Účinná výroba kyseliny 3-hydroxypropionové z glycerolu pomocí metabolicky upravené Klebsiella pneumoniae

Při výrobě 1,3-propandiolu nebo 3-HP z glycerolu je hlavním vedlejším produktem kyselina mléčná, která výrazně snižuje výtěžnost produktu. Proto byly učiněny pokusy snížit produkci laktátu delecí genu kódujícího laktátdehydrogenázu (Kumar et al. 2013b; Zhong et al. 2014). Protože obě reakce tvořící 1,3-propandiol a 3-HP soutěží o společný substrát 3-hydroxyaldehyd (3-HPA), delece propanedioloxidoreduktázy zvýhodňuje produkci 3-HP (Ashok et al. 2011). Proto byly v této studii vyřazeny geny ldhA a dhaT, aby se zvýšila produkce 3-HP.

Vliv deficitu ldhA na produkci 3-HP

Byl zkonstruován kmen JJQ01 s deficitem ldhA a bylo potvrzeno vyřazení ldhA, jak ukazuje obrázek S2A. Byly zkonstruovány rekombinantní kmeny Kp4(pUC18-kan-aldH) a JJQ01(pUC18-kan-aldH) a v 5l bioreaktoru byla provedena fermentace v krmné dávce. Profily růstu buněk, spotřeby glycerolu a produkce metabolitů jsou uvedeny na obr. 2a, b. Kp4(pUC18-kan-aldH) produkoval 18,3 g/l 3-HP s výtěžkem 0,21 mol/mol za 38 h, zatímco kyselina mléčná dosáhla 32,2 g/l s vyšším výtěžkem 0,34 mol/mol. Kromě toho bylo vyrobeno 17,6 g/l 2,3-butandiolu, 6,1 g/l 1,3-propandiolu a 10,7 g/l kyseliny octové. Tvorba laktátu zvyšuje nejen náklady, ale také obtížnost zpětného získání 3-HP, který je izomerem laktátu. Kromě toho je laktát hlavním inhibitorem biosyntézy 3-HP a 1,3-propandiolu (Xu et al. 2009b; Kumar et al. 2013b). Deficit ldhA účinně eliminoval tvorbu laktátu a produkce 3-HP dosáhla 48,3 g/l s výtěžkem 0,28 mol/mol, jak ukazuje obr. 2b. Koncentrace a výtěžek 3-HP u tohoto kmene s deficitem ldhA byly ve srovnání s kmenem Kp4(pUC18-kan-aldH) zvýšeny 1,64krát, resp. 33,3 %. Kromě malého množství tvorby ethanolu (přibližně 4 g/l) nebyla u mutantního kmene ldhA zjištěna akumulace pyruvátu a mravenčanu, které nebyly téměř pozorovány v případě použití kmene divokého typu.

Tyto výsledky jasně ukázaly, že zablokování produkce kyseliny mléčné výrazně přesměrovalo tok uhlíku na produkci 3-HP. Asimilace glycerolu přes DhaB se výrazně zlepšila, téměř 0,4 mol/mol glycerolu směřovalo přes DhaB do 3-HPA, což bylo v souladu s jinými studiemi (Kumar et al. 2013b; Xu et al. 2009b). Snížení laktátu mohlo snížit toxicitu pro buňky, zvýhodnilo růst buněk a produktivitu 3-HP. Snížení laktátu však také zvýšilo tvorbu 2,3-butandiolu a 1,3-propandiolu, které dosáhly 21,9 g/l s výtěžkem 0,13 mol/mol, resp. 18,5 g/l s výtěžkem 0,12 mol/mol. V důsledku delece ldhA může nadbytek NADH pocházející ze zvýšené akumulace 3-HP podporovat produkci 2,3-butandiolu a 1,3-propandiolu namísto laktátu za účelem regenerace NAD+ a udržení redoxní rovnováhy. Ve skutečnosti tvorba ethanolu také podporovala regeneraci NAD+, což mělo za následek vyšší tok z pyruvátu na ethanol než tok na pyruvát.

Vliv deficitu dhaT na produkci 3-HP

Delece ldhA dramaticky zvýšila produkci 3-HP, zároveň se zvýšila i produkce 1,3-propandiolu na 18,5 g/l. Ko et al. (2017) uvádí, že redukcí acetátu a dalších vedlejších produktů bylo získáno 43 g/L 3-HP a 21 g/L 1,3-propandiolu. Ačkoli tvorba 1,3-propandiolu prospívá využití glycerolu regenerací kofaktoru, představuje podstatnou část toku uhlíku glycerolu. Protože 1,3-propandiol a 3-HP soutěží o stejný prekurzor 3-HPA, byl za účelem omezení toku na 1,3-propandiol zkonstruován kmen JJQ02(pUC18-kan-aldH) s dvojitým knockoutem ldhA a dhaT (zobrazený v doplňkovém souboru 1: obrázek S2B). Výsledky dávkové fermentace v 5l reaktoru jsou uvedeny na obr. 2c. Neočekávaně vedlo současné vyřazení ldhA a dhaT pouze k získání 44,5 g/l 3-HP, přestože výtěžek byl zvýšen na 0,32 mol/mol glycerolu. Vyřazení dhaT vedlo ke snížení titru a výtěžku 1,3-propandiolu na 9,9 g/l a 0,07 mol/mol. 1,3-propandiol však stále vznikal v reakci katalyzované YqhD a dalšími oxidoreduktázami (Ashok et al. 2013). Kromě toho se ve srovnání s JJQ01(pUC18-kan-aldH) mírně zvýšila produkce 2,3-butandiolu z 21,9 na 23,4 g/l, což naznačuje, že se zvýšil tok do 2,3-butandiolové dráhy, aby se spotřeboval přebytek NADH pocházející z reakce katalyzované ALDH. Syntéza 1,3-propandiolu hraje klíčovou roli v regulaci redoxní rovnováhy u K. pneumoniae. V rámci oxidační dráhy vznikají při tvorbě jedné molekuly acetátu z glycerolu tři molekuly NADH a současně se tvoří jedna molekula ATP. V důsledku toho delece ldhA i dhaT výrazně snížila schopnost regenerace NAD+ a více NADH bylo oxidováno tvorbou 2,3-butandiolu, což vedlo ke zvýšení 2,3-butandiolu. Snížení rychlosti provzdušňování (omezení přísunu kyslíku) mohlo zvýšit produkci acetátu, který poskytoval více ATP, ale zároveň se tvořilo více NADH, což vedlo k další zvýšené produkci 2,3-butandiolu. Zdá se však, že regenerovaného NAD+ bylo méně než toho, který vznikl při reakci katalyzované DhaT, což vedlo k nižší produkci 3-HP. Proto je pro produkci 3-HP při mikroaerobní fermentaci rozhodující dodávka vhodného množství kyslíku pro tvorbu NAD+ bez ovlivnění aktivity DhaB a disimilace glycerolu.

V této studii se nepodařilo zlepšit produkci 3-HP odstraněním genu dhaT. Disimilace glycerolu je regulována glyceroldehydrogenázou DhaD, glycerolkinázou GlpK, glyceroldehydratázou DhaB a 1,3-propandioloxidoreduktázou 1,3-PDORs. Z rigidity glycerolové větve vyplývá, že zlepšení produkce 3-HP delecí genů zapojených do rozdělení toku glycerolu je obtížné. Ashok et al. (2011) stanovili vlastní aktivity DhaD, DhaB, ALDH a 1,3-PDORs po deleci genu dhaT. Zjistili, že aktivita DhaD se mírně zlepšila, aktivita ALDH se mírně snížila a aktivita DhaB se výrazně snížila. Zhang et al. (2008) také analyzovali robustnost v bodech větvení dráhy disimilace glycerolu. Ukázalo se, že rozdělení toku uhlíku mezi redukční a oxidační větev je robustní vůči podmínkám prostředí.

Vliv aerace na produkci 3-HP

Naše předchozí studie ukázaly, že mikroaerobní podmínky jsou příznivé pro produkci 3-HP. Ve srovnání s anaerobním procesem byla při mikroaerobní fermentaci produkce 3-HP výrazně zvýšena díky vyšší úrovni exprese aldehyddehydrogenázy a zároveň byla snížena produkce 1,3-propandiolu (Huang et al. 2013). Wang et al. (2011) uvedli, že specifická aktivita glyceroldehydratasy u K. pneumoniae při provzdušňování 0,04 vvm byla o 59 % vyšší než při absenci přívodu vzduchu. Bylo však zjištěno, že glyceroldehydratáza může být rychle inaktivována kyslíkem (Toraya 2000; Ruch a Lin 1975) a významně ovlivnila produkci 3-HP (Xu et al. 2009a; Huang et al. 2013; Niu et al. 2017). Navíc koenzym B12, kofaktor pro DhaB, není za podmínek vysokého provzdušnění u většiny přirozených producentů 3-HPA, jako je K. pneumoniae, dostatečně syntetizován. Huang et al. (2013) a Ko et al. (2017) také ukázali, že vysoce aerobní podmínky nejsou pro produkci 3-HP výhodné. Proto jsme provedli předběžné experimenty s krmnou dávkou za různých aeračních podmínek a také jsme zjistili, že udržování vysoké míry aerace je pro produkci 3-HP po ukončení růstu buněk nepříznivé (údaje nejsou uvedeny). V krmné dávkové kultuře JJQ02(pUC18-kan-aldH) jsme přijali poloviční rychlost provzdušňování oproti počáteční rychlosti, když byla OD650 uzavřena na maximální hodnotě. Profily růstu, glycerolu a metabolitů jsou uvedeny na obr. 3 a černá šipka označovala časový bod pro snížení rychlosti provzdušňování (0,5 vvm).

Konečný titr 3-HP dosáhl 61.9 g/l s výtěžkem 0,58 mol/mol v 5l reaktoru za 38 h. Koncentrace a výtěžek 3-HP pomocí JJQ02(pUC18-kan-aldH) byly 3,3krát a 2,76krát vyšší než u Kp4 (pUC18-kan-aldH) a 1,28krát a 2,07krát vyšší než u JJQ01(pUC18-kan-aldH). Výsledky ukázaly, že produkce 1,3-propandiolu i 2,3-butandiolu se zastavila po 20 h. Titr 3-HP se však stále zvyšoval, ačkoli rychlost produkce od tohoto časového bodu klesala. V pozdější části mikroaerobní fermentace bylo sice regenerováno málo NADH tvorbou 1,3-propandiolu a 2,3-butandiolu, ale část NADH mohla být stále regenerována prostřednictvím elektronového transportního řetězce, protože nejúčinnější způsob regenerace NAD+ je prostřednictvím elektronového transportního řetězce v přítomnosti kyslíku (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b), což má za následek zvýšení 3-HP bez zjevného zvýšení 1,3-propandiolu a 2,3-butandiolu.

300-L scale-up fermentace

Pro zkoumání proveditelnosti kmene JJQ02(pUC18-kan-aldH) pro produkci 3-HP ve větším bioreaktoru byla provedena krmná dávková fermentace v 300-L bioreaktoru podle podmínek fermentace stanovených v 5-L fermentoru. Byla přijata dvoustupňová strategie provzdušňování; rychlost provzdušňování byla snížena na polovinu v časovém bodě černé šipky, jak je znázorněno na obr. 4. 3-HP dosáhl 54,5 g/l s výtěžkem 0,43 mol/mol a koncentrace a výtěžek byly 12,2 g/l a 0,11 mol/mol pro 1,3-propandiol, 21,3 g/l a 0,5 mol/mol pro 1,3-propandiol.17 mol/mol pro 2,3-butandiol a 9,3 g/l a 0,11 mol/mol pro acetát za 51 h (obr. 4).

V porovnání s výsledky získanými v 5l reaktoru se zjevně zvýšil titr a molární výtěžek 2,3-butandiolu v 300l reaktoru, které byly podobné jako u stejného kmene v 5l reaktoru při konstantní rychlosti provzdušňování 1 vvm. Z toho vyplývá, že přenos kyslíku v 300-L reaktoru může být poněkud vyšší než v 5-L reaktoru se sníženou rychlostí provzdušňování, protože některé výzkumy naznačily, že výroba 2,3-butandiolu vyžaduje vhodnou rychlost provzdušňování (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). Za podmínek provzdušňování v 300litrovém reaktoru podporovala exprese enzymů souvisejících s tvorbou 2,3-butandiolu a pool NADH nebo poměr NADH/NAD+ produkci 2,3-butandiolu a exprese DhaB a AldH mohla být mírně ovlivněna.

S ohledem na redoxní rovnováhu byl u dvojitě mutovaného kmene ldhA dhaT NADH vznikající v reakci katalyzované ALDH částečně regenerován tvorbou 2,3-butandiolu a dalších redukovaných metabolitů, jako je ethanol a sukcinát, a částečně elektronovým transportním řetězcem (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b). Rychlost provzdušňování při mikroaerační fermentaci proto významně ovlivnila konečné produkty. Při fermentaci v 300litrovém reaktoru byla sice rychlost provzdušňování snížena na polovinu původní rychlosti, ale situace s přenosem kyslíku se přesto mohla značně lišit od situace v 5litrovém reaktoru v důsledku odlišných charakteristik přenosu kyslíku, což bylo tradiční téma při škálování bioprocesů. Rozdíly v distribuci produktů v různých reaktorech naznačily důležitost přesné kontroly dodávky kyslíku, zatímco pouhé snížení rychlosti provzdušňování se zdálo být příliš hrubé. Přestože se však titr a výtěžek 3-HP mírně lišily od titru a výtěžku v 5litrovém reaktoru, bylo škálování úspěšné. Vzhledem k tomu, že výkon přenosu kyslíku v 300litrovém reaktoru se lišil od výkonu v 5litrovém reaktoru, očekávalo se, že další přesná regulace rychlosti provzdušňování v 300litrovém reaktoru by mohla zvýšit hladinu 3-HP.

.