ABT-263: Účinný a orálně biologicky dostupný inhibitor rodiny Bcl-2

Výsledky

ABT-263 je orálně biologicky dostupný inhibitor rodiny Bcl-2. Strukturní vlastnosti ABT-737, které propůjčují léčivu nežádoucí vlastnosti, vyplývají z konstrukčních prvků nezbytných pro inhibici velkého povrchu, hydrofobní interakce protein-protein a snížení vazby na sérový albumin (4-6). Pro zlepšení perorální účinnosti této relativně velké (MW >800) molekuly byla nutná pečlivá rovnováha mezi cílovou afinitou, buněčnou účinností a perorální absorpcí. Podél páteře ABT-737 byla identifikována tři klíčová místa, která ovlivňují rovnováhu náboje, metabolismus a perorální absorpci (obr. 1). Analogy obsahující modifikace na těchto místech byly optimalizovány tak, aby se maximalizoval farmakokinetický/farmakodynamický vztah mezi perorální expozicí u zvířat a účinností u lidských nádorových buněčných linií. Výsledkem tohoto úsilí byla identifikace ABT-263.

ABT-263 si zachovává vysokou afinitu k Bcl-xL, Bcl-2 a Bcl-w, která je pod detekčním limitem fluorescenčního polarizačního testu (Ki ≤1 nmol/l), ale slaběji se váže na Mcl-1 a A1 (tabulka 1). Tento vzorec selektivity je podobný jako u jeho předchůdce ABT-737 a proteinu Bad obsahujícího pouze BH3 (12). Subnanomolární afinita ABT-263 k Bcl-xL byla potvrzena citlivějším testem časově rozlišené fluorescenční rezonance přenosu energie, který ukazuje, že enantiomer (stereoizomer s opačnou konfigurací morfolinoethylové skupiny, použitý jako méně aktivní kontrola) je ∼40krát méně účinný.

Farmakokinetický profil ABT-263 je charakterizován nízkými hodnotami plazmatické clearance a nízkými distribučními objemy u myší, potkanů, psů a opic s plazmatickým eliminačním poločasem po i.v. dávce 4,6 až 8,4 hodiny (Doplňková tabulka S1). Biologická dostupnost po perorálním podání byla u všech čtyř druhů ∼20 %. Vzhledem k nízké rozpustnosti ve vodě vykazuje ABT-263 prodlouženou absorpci omezenou rychlostí rozpouštění v ústech. P.o. podání v přípravcích na bázi lipidů, ve kterých je sloučenina výrazně lépe rozpustná, přináší zvýšenou absorpci s biologickou dostupností blízkou 50 % a poločasem perorální eliminace 8,9 hodiny u psů. Reprezentativní křivka plazmatické koncentrace léčiva po i.v. nebo p.o. podání u psa je uvedena na doplňkovém obrázku S1.

ABT-263 vykazuje cytotoxicitu založenou na mechanismu. Bylo zjištěno, že řada malých molekul mimetik BH3 váže členy rodiny Bcl-2 se skromnou afinitou a indukuje apoptózu v nádorových buněčných liniích (21-23). Nedávno se však ukázalo, že mnohé z těchto látek zabíjejí buňky způsobem nezávislým na Bax/Bak, což zpochybňuje funkční význam jejich slabé afinity k proteinům Bcl-2 a skutečné mechanismy účinku těchto molekul (14). Proto jsme považovali za důležité důkladně prokázat, že apoptóza vyvolaná ABT-263 je přímým důsledkem inhibice proteinů rodiny Bcl-2. Nejprve byla hodnocena buněčná aktivita ABT-263 v myší prolymfocytární buněčné linii FL5.12 závislé na interleukinu-3 (IL-3). Vysazení IL-3 vyvolává u FL5.12 apoptózu, částečně prostřednictvím zvýšené regulace proapoptotických faktorů Bim a Puma (24, 25). Nadměrná exprese Bcl-2 (FL5.12-Bcl-2) nebo Bcl-xL (FL5.12-Bcl-xL) chrání před účinky stažení IL-3 sekvestrací Bim a Puma (25). ABT-263, ale nikoli enantiomer, zvrátil ochranu poskytovanou nadměrnou expresí Bcl-2 nebo Bcl-xL (EC50 = 60, resp. 20 nmol/l; obr. 2A). ABT-263 byl neúčinný při vyvolávání buněčné smrti v přítomnosti IL-3, kdy buňky FL5.12 nebyly vystaveny proapoptotickým podnětům. Schopnost ABT-263 zabíjet buňky FL5.12-Bcl-2 nebo FL5.12-Bcl-xL při vysazení IL-3 byla významně oslabena v přítomnosti inhibitoru kaspáz ZVAD, což naznačuje, že zabíjení buněk je závislé na kaspázách (doplňkový obr. S2).

K určení, zda lze cytotoxicitu vyvolanou ABT-263 přičíst narušení intracelulárních interakcí proteinů rodiny Bcl-2, byly provedeny koimunoprecipitační studie. ABT-263 vyvolal v buňkách FL5.12-Bcl-xL pokles interakcí Bim:Bcl-xL závislý na dávce během 2 hodin po ošetření (doplňkový obr. S3). Podobný průběh mělo i narušení komplexů Bim:Bcl-2 v buňkách FL5.12-Bcl-2 (údaje nejsou uvedeny), což naznačuje, že ABT-263 obnovuje buněčnou smrt závislou na IL-3 oslabením schopnosti Bcl-xL a Bcl-2 sekvestrovat proapoptotické faktory, jako je Bim. Schopnost ABT-263 narušovat interakce proteinů rodiny Bcl-2 s proteiny byla potvrzena v savčím dvouhybridním systému (obr. 2B). ABT-263 inhiboval interakci VP16-Bcl-xS s Gal4-Bcl-xL (zjevné EC50 ∼50 nmol/l), zatímco enantiomer byl mnohem méně účinný.

Pro další zkoumání mechanismu účinku byla aktivita ABT-263 hodnocena v sérii buněk myších embryonálních fibroblastů (MEF), které zahrnovaly buňky divokého typu (WT) i buňky s deficitem Bcl-x, Mcl-1 a Bax/Bak (DKO). ABT-263 silně indukoval buněčnou smrt u Mcl-1-/- (EC50 ∼50 nmol/l), ale ne u Bcl-x-/- (EC50 ≥10 μmol/l) MEF buněk (doplňkový obr. S4A). To potvrzuje schopnost ABT-263 funkčně inhibovat Bcl-xL, ale ne Mcl-1, v buněčném kontextu a je v souladu s předchozími pozorováními s ABT-737 (7, 11, 13, 14, 26). Enantiomer byl v obou systémech neúčinný. ABT-263 byl rovněž neúčinný (EC50 ≥10 μmol/l) při zabíjení WT nebo DKO MEF buněk, což je v souladu s předchozími zprávami (14). Naproti tomu etoposid, obecná cytotoxická látka, stejně jako dvě uváděná malomolekulární BH3 mimetika , vyvolaly buněčnou smrt s podobnými EC50 u všech čtyř typů MEF buněk, což naznačuje, že tyto sloučeniny vyvolávají buněčnou smrt alespoň částečně mechanismy nezávislými na rodině Bcl-2 (doplňkový obr. S4C).

Pro posouzení schopnosti ABT-263 přímo indukovat apoptózu v lidské nádorové buněčné linii byla sledována translokace Bax a uvolňování cytochromu c v buněčné linii SCLC H146. Bylo prokázáno, že H146 je z hlediska přežití závislá na Bcl-2 (25). ABT-263 vyvolal v závislosti na dávce pokles cytosolického Bax spojený se zvýšením cytosolického cytochromu c během 2 hodin po léčbě (obr. 2C-i). Enantiomer nebyl schopen vyvolat podobnou odpověď. Aktivace Bax a uvolnění cytochromu c byly potvrzeny mikroskopií (obr. 2C-ii). K detekci aktivovaného Bax v buňkách H146 byla použita protilátka 6A7 anti-Bax, která specificky rozpoznává konformačně aktivní formu Bax. V souladu s frakcionačními studiemi byla léčba ABT-263 spojena s výrazným nárůstem aktivovaného Bax. To odpovídalo uvolnění cytochromu c z mitochondrií do cytosolu, jak dokládá snížení bodových struktur a zvýšení cytosolického barvení. ABT-263, ale nikoli jeho enantiomer, také vyvolal časově závislé zvýšení aktivity kaspázy-3, které bylo zjistitelné po 2 hodinách a které dosáhlo vrcholu po ∼6 hodinách (obr. 2D). Tento účinek byl závislý na koncentraci, s EC50 ∼100 nmol/l v časovém bodě 6 hodin (obr. 2D, vložka). Naproti tomu kamptothecin, inhibitor topoizomerázy I, o kterém se uvádí, že vyvolává mitochondriální apoptózu a následnou aktivaci kaspáz (27, 28), byl schopen vyvolat zvýšení aktivity kaspázy-3 až po 24 hodinách (data nejsou uvedena). Tyto údaje naznačují, že ABT-263 působí přímo na inhibici Bcl-2 a Bcl-xL, čímž uvolňuje proapoptotické faktory, jako je Bim, a vyvolává rychlou aktivaci mitochondriální apoptotické dráhy.

Pro vyhodnocení rozsahu buněčné aktivity ABT-263 byl zkoumán panel lidských nádorových buněčných linií zahrnující řadu typů nádorů. V souladu s předchozími zprávami o přípravku ABT-737 (12) vykazoval ABT-263 aktivitu v jediné látce u SCLC a hematologických malignit, ale ne u většiny ostatních typů nádorů (údaje nejsou uvedeny). Pro bližší prozkoumání aktivity v těchto citlivých typech nádorů byl ABT-263 zkoumán v panelech buněčných linií odvozených od SCLC (n = 22) a hematologických malignit (n = 23). V každém panelu vykazoval ABT-263 různou účinnost, přičemž 32 % (SCLC) a 48 % (hematologické) buněčných linií bylo vysoce citlivých (EC50 <1 μmol/l; obr. 3). Enantiomer byl v těchto citlivých buňkách >20krát méně aktivní (doplňková tabulka S2).

Orální dávkování ABT-263 vede k regresi SCLC a ALL xenograftových nádorů in vivo. Pro rozšíření těchto pozorování in vivo byl ABT-263 hodnocen v bočních xenograftových modelech vytvořených z některých citlivých SCLC a hematologických buněčných linií. Při podávání p.o. jednou denně v dávce 100 mg/kg po dobu 21 po sobě jdoucích dnů vyvolal ABT-263 u všech zvířat s nádory H889 (SCLC) nebo RS4;11 (ALL) rychlou a úplnou nádorovou odpověď (CR), která přetrvávala několik týdnů po ukončení léčby (obr. 4A). Podobná léčba myší nesoucích nádory H146 SCLC vyvolala rychlé regrese, které vedly k CR u 60 % a PR u 40 % zvířat (obr. 4A). U tohoto modelu byl pozorován postupný nárůst nádorů začínající několik týdnů po ukončení dávkování. Aktivita byla v modelu xenograftu H146 závislá na dávce. Léčba přípravkem ABT-263 v dávce 50 mg/kg po dobu 21 po sobě jdoucích dnů vyvolala CR u 22 % a PR u 44 % zvířat, zatímco dávka 25 mg/kg vyvolala statisticky významnou, ale mírnou inhibici růstu nádoru bez pozorované regrese nádoru. ABT-263 byl při všech dávkách dobře snášen (<5% úbytek hmotnosti).

Pro korelaci expozice přípravku ABT-263 s protinádorovou účinností byla provedena farmakokinetická studie ustáleného stavu, ve které byly myším bez nádoru podávány dávky p.o. jednou denně po dobu 3 dnů a po třetí dávce byly stanoveny plazmatické koncentrace léčiva. Jak maximální plazmatická koncentrace (Cmax), tak plocha pod křivkou plazmatické koncentrace (AUC) byly úměrné dávce a zvyšovaly se zhruba lineárně (doplňková tabulka S3). Dávka 100 mg/kg, která způsobila 100% celkovou míru odpovědi (celková míra odpovědi = CR + PR), poskytla hodnoty Cmax 7,7 μmol/l a AUC 90 μmol/l h. Expozice vyplývající z dávky 50 mg/kg, která vyvolala 66% celkovou míru odpovědi, byla 5,4 μmol/l (Cmax) a 54 μmol/l h (AUC). Tyto údaje naznačují, že vrcholové plazmatické koncentrace léčiva ABT-263 v rozmezí ∼5,4 až 7,7 μmol/l jsou vysoce účinné.

ABT-263 zvyšuje aktivitu chemoterapeutik in vivo. Účinnost ABT-263 in vivo byla zkoumána v kombinaci s běžně používanými terapeutickými látkami na několika agresivních modelech hematologických malignit. ABT-263 a rituximab byly zkoumány na bočním xenograftu modelu DoHH2 B-buněčného lymfomu (obr. 4B). Při denním podávání dávky 100 mg/kg p.o. po dobu 17 dnů vykazoval ABT-263 44% inhibici růstu nádoru. Jednorázová dávka rituximabu 10 mg/kg vyvolala 84% inhibici růstu nádoru. Ani ABT-263, ani rituximab samotné nedosáhly trvalé regrese nádoru; kombinace však vykazovala lepší účinek a dosáhla 70 % CR a 10 % PR. Tato kombinace také vedla k významnému zlepšení zpomalení růstu nádoru (>700 %) oproti samotnému rituximabu (300 %).

Účinnost přípravku ABT-263 v monoterapii a v kombinaci s modifikovaným režimem R-CHOP byla hodnocena také na bočním xenograftu modelu GRANTA-519 lymfomu z plášťových buněk (obr. 4B). ABT-263 podávaný v dávce 100 mg/kg p.o. po dobu 21 po sobě jdoucích dnů vyvolal 40% inhibici růstu nádoru. Ve srovnání s tím režim R-CHOP inhiboval růst nádoru o 68 % s 20 % CR. Tato kombinace vedla k dramatické regresi nádoru a kompletní odpovědi u všech testovaných zvířat, přičemž u čtyř z devíti hodnocených nádorů nebyl prokázán žádný růst nádoru.

Nakonec jsme zkoumali schopnost přípravku ABT-263 potencovat účinky chemoterapie u modelu rezistentního k přípravku ABT-263. V tomto případě jsme zjišťovali, zda je přípravek ABT-263 účinnější než chemoterapie. V modelu OPM-2 flank xenograftu mnohočetného myelomu (in vitro EC50 = 6,7 μmol/l) ABT-263 podávaný denně po dobu 21 dnů v dávce 100 mg/kg významně neinhiboval růst nádoru (obr. 4B). Bortezomib podávaný v maximální tolerované dávce (1 mg/kg i.v., qd ×3) inhiboval růst nádoru o 70 % bez CR. ABT-263 zvýšil účinnost bortezomibu s kombinací, což vedlo k 95% inhibici růstu nádoru a 40% míře CR.

ABT-263 vyvolává rychlou, ale reverzibilní trombocytopenii. Nedávno jsme uvedli, že ABT-737 vyvolává u zvířat rychlou a reverzibilní trombocytopenii v důsledku inhibice proteinů rodiny Bcl-2 a indukce apoptózy v cirkulujících trombocytech bez toxicity pro kostní dřeň (29). Podle očekávání vyvolává ABT-263 také trombocytopenii. Po jednorázové p.o. dávce u psů se počet cirkulujících trombocytů snížil během 2 hodin s nadirem trombocytů po 6 hodinách a známkami opětovného nárůstu během 24 hodin (obr. 5A). Abychom zjistili účinky dlouhodobého podávání, zkoumali jsme farmakokineticko-farmakodynamický vztah po podání více denních dávek u psa (obr. 5B). ABT-263 byl podáván p.o. v dávce 2 mg/kg/d po dobu 6 dnů a poté byl zvýšen na 6 mg/kg/d po dobu dalších 6 dnů. Počet krevních destiček a plazmatické koncentrace léčiva byly hodnoceny 6 hodin po podání, aby se zachytil pravděpodobný nadir krevních destiček ve dnech 1 až 4 a ve dnech 7 až 11. Při dávce 2 mg/kg se počet trombocytů snížil z počáteční hodnoty ∼250 000/μl na ∼125 000/μl do druhé dávky a poté se udržoval stabilní po zbývající dávky. Plazmatická koncentrace léčiva získaná 6 hodin po podání (C6h) zůstala konstantní na hodnotách v rozmezí 3,6 až 4,2 μmol/l. Na základě farmakokinetického profilu přípravku ABT-263 (doplňkový obr. S1) je C6h zhruba 2krát nižší než Cmax, což naznačuje, že vrcholové plazmatické koncentrace léčiva dosažené po opakovaných dávkách 2 mg/kg jsou ∼7 až 8 μmol/l. Tyto hladiny jsou podobné hladinám dosaženým po podání dávky 100 mg/kg p.o. u myší. Po zvýšení dávky přípravku ABT-263 na 6 mg/kg/d se počet krevních destiček snížil na ∼50 000/μl do druhého dne této vyšší dávky a zůstal relativně konstantní po celou dobu trvání studie. Hodnoty C6h se při této úrovni dávky pohybovaly od 10,2 do 14,8 μmol/l (Cmax, 20-30 μmol/l). ABT-263 byl v této studii dobře snášen bez úmrtí nebo nežádoucích klinických příznaků. V místě venepunkce však byly patrné některé hematomy, což odpovídá změnám v hemostáze. Tyto údaje naznačují, že opakovaná denní expozice ABT-263 v hladinách, které se ukázaly jako vysoce účinné na myších modelech, vede u psů k ∼50% snížení cirkulujících krevních destiček. Kromě toho jsou plazmatické koncentrace několikanásobně vyšší než účinná hladina dobře tolerovány, přičemž počet cirkulujících trombocytů se sníží na ∼50 000/μl.