Biosynthesis of trans-4-hydroksiproliinin synteesi Corynebacterium glutamicum- ja Escherichia coli -bakteerien rekombinanttikannoilla

Trans-Hyp:tä tuottavien rekombinanttikantojen rakentaminen

Tietokannassa on useita geenejä, joita spekuloidaan L-proliinin 4-hydroksylaasigeeniksi, mukaan lukien geenit Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 ja Dactylosporangium. sp. PCR:n avulla kloonasimme ja saimme P. stutzerin ja B. bronchiseptica RB50:n P4H:n oletetut geenit, jotka nimettiin nimillä p4hP ja p4hB. Ne ligatoitiin vastaaviin plasmideihin digestion jälkeen ja muunnettiin vastaavasti C. glutamicumiin ja E. coliin. P4hP:n pituus oli 918 bps ja p4hB:n 924 bps. Nämä sekvenssit olivat 100-prosenttisesti identtisiä NCBI:ssä ilmoitettujen geenien kanssa. Dactylosporangium sp. -organismin trans-P4H-geeni (p4hD) oli ilmentynyt onnistuneesti E. coli -bakteerissa, ja se voi muuntaa L-proliinia hyvillä entsymaattisilla ominaisuuksilla. P4hD:n pituus oli 816 bps, joka koodaa 272 aminohappoa sisältävää polypeptidiä, jonka molekyylipaino on 29 715 daltonia . Tässä tutkimuksessa p4hD:hen tehtiin joitakin muutoksia ydinperustoihin. Alkuperäinen p4hD:n geenisekvenssi analysoitiin (http://www.kazusa.or.jp/codon/), ja tulokset osoittivat, että oli joitakin harvinaisia koodoneja sekä C. glutamicumille että E. colille. On raportoitu, että harvinaiset koodonit liittyvät vahvasti proteiinien vähäiseen ilmentymiseen. Heterologisen proteiinin ilmentämiseen tarkoitetun koodonin optimoinnin on usein osoitettu lisäävän proteiinin ilmentymistä huomattavasti . Näin ollen p4hD-geenin harvinaiset koodonit korvattiin C. glutamicumissa usein käytetyillä koodoneilla, ja GC-pitoisuus säädettiin 73 prosentista 61 prosenttiin synonyymikonversiolla, joka oli lähellä C. glutamicumin vastaavaa. Muunnettu p4hD-geeni syntetisoitiin edellä mainittujen muutosten mukaisesti (lisätiedosto 1).

P4H:n ilmentyminen on yksi tärkeistä näkökohdista trans-Hypin biosynteettisen reitin rakentamisessa. Kuvassa 2 esitetään rekombinantti-C. glutamicumissa ja E. colissa ekspressoitujen trans-P4H:iden SDS-PAGE. Kaikki rekombinantti trans-P4H:t ilmentyivät liukoisena proteiinina ilman inkluusiokappaleita. Oli ilmeistä, että E. coli -organismin rekombinantteja trans-P4H:ita ilmentyi paljon enemmän kuin C. glutamicum -organismin trans-P4H:ita (kuva 2). Vieraiden proteiinien ilmentymiseen vaikuttavat monet tekijät, kuten promoottorit, isäntä-vektori-järjestelmä ja viljelyolosuhteet jne. Koska kyseessä oli ensimmäinen trans-P4H:n ilmentäminen C. glutamicumissa, tulevassa työssämme harkitaan kattavampia tutkimuksia, kuten promoottorin valintaa ja viljelyolosuhteiden optimointia.

P4H-aktiivisuuden vertailu

Oksygenaaseja käytetään laajalti teollisuudessa, koska ne voivat katalysoida aktivoimattomien C-H-sidosten erittäin spesifistä hapen funktionaalistamista miedoissa olosuhteissa, erityisesti siirtämällä molekyylisen hapen substraattiin . P4H kuuluu 2-oksohappo-riippuvaisten dioksygenaasien perheeseen, joka on monomeerinen proteiini ja käyttää pikemminkin monomeerisiä kuin polymeerisiä substraatteja . Tässä tutkimuksessa mitattiin trans-P4H:n aktiivisuudet käyttämällä rekombinantteja kokosoluja (taulukko 1). Tietomme osoittivat, että ilmentynyt proteiinitaso ja entsymaattinen aktiivisuus oli korkeampi 30 °C:ssa. Tulokset osoittivat myös, että plasmidit olivat hyvin stabiileja, sillä rekombinanttisten E. coli- ja C. glutamicum -kantojen plasmidien stabiilisuus oli käymisen lopussa yli 98 %.

Rekombinanttisilla soluilla, joissa ilmentyi eri geenejä, havaittiin eritasoisia katalyyttisiä aktiivisuuksia L-proliinia kohtaan. E. coli BL21/ pET28a-p4hD:n ilmentämän trans-P4H:n aktiivisuus oli korkein kaikista rakennetuista rekombinanttikannoista. Myös P. stutzerin ja B. bronchiseptican uudet kloonatut ja ekspressoidut geenit osoittivat kiinnostuneita aktiivisuuksia. Eri isäntäkannoista E. coli oli parempi kuin C. glutamicum, mikä voi liittyä vastaavan plasmidin suorituskykyyn. Ekspressioisäntäkantoina käytettiin neljää C. glutamicumin L-proliinia tuottavaa kantaa, ja tuloksena saadut rekombinanttikannat osoittivat erilaisia entsymaattisia aktiivisuuksia. C. glutamicum -kannoista korkein spesifinen entsymaattinen aktiivisuus oli 40,7 U/mg märkää solua C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB:llä. Rekombinantti E. coli/pET28a -p4hD:n spesifinen entsymaattinen aktiivisuus oli kuitenkin jopa 60,4 U/mg – märkä solu. Kolmen rekombinanttisen E. coli -kannan kasvu oli samanlaista. Rekombinanttisten C. glutamicum -kantojen välillä oli kuitenkin merkittävä ero. Rekombinanttiset C. glutamicum -kannat, joilla oli korkeampi spesifinen entsyymiaktiivisuus, kasvoivat vähemmän kuin ne, joilla oli alhaisempi spesifinen entsyymiaktiivisuus. Lisäksi E. coli BL21 /pET28a -p4hD:n entsymaattinen aktiivisuus oli samankaltainen kuin E. coli W1485/pWFH1:n ja korkeampi kuin E. coli BL21/pET24-p4h1:n . E. coli W1485/pWFH1:n p4hD oli Dactylosporangium sp.:n alkuperäinen p4hD, kun taas E. coli BL21/pET24-p4h1:n p4hD oli muunnettu. Vaikka tässä tutkimuksessa tehty kodonioptimointi suunniteltiin C. glutamicumille, tulokset osoittivat, että se onnistui myös E. coli -kannassa.

Trans-Hypin tuotanto pulloissa

Taulukossa 1 on esitetty myös trans-Hypin tuotanto eri rekombinanttisilla C. glutamicum- ja E. coli -kannoilla. Näiden rekombinanttikantojen trans-Hypin saannot riippuivat sekä P4H:n entsymaattisesta aktiivisuudesta että solujen kasvusta. E. coli BL21/ pET28a-p4hD:stä saatiin suurin saanto, mikä johtui sen spesifisestä entsymaattisesta aktiivisuudesta. Vaikka rekombinanttiset E. coli -kannat kasvoivat samalla tavalla tuotantoalustassa, trans-Hypin tuotannossa oli merkittäviä eroja, jotka eivät pysyneet samalla tasolla spesifisten entsymaattisten aktiivisuuksien kanssa. Rekombinanttien C. glutamicum -kantojen trans-Hyp-tuotanto oli myös paljon vähäisempää kuin E. coli BL21/pET28a-p4hD:n tuotanto. Tämä johtui sekä trans-P4H:n vähäisemmästä ilmentymisestä että C. glutamicumin vähäisemmästä solukasvusta. Neljän C. glutamicum -kannan L-proliinin tuotanto oli myös alle 1 g/l. C. glutamicumin rekombinanttikantojen, joilla oli sama geeni p4hD, välillä ei ollut juurikaan eroja trans-Hypin tuotannossa, vaikka joillakin kannoilla oli parempi entsymaattinen suorituskyky ja proliinintuotanto.

Käyttämällä rekombinanttikantoja trans-Hypin syntetisoimiseksi suoraan glukoosista fermentaation avulla päästiin tavoitteeseen, koska sekä prosessissa tarvittavat entsyymit että esiasteet olivat saatavilla. Yliekspressoidut vieraat trans-P4H:t katalysoivat L-proliinin hydroksylointia trans-4-asemassa, kun taas 2- ketoglutaraatti saatiin glukoosista TCA-kierron kautta ja dekarboksyloitiin sitten oksidatiivisesti sukkinaatiksi (kuva 1). Raportoitiin, että proliiniä tarvittiin Hypin tuotannossa rekombinanttisen E. colin avulla vain p4h-geenillä. Käymisen aikana lisätty proliinin sisältämä hiili virtasi vain TCA-syklin välituotteista syntetisoituihin aminohappoihin eikä glukoneogeneesiin . Kertynyt Hyp oli kuitenkin suhteellisen korkealla tasolla myös ilman proliinin lisäystä tässä tutkimuksessa. Voidaan ymmärtää, että Corynebacteriumilla oli tehokas proliinin biosynteesireitti . Proliinin biosynteettinen reitti on tunnistettu myös E. coli -bakteerissa, mikä voi edistää trans-Hypin synteesiä rekombinantti-E. coli -kannoissa. Proliinireitin muuttaminen E. colissa lisäsi Hypin saantoa, kun taas Hypin muodostuminen voi myös lievittää proliinin takaisinkytkentäinhibitiota . Proliinin määrä (0-4 mM) edisti trans-Hypin tuotantoa. L-proliinin jatkuva lisääminen ei kuitenkaan parantanut merkittävästi tuotannon tuottoa (taulukko 2). Tässä tutkimuksessa viljelyaika oli huomattavasti lyhyempi kuin kirjallisuudessa ilmoitetut, mikä saattoi johtua käytetyistä erilaisista väliaineista ja osoitti myös, että optimoinnilla oli suuria mahdollisuuksia. Itse asiassa rekombinantti E. coli tuotti 2,28 g/l trans-Hypiä ilman L-proliinin lisäämistä pulloissa, joissa väliaineita muutettiin hieman, ja 6,72 g/l saavutettiin lisäämällä vain 4 mM L-proliinia.

Trans-Hypin biosynteesin lisäämiseksi edelleen rekombinanttisen C. glutamicum- ja E. coli -bakteerin avulla olisi harkittava myös vaihtoehtoisia lähestymistapoja. E. colissa olisi voitettava proliinin hajoaminen. Vaikka trans-Hypin tuotanto E. colin putA-mutantilla ei parantunutkaan, käytetyn proliinin perusteella laskettu saanto parani huomattavasti. Sekä C. glutamicumissa että E. coli -bakteerissa rekombinanttisen P4H:n ilmentyminen yhtenä oksygenaaseista osallistuu isäntäsolujen fysiologiseen aineenvaihduntaan, mukaan lukien kofaktori, ko-substraatti ja happi. Lisäksi ilman tehokasta proliinin synteettistä reittiä E. colissa substraatin saatavuus ja kuljetus rajoittavat vakavasti transformaatiota.