5-hydroxymethylcytosin a jeho potenciální role ve vývoji a rakovině

Dvojí role 5-hydroxymethylcytosinu jako stabilní báze DNA a jako meziproduktu při demetylaci DNA

Nyní víme, že hladiny 5hmC se výrazně liší mezi různými typy buněk a tkání a jsou nejvyšší v mozku, zejména v neuronech. Protože 5hmC je oxidačním produktem 5mC, je zřejmé, že tvorba 5hmC z 5mC automaticky snižuje hladinu 5mC v dané pozici nukleotidu nebo dokonce v celém genomu. Proto bylo okamžitě zřejmé, že přeměna 5mC na 5hmC by mohla být prvním krokem v cestě vedoucí k demetylaci DNA. Existují důkazy z různých experimentálních systémů, že tomu tak skutečně může být . Konečným výsledkem této demetylační cesty je pasivní nebo aktivní odstranění modifikované báze a/nebo vymizení methylové skupiny z cytosinu v DNA (obrázek 1). Při pasivní demetylační dráze nemůže být 5hmC kopírován udržovací DNA metyltransferázou DNMT1, enzymem, který propaguje již existující metylační vzory a působí na hemimetylovaná místa CpG . Aktivní demetylační proces, který využívá 5hmC jako meziprodukt, je podstatně složitější. Jedna zpráva naznačuje, že 5hmC může být přeměněn na cytosin pomocí DNA metyltransferáz . Deaminací 5hmC vzniká 5-hydroxymetyluracil , který lze odstranit pomocí enzymů opravujících excizi bází, včetně thyminové DNA glykosylázy (TDG) a jednořetězcové selektivní monofunkční uracil DNA glykosylázy (SMUG1) . V současné době však není známo, jak účinně taková cesta funguje in vivo. Postupnou oxidací 5hmC proteiny TET vzniká 5-formylcytosin (5fC) a poté 5-karboxycytosin (5caC) . Tento 5caC, který je v DNA detekovatelný v nízkých hladinách, může být následně odstraněn buď opravou excizí bází katalyzovanou DNA glykosylázovou aktivitou proteinu TDG , nebo dekarboxylací. Teoreticky by dekarboxylace měla být výhodnější, protože nevyžaduje přerušení fosfodiesterových vazeb DNA, ke kterému dochází při opravě iniciované TDG. Dosud však nebyla identifikována žádná enzymatická aktivita pro dekarboxylační krok, ačkoli se zdá, že k dekarboxylaci dochází .

V mnoha tkáních se hromadí poměrně značné množství 5hmC, mnohem větší, než by se očekávalo, kdyby tato báze byla pouze přechodným meziproduktem v sekvenční oxidační cestě vedoucí k demetylaci DNA. Proto může být 5hmC epigenetickým modulem, který má své vlastní jedinečné biochemické kódovací vlastnosti. Tato funkce může být negativní nebo odpudivá, protože oxidace methylové skupiny při tvorbě 5hmC zablokuje vazbu proteinů, které by jinak interagovaly s 5mC . Alternativně může být jeho funkce pozitivní nebo instruktivní, pokud existují proteiny, které se specificky vážou na 5hmC. Dosud několik různých proteinů prokázalo schopnost rozpoznávat 5hmC, přinejmenším in vitro, včetně UHRF1 , MBD3 , MeCP2 a několika dalších identifikovaných proteomickým přístupem . Biologická úloha jejich vazby na 5hmC však stále není zcela jasná. Většina těchto proteinů má i jiné funkce, a proto nemusí být jedinečně určeny k interakci s 5hmC.

Úloha 5-hydroxymethylcytosinu ve vývoji a diferenciaci savců

Funkční úloha 5hmC v savčích genomech je stále nejasná. Na začátku životního cyklu savců, po oplodnění oocytů spermií, se většina 5mC v otcovském (spermií získaném) genomu oxiduje za vzniku 5hmC . Tento oxidační krok, o němž se dříve předpokládalo, že odráží skutečnou „demetylaci“ DNA, je specifický pro otcovský genom, zatímco mateřský genom (pocházející z oocytu) zůstává chráněn před oxidací katalyzovanou Tet. Oxidaci otcovského genomu katalyzuje Tet3, který je kódován jediným genem Tet exprimovaným ve značné míře v oocytech a zygotách . Genetické vyřazení Tet3 u myší má za následek neúspěšnou oxidaci otcovského genomu, narušený vývoj a perinatální letalitu .

Další důležitý vývojový přechod zahrnuje globální demetylaci DNA v primordiálních zárodečných buňkách (PGC), která začíná přibližně v 8,5. až 9,5. embryonálním dni a je dokončena kolem 13,5. embryonálního dne. Mechanismy vymazávání metylace v PGC zůstávají do značné míry nejasné a kontroverzní. Dlouho se předpokládalo, že klíčovou cestou, která se pravděpodobně podílí na tomto kroku, je aktivní demetylace DNA nezávislá na replikaci . Novější údaje však upřednostňují pasivní ztrátu metylace způsobenou nedostatečným udržováním metylace během replikace DNA . Tato pasivní ztráta 5mC může být účinně iniciována přeměnou 5mC na 5hmC . Tet1 a Tet2 jsou 5mC oxidázy, které jsou v této fázi nejvíce exprimovány v PGC . Potomci myší s nedostatkem Tet1 a Tet2 mají nedostatky v demetylaci DNA u imprintovaných genů . Zvířata s deficitem Tet1/2 obou pohlaví však byla plodná, přičemž samice měly menší vaječníky a sníženou plodnost. Delecí Tet1 a Tet2 lze získat životaschopné dospělé jedince, ačkoli většina takových myší umírá během embryogeneze nebo kolem porodu a vykazuje různé vývojové vady . Tyto údaje naznačují, že Tet1/2 indukovaná oxidace 5mC v PGC není nezbytně nutná pro produkci životaschopného potomstva. V současné době dostupné informace o demetylaci DNA v zygotách a v PGC stále postrádají specifičtější analýzu 5hmC na úrovni sekvence DNA, jakou lze provést například pomocí TAB-sekvenování . Očekává se, že takové informace objasní globální nebo lokusově specifickou účast tvorby 5hmC při zahájení pasivní (nebo aktivní) demetylace DNA. Předchozí zapojení procesů opravy excize bází do přeprogramování zárodečné linie , které by samo o sobě představovalo obrovské riziko pro zachování integrity genomu, pokud by působilo na globální úrovni, může mít různá další vysvětlení. Podle jednoho scénáře by se výskyt aktivity opravy excizí bází mohl vysvětlit požadavkem na potlačení falešných necílených oxidačních reakcí katalyzovaných aktivitou tetoxidázy na guaninech v metylovaných místech CpG (guanin je báze DNA nejvíce náchylná k oxidaci). V jiném prostředí může být 5hmC dále oxidován, možná ve specifických sekvencích, proteiny Tet za vzniku 5caC, který je pak odstraněn opravou excizí bází iniciovanou TDG .

Protože je 5hmC nejhojněji zastoupen v mozkové tkáni, stalo se prioritou porozumět funkci této modifikované báze v mozku. Například v DNA z lidské mozkové kůry je hladina 5hmC asi 1 % všech cytosinů nebo 20 až 25 % všech bází 5mC . To odpovídá přibližně 6 000 000 bází 5hmC na haploidní genom. Je zřejmé, že tyto hladiny naznačují, že 5hmC má v mozku savců důležitou funkční úlohu. Dosud uvedené studie ukázaly, že 5hmC je v mozkových tkáních velmi hojně zastoupen v genových oblastech, a to buď v promotorech, nebo ještě více v intragenových oblastech, tzv. genových tělech . Lze předpokládat, že tvorba 5hmC u promotorů, CpG ostrovů nebo břehů (okrajů) CpG ostrovů funguje obdobně jako opravný proces, který oxiduje a případně odstraňuje nevhodně zavedené 5mC v těchto oblastech . Ukládání 5hmC v promotorech nebo tělech genů často pozitivně koreluje s aktivitou genů. Mechanismus, jak 5hmC asociovaný v tělesech genů zvyšuje hladiny transkriptů, není v současné době znám. Jednou z možností je, že oxidace 5hmC uvolňuje represivní účinek na transkripci, možná tím, že působí proti falešné intragenové protismyslné transkripci. Mezi další vysvětlení může patřit skutečnost, že 5hmC má destabilizující účinek na strukturu DNA, který potenciálně podporuje otevření dvojité šroubovice transkripčním aparátem.

5hmC, ačkoli není rozpoznáván několika methyl-CpG vazebnými proteiny, včetně MBD1, MBD2 a MBD4 , je schopen vázat MeCP2 , methyl-CpG vazebný protein, který se hojně vyskytuje v mozku a je mutován u neurologické poruchy Rettova syndromu. Dřívější studie, které používaly methyl-CpG vazebnou doménu (MBD) MeCP2 namísto proteinu plné délky, nedospěly k závěru, že MeCP2 se váže na 5hmC . Důvody těchto rozporů nejsou jasné. Spojení mezi MeCP2 a 5hmC v mozku je obzvláště zajímavé, protože hladiny 5hmC jsou nejvyšší v mozku a MeCP2 je v mozku hojně zastoupený protein, který dosahuje podobných hladin jako histon H1. Z těchto důvodů lze v mozku předpokládat spíše celogenomovou než sekvenčně specifickou mechanistickou roli vazby 5hmC pomocí MeCP2.

Jak se nedávno ukázalo, tvorba 5hmC je kritická pro vývoj mozku. Tato báze je hojná ve vyvíjejících se neuronech, v nichž se její hladina zvyšuje oproti neuronálním progenitorovým buňkám a kde se specificky lokalizuje do genových tělísek genů důležitých pro neuronální diferenciaci . Tet3 je nejvíce exprimován ve vyvíjející se mozkové kůře myší, následuje Tet2 a hladiny Tet1 jsou v této tkáni velmi nízké. Zvýšení hladin Tet2, Tet3 a 5hmC v diferencujících se neuronech se shoduje s redukcí Polycomb H3K27 metyltransferázy Ezh2 a ztrátou H3K27me3 u kritických genů. Snížení hladin Tet2 a Tet3 nebo zvýšení exprese Ezh2 vede k neúplné nebo zablokované diferenciaci neuronů . Tvorba 5hmC tedy podporuje diferenciaci neuronů tím, že moduluje expresi genů, které jsou v tomto důležitém vývojovém přechodu nejkritičtější.

Ztráta 5-hydroxymethylcytosinu u rakoviny

Hladiny 5hmC u rakoviny jsou silně snížené oproti odpovídající normální tkáni v okolí nádoru . Pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií, imunobločků na bázi protilátek proti 5hmC a imunohistochemie jsme prokázali nádorovou ztrátu 5hmC u rakoviny plic, mozku, prsu, jater, ledvin, prostaty, střeva, dělohy a melanomu . Toto pozorování potvrdili i další badatelé, kteří prokázali ztrátu 5hmC u různých typů solidních nádorů . Navíc bylo prokázáno, že opětovné zavedení TET2 obnovuje hladinu 5hmC a snižuje metastatický potenciál melanomových buněk . Je pozoruhodné, že při společném imunobarvení tkáňových řezů protilátkami proti 5hmC a proti antigenu Ki67, což je marker vyskytující se pouze v proliferujících buňkách, jsme pozorovali, že 5hmC a Ki67 nejsou téměř nikdy přítomny současně v jedné buňce . Na úrovni klinické diagnostiky by se kombinovaná imunohistochemická analýza úbytku 5hmC a přítomnosti Ki67 pozitivních buněk mohla vyvinout v biomarker pro diagnostiku rakoviny. Nedostatek nebo silné snížení 5hmC v nádorech naznačuje, že proliferující buňky ztrácejí 5hmC. Ve většině případů je většina nádorové hmoty ochuzena o 5hmC, i když jsou Ki67-pozitivní buňky vzácné, což naznačuje, že tyto nádorové buňky měly v minulosti proliferaci vedoucí ke ztrátě 5hmC, která pak není obnovena . Na replikaci závislá ztráta 5hmC odráží situaci připomínající situaci u preimplantačních embryí, kdy po počáteční tvorbě 5hmC v otcovské DNA následuje na replikaci závislá ztráta nebo zředění této značky . Podobně se globální obsah 5hmC rychle snižuje při adaptaci buněk z normální tkáně na buněčnou kulturu . Nejjednodušším vysvětlením je, že oxidací 5hmC vzniká v DNA hemi-hydroxymethylované místo CpG, které není rozpoznáno DNMT1 během replikace DNA. Takové vysvětlení je v souladu se studiemi in vitro, které ukazují, že DNMT1 není schopen působit na místa CpG, která obsahují 5hmC . Jsou však možná i jiná vysvětlení snížení 5hmC u rakoviny. Hladiny proteinů TET mohou být v nádorové tkáni nižší než v odpovídající normální tkáni. Ačkoli jsme nepozorovali konzistentní rozdíly na úrovni RNA pro TET1, TET2 nebo TET3 v nádorech plic a mozku ve srovnání s normální tkání , jiní uvádějí nižší hladiny exprese genů TET u rakoviny . Další možností je, že nádorové buňky obsahují narušené metabolické dráhy, které se podílejí na produkci kofaktoru pro aktivitu TET, 2-oxoglutarátu (viz níže).

Mutace TET2 u lidské rakoviny

TET1 patří do rodiny proteinů charakterizovaných jako podporující přeměnu 5mC na 5hmC v savčí DNA . Do rodiny TET patří tři identifikovaní členové rodiny: TET1, TET2 a TET3. TET1 se nachází na lidském chromozomu 10q21.3, zatímco TET2 se nachází na chromozomu 4q24 a TET3 na chromozomu 2p13.1. Enzym TET1 se skládá z DNA vazebné domény zinkového prstu CXXC, oblasti bohaté na cystein a dioxygenázové domény závislé na 2-oxoglutarátu a železe (II) (2OGFeDO) . TET3 obsahuje také N-koncovou doménu CXXC . Gen TET2 však během evoluce prodělal chromozomální genovou inverzi, čímž se jeho doména CXXC oddělila od katalytické domény a vznikl nový gen s doménou CXXC nazvaný IDAX/CXXC4, který kóduje negativní regulátor TET2 . Na základě profilů EST a expresních matic vykazuje TET1 největší expresi během embryogeneze a nevykazuje relevantní expresi v dospělých tkáních. TET2 je nejvíce exprimován v hematopoetických buňkách a TET3 se zdá být všudypřítomně exprimován v dospělých lidských tkáních.

Leukémie je onemocnění, při kterém je během normální diferenciace hematopoetických kmenových buněk v určité fázi diferenciace narušena klonální expanze hematopoetických prekurzorových buněk v kostní dřeni, což způsobuje nerovnováhu mezi diferenciací a sebeobnovou. Nevhodná expanze hematopoetických progenitorových buněk je primárně způsobena blokádou zrání buněk. Poruchy myelodysplastického syndromu (MDS) v krvetvorbě jsou charakterizovány cytopenií (nízkým počtem krvinek), neefektivní krvetvorbou v té či oné buněčné linii a zvýšeným rizikem transformace v akutní myeloidní leukemii (AML) . U AML vede rychlý růst abnormálních bílých krvinek v kostní dřeni k zablokování produkce různých buněk z jiných buněčných linií.

TET2 byl nalezen mutovaný u pacientů s myeloproliferativními neoplaziemi (MPN), MDS, AML a chronickou myelomonocytární leukemií (CMML) a je nejčastěji mutovaným genem u MDS . Mutace TET1 nebo TET3 se u MDS nevyskytují, ani mutace TET2 nekoreluje s několika dalšími známými běžnými mutacemi . Zajímavé je, že mutace izocitrát dehydrogenázy 1/2 (IDH1/2) se zřídka vyskytují společně s mutacemi TET2, ale mají podobné účinky jako mutace TET2 na hematopoetické kmenové buňky (HSC) . Zatímco mutace TET2 jsou spojeny se zkráceným celkovým přežitím u AML ve srovnání s pacienty s divokým typem TET2, mutace TET2 u pacientů s MDS a MPN podporují progresi do AML . Gen TET2 se skládá z celkem jedenácti exonů, které se překládají do proteinového produktu o velikosti 2002 aminokyselin . Mutace genu TET2 u myeloidních nádorů byly nejčastěji pozorovány v exonech 3a a 10, což jsou nejdelší exony . Mutace TET2 jsou u MPN cíleny jak na multipotentní, tak na angažované progenitorové buňky hematopoetické linie, což naznačuje, že TET2 hraje důležitou roli v myelopoéze . Delece TET2 a ztráta heterozygozity nebo uniparentální disomie byly pozorovány u (9 %) pacientů s MDS/AML s mutovaným TET2, kde pravděpodobně došlo ke ztrátě alely divokého typu během rekombinace, což umožnilo mutovanému TET2 podporovat fenotyp ztráty funkce. Kosmider et al. pozorovali, že 50 % pacientů s mutovaným TET2 mělo genetické defekty zaměřené na obě kopie TET2. Zdá se, že mutace v TET2 vedou ke ztrátě funkce, což naznačuje, že může hrát nádorově supresivní roli.

Pochopení základních důsledků chybějící funkce mutovaného TET2 a jeho role u myeloidních malignit je současnou prioritou výzkumu. Několik laboratoří vytvořilo podmíněné modely myší s knockoutem Tet2, u nichž byly cíleny kritické exony Tet2. Moran-Crusio a spol. pozorovali, že u myší Tet 2-/- se ve věku 20 týdnů vyvinula splenomegalie, která vykazovala podobné fenotypy jako u lidských pacientů s CMML s mutovaným TET2. Údaje z různých myších modelů vedly k podobným pozorováním. Deletování Tet2 není embryonálně letální. Hlavním pozorováním, které učinili Moran-Crusio et al. a Ko et al. je, že hematopoetické kmenové buňky z Tet2-/- myší mají zvýšenou schopnost repopulace hematopoetického kompartmentu in vivo během kompetitivních rekonstitučních testů s konkurencí HSC z Tet2+/+ buněk. Analýza různých orgánů Tet2-/- myší ukázala, že ztráta Tet2 není kompenzována zvýšením exprese Tet1 nebo Tet3 . Hladiny 5hmC jsou významně sníženy v kostní dřeni a slezině Tet2-/- myší . Tet2-/- myši vykazují nárůst HSC s mírným nárůstem myeloidních progenitorů, což vychyluje hematopoézu směrem k monocytům/makrofágům . Předpokládá se, že aktivní Tet2 reguluje normální krvetvorbu, aby zajistil správnou distribuci linií a řízenou diferenciaci HSC. Zvláště zajímavý je vliv mutací TET2 na hladiny a vzorce 5mC v genomu. Současné údaje však nejsou zdaleka jednoznačné. Zatímco jedna zpráva naznačuje, že mutace TET2 u AML je spojena s fenotypem hypermetylace DNA , jiné údaje naznačují, že vzorky kostní dřeně pacientů s mutací TET2 mají nízké hladiny 5hmC a hypometylaci DNA . Situaci komplikuje skutečnost, že hematopoetické malignity jsou často charakterizovány mutacemi v několika epigenetických modifikátorech včetně EZH2, IDH1, IDH2, MLL, DNMT3A a ASXL1, což potenciálně zastírá jakékoli přímočaré souvislosti . Například v jedné studii mělo osm z jedenácti pacientů s mutacemi DNMT3A (73 %) u T-buněčného lymfomu také mutace TET2 .

Mutace v kofaktorových drahách

5mC oxidázy jsou enzymy závislé na 2-oxoglutarátu (obrázek 2). Tento kofaktor je produkován v cyklu trikarboxylových kyselin z isocitrátu enzymem IDH. Je zajímavé, že několik typů lidských nádorů obsahuje mutace v genu IDH1. Mutace IDH1 jsou zvláště časté u gliomů II. a III. stupně, kde se vyskytují až u 70 % pacientů . Mutace v IDH1 a IDH2 se vyskytují také u myeloidních leukemií a několika dalších malignit, ale s nižší frekvencí . Tyto mutace IDH1 nejsou roztroušeny po celém genu, ale nacházejí se téměř výhradně na pozici aminokyseliny 132 . Toto zjištění naznačuje, že tento konkrétní mutovaný protein IDH1 má vlastnost zisku funkce. Překvapivým zjištěním bylo, že mutant IDH1 s kodonem 132 argininu na histidin produkuje jako reakční produkt onkometabolit 2-hydroxyglutarát (2HG) namísto 2-oxoglutarátu . Zdá se, že isocitrátová oxidační reakce prováděná tímto mutantem je neúplná a produkuje pouze 2HG. Kromě toho je 2HG kompetitivním inhibitorem mnoha, ne-li všech enzymatických aktivit závislých na 2-oxoglutarátu. Proteiny TET představují jednu třídu takových enzymů a bylo prokázáno, že 2HG je inhibitorem TET1 a TET2 .

Jedním ze zajímavých korelátů přítomnosti mutované IDH1 v gliomových nádorech je, že nádory s mutací IDH1 jsou téměř vždy spojeny s hojnými změnami v metylaci DNA v celém genomu, o čemž svědčí rozsáhlá hypermetylace ostrovů CpG . Tento fenotyp byl označen jako CpG-island methylator fenotyp (nebo CIMP) . Je lákavé předpokládat, že CIMP u gliomů s mutací IDH1 souvisí s poruchou tvorby 5hmC v těchto nádorech, protože aktivita TET je narušena 2HG. Ve skutečnosti vedlo experimentální zavedení IDH1 mutantního konstruktu do lidských astrocytů ke vzniku fenotypu podobného CIMP . Navíc u podmíněných knock-in myší, u nichž byl do endogenního lokusu Idh1 vložen nejběžnější mutant Idh1 R132H a byl exprimován v hematopoetických buňkách, byla pozorována hypermetylace DNA . Při přímém srovnání hladin 5hmC v DNA mezi gliomy s mutací IDH1 a gliomy s divokým typem IDH1 jsme však nepozorovali žádné podstatné rozdíly mezi těmito dvěma kategoriemi mozkových nádorů . Proto je třeba mít na paměti, že mutantní IDH1 a jeho metabolický produkt 2HG neovlivňují pouze enzymy TET, ale také inhibují mnoho lyzinových demetyláz, které jsou závislé na 2-oxoglutarátu a dalších enzymech závislých na 2-oxoglutarátu. Dysfunkce těchto lysinových demetyláz může mít sekundární dopad na vzorce metylace DNA na CpG ostrovech.

.