyvä CIMP liittyy 5hmC:n tuotannon epäonnistumiseen näissä kasvaimissa, koska 2HG heikentää TET-aktiivisuutta. Itse asiassa IDH1-mutaatiokonstruktion kokeellinen tuominen ihmisen astrosyytteihin johti CIMP:n kaltaisen fenotyypin syntymiseen . Lisäksi ehdollisissa knock-in-hiirissä, joissa yleisin Idh1-mutaatio R132H lisättiin endogeeniseen Idh1-paikannukseen ja ekspressoitiin hematopoieettisissa soluissa, havaittiin DNA:n hypermetyloitumista . Verrattaessa suoraan DNA:n 5hmC-tasoja IDH1-mutaatioiden ja IDH1-villityyppisten glioomien välillä emme kuitenkaan havainneet merkittäviä eroja näiden kahden aivokasvainluokan välillä . Siksi on pidettävä mielessä, että mutantti IDH1 ja sen aineenvaihduntatuote 2HG eivät vaikuta ainoastaan TET-entsyymeihin vaan estävät myös monia 2-oksoglutaraatista riippuvaisia lysiinidemetylaaseja ja muita 2-oksoglutaraatista riippuvaisia entsyymejä. Näiden lysiinidemetylaasien toimintahäiriöllä voi olla toissijainen vaikutus DNA:n metylaatiomalleihin CpG-saarekkeilla.