Asetyylikoliini syntetisoidaan asetyylikoentsyymi A:sta ja koliinista koliiniasetyylitransferaasientsyymillä. Hermostossa tämän entsyymin uskotaan olevan pääasiassa hermopäätteen sytoplasmassa. Koentsyymi A syntetisoidaan mitokondrioissa, ja se pääsee koliiniasetyylitransferaasin käyttöön kuljetuksen jälkeen mitokondrioiden kalvon läpi sytoplasmaan. Maksassa tapahtuvan synteesin lisäksi asetyylikoliinin tuotannossa käytettävää koliinia saadaan ravinnosta. Kapillaarien endoteelisoluissa on kuljetinjärjestelmä, joka vastaa koliinin kuljettamisesta vapaana ja fosfolipidimuodossaan aivoihin. Myös koliinia sisältävien fosfolipidien hydrolyysi voi vapauttaa koliinia, jota käytetään asetyylikoliinin synteesissä. Koska koliiniasetyylitransferaasi ei kyllästy asetyylikoentsyymi A:n ja koliinin pitoisuuksiin, joita arvioidaan olevan hermopäätteessä, näyttää siltä, että asetyylikoliinisynteesin nopeus riippuu esiasteiden saatavuudesta. Entsyymin aktiivisuutta säätelee myös tuotteen estäminen; sitoutumalla koliiniasetyltransferaasin allosteriseen kohtaan asetyylikoliini estää sen aktiivisuutta. Lisäksi massatoiminta ja neuronien aktiivisuus vaikuttavat asetyylikoliinin muodostumisnopeuteen. Entsyymiaktiivisuuden lyhytaikainen säätely tapahtuu osittain proteiinikinaasien indusoimalla fosforylaatiolla. Entsyymille ei ole olemassa hyvin spesifisiä ja voimakkaita estäjiä, ja on huomattava, että tämän askeleen farmakologinen estäminen (esim. naftyylivinyylipyridiinillä) asetyylikoliinin elinkaaressa aiheuttaa vähemmän syvällisen vaikutuksen lähettimeen kuin koliinin kuljetuksen estäminen.
Spesifinen matala-affiniteettinen asetyylikoliinin kuljettaja vastaa lähettimen ottamisesta sytoplasmasta vesikkeleihin. Koliiniasetyylitransferaasin ja vesikulaarisen asetyylikoliinin kuljettajan geenit ovat järjestäytyneet samaan geenilokukseen, ja näiden kahden geenin transkriptio on tyypillisesti yhteissäännelty. (±)-vesamisoli on tämän kuljettajan selektiivinen estäjä, ja L-(-)-vesamisoli on voimakkaampi kuin D-(+)-vesamisoli. Kun asetyylikoliini on pakattu vesikkeleihin, se vapautuu ärsykkeen vaikutuksesta eksosytoosin avulla. Useat voimakkaat toksiinit vaikuttavat asetyylikoliinin vapautumiseen, erityisesti botuliinitoksiini, joka estää sen vapautumisen.
Neuronaalinen asetyylikoliiniesteraasi inaktivoi hyvin nopeasti suurimman osan aivoissa vapautuvasta asetyylikoliinista, vaikkakin gliasolujen sisältämä butyylikoliiniesteraasi saattaa hydrolysoida pienen osan asetyylikoliinista synapsissa. Periferiassa asetyylikoliiniesteraasia esiintyy koliinergistä innervaatiota saavissa lihaksissa, kun taas butyylikoliiniesteraasi on laajemmin levinnyt. Tunnetaan useita palautuvia (esim. fysostigmiini, BW284C51) ja palautumattomia (esim. iso-OMPA) asetyylikoliiniesteraasin estäjiä, jotka pidentävät asetyylikoliinin synaptisia vaikutuksia. Toisen sukupolven palautuvia antikolinesteraaseja, kuten donepetsiiliä, rivastigmiinia (ENA 713), eptastigmiinia ja galantamiinia (galantamiinia), käytetään Alzheimerin taudin hoidossa. Joitakin toisen sukupolven kolinesteraaseja on poistettu kliinisestä käytöstä sivuvaikutusten vuoksi, joita ei voida hyväksyä (esim. takriini, metrifonaatti). Irreversiibeleitä asetyylikoliiniesteraasin estäjiä käytetään hyönteismyrkkyinä ja kemiallisina taisteluaineina. Asetyylikoliiniesteraasi vapauttaa asetyylikoliinista koliinia, jota korkeaaffiniteettinen kuljettaja kuljettaa sen takaisin kolinergisiin päätelaitteisiin ja käyttää sitä uudelleen lähettimen synteesissä. Hemikolinium-3 estää voimakkaasti ja palautuvasti koliinin kuljetusta, mikä johtaa asetyylikoliinin muodostumisen voimakkaaseen vähenemiseen. Toisin kuin hemikolinium-3, A-4 (HC-3:n bis-4-metyylipiperidiinianalogi) on aktiivinen perifeerisen annostelun jälkeen. Koliinin typpisinappianalogit ovat voimakkaita irreversiibeleitä korkean affiniteetin koliininoton estäjiä.