Kokoonpanon periaatteet in vitro -tutkimusten perusteella
Funktionaaliset bakteerien 30S- ja 50S-ribosomaaliset alayksiköt voidaan rekonstruoida in vitro rRNA:sta ja kustakin ribosomaalisesta proteiinista. Yksityiskohtaiset tutkimukset ribosomin in vitro -kokoonpanon taustalla olevista biokemiallisista ja biofysikaalisista periaatteista ovat tarjonneet hyödyllisiä paradigmoja, jotka ohjaavat ribosomin biogeneesin tutkimuksia in vivo.
Yksi ensimmäisistä näistä kokeista paljastuneista periaatteista on se, että r-proteiinien kokoonpano ribosomaalisiksi alayksiköiksi tapahtuu hierarkkisesti. Bakteerien 30S-ribosomaalisten alayksiköiden rekonstituutiotutkimuksissa määriteltiin ”kokoonpanokartta” kunkin r-proteiinin ja rRNA:n liittymisjärjestykselle. Sitoutumishierarkiassa olevan järjestyksen perusteella r-proteiinit luokitellaan primaariproteiineiksi (sitoutuvat suoraan rRNA:han), sekundaariproteiineiksi (sitoutuminen on riippuvainen primaariproteiineista) tai tertiääriproteiineiksi (sitoutuminen on riippuvainen sekundaariproteiineista). Vaikka tällainen riippuvuuskartta on osoittautunut erittäin hyödylliseksi lähtökohdaksi, se ei anna mitään tietoa proteiinien sitoutumisen kinetiikasta. Pikemminkin kokoamisreitti saattaa suurelta osin heijastaa järjestystä, jossa kukin r-proteiini on vakaimmin sidoksissa rRNA:han. Kokoonpanokartassa ei myöskään oteta huomioon 16S rRNA:n taittumisreittiä, joka on riippumaton r-proteiineista, eikä rRNA:n esiasteiden nukleolyyttisen prosessoinnin merkitystä ribosomin kokoonpanossa, jota tapahtuu in vivo. Viime aikoina näitä 30S-alayksikön kokoonpanon näkökohtia on tutkittu yksityiskohtaisemmin käyttämällä tekniikoita, kuten RNA:n konformaation kemiallista ja hydroksyyliradikaalien luotainmääritystä rRNP:n konformaation muutosten määrittämiseksi ajan funktiona ja pulssi-chase/massaspektrometriaa (PC/MS) r-proteiinien rRNA:han sitoutumisen kinetiikan määrittämiseksi.
Mahdollinen selitys primaarisesti sitoutuvien r-proteiinien havainnolle kokoonpanokartassa on se, että niiden sitoutumiskohdat syntyvät ainakin osittain 16S rRNA:n omaksumasta konformaatiosta, joka on riippumaton r-proteiineista. Tämän ajatuksen ja sen näkemyksen kanssa, jonka mukaan ribosomit ovat kehittyneet RNA-katalysaattorista, on nimittäin osoitettu, että 16S rRNA:n 5′-domaani voi taittua ja muodostaa tertiäärisiä kontakteja ilman kaikkia r-proteiineja. Tämä tertiäärirakenne ei oletettavasti ole täysin vakaa proteiinikontaktien puuttuessa, ja näin ollen sitä vakauttaa todennäköisesti r-proteiinien sitoutuminen paikkoihin, jotka syntyvät rRNA:n taittumisen aikana omaksumista ohimenevistä konformaatioista. Näin ollen toinen periaate viittaa siihen, että rRNA:n taittuminen muodostaa perustan r-proteiinien sitoutumiselle ribosomin kokoamisen aikana.
Kolmas periaate, joka on noussut esiin bakteerien ribosomeilla tehdyissä in vitro -tutkimuksissa, on se, että r-proteiinien sitoutuminen rRNA:han vahvistuu ribosomin kokoamisen edetessä. Monet r-proteiinit ottavat yhteyttä useisiin rRNA:n nukleotideihin. Aikaresolvoitu hydroksyyliradikaalijalanjälki on paljastanut, että jotkin näistä nukleotideista suojataan ennen toisia, mikä viittaa siihen, että ribosomin biogeneesin edetessä r-proteiinit muodostavat enemmän kontakteja rRNA:n kanssa ja integroituvat siten vakiintuneemmin ribosomeihin.
Aluksi muutamien kontaktien muodostuminen r-proteiinien ja rRNA:n välille mahdollisesti vakauttaa tiettyjä RNA:n konformaatioita ja saa aikaan muutoksia rRNA:n konformaatiossa siten, että se tarjoaa sitoutumispaikkoja uusille (sekundaarisille tai tertiäärisille) r-proteiineille. Näin ollen r-proteiinien sitoutuminen vahvistaa RNA:n taittovoittoja ja antaa kokoonpanoprosessille suuntautuneisuutta. Tämä viittaa malliin, jossa kokoonpano etenee RNA:n konformaatiomuutosten ja proteiinien sitoutumisen vuorottelevan sarjan kautta, jotka peräkkäin vakauttavat lopullisen RNA:n rakenteen. Kineettiset tiedot ovat paljastaneet, että kypsien 30S-alayksiköiden kokoaminen tapahtuu useiden rinnakkaisten RNA:n taittumisreittien kautta, jotka kaikki yhtyvät lopputuotteeseen. Tämä on johtanut käsitteeseen, jonka mukaan ribosomaalisten alayksiköiden kokoaminen ei tapahdu vain yhtä ainoaa polkua pitkin, vaan kokoamismaisema.
Viimeiseksi in vitro -tutkimukset ovat paljastaneet, että ribosomien kokoaminen tapahtuu 5′-3′-suunnassa. PC/MS ja rRNA:n sekundaarirakenteen kemiallinen luotaus ovat osoittaneet, että r-proteiinin sitoutuminen rRNA:n 5′-domainiin voidaan havaita ennen kuin proteiinikontaktit muodostuvat rRNA:n 3′-domainin kanssa. Sitä vastoin hydroksyyliradikaalien jalanjälkimääritykset osoittivat nukleotidisuojauksen alkuräjähdyksen koko 16S-rRNA:n pituudelta, mikä osoittaa, että RNA:n taittuminen tapahtuu monista eri kohdista, jotka ovat levinneet eri puolille RNA:ta, ja viittaa siten siihen, että kokoonpanossa ei ole 5′-3′-suuntaisuutta. Nämä ristiriitaiset havainnot voidaan sovittaa yhteen ottamalla huomioon eri koejärjestelyjen luonne. PC/MS mittaa proteiinin sitoutumisen kinetiikkaa rRNA:han, ja näin ollen vain vakaat r-proteiini-rRNA-vuorovaikutukset voidaan havaita, koska r-proteiinit, jotka sitoutuvat heikosti pulssin aikana, voidaan pestä pois ajojahdin aikana. Footprinting-määrityksillä sen sijaan voidaan havaita sekä heikosti vuorovaikuttavien että vakaasti sitoutuneiden r-proteiinien aiheuttama nukleotidisuojaus. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että vaikka ribosomin kokoaminen voi tapahtua koko rRNA:n pituudelta, r-proteiinien lopullinen tiivis assosiaatio rRNA:n kanssa tapahtuu 5′-3′-suunnassa.
On tärkeää pohtia, miten nämä in vitro -kokeet saattavat heijastaa tai olla heijastamatta kokoamista in vivo. Esimerkiksi kun ribosomin kokoaminen tapahtuu in vivo, se kytkeytyy rRNA:n transkriptioon, mikä oletettavasti vaikuttaa myös r-proteiinien assosioitumisen havaittuun 5′:sta 3′:een suuntaisuuteen. rRNA on saattanut kehittyä niin, että se taittuu 5′:sta 3′:een syntetisoidessaan ja sisällyttää r-proteiinit näin, jolloin kokoaminen kytkeytyy rRNA:n transkriptioon. Lisäksi vaatimus lämmitysvaiheesta ribosomaalisten alayksiköiden rekonstruoinnin aikana in vitro ja useiden sellaisten bakteerimutaatioiden tunnistaminen, jotka ovat viallisia ribosomien tuotannossa, viittaavat siihen, että ribosomien biogeneesin aikana in vivo tarvitaan trans-aktiivisia tekijöitä.