5.4.4.3 Role NCP v biomineralizaci dentinu (SIBLINGs)
Několik kyselých proteinů je aktivních při podpoře nebo inhibici ukládání minerálů. Jednou ze skupin proteinů, kterým se věnuje velká pozornost, je rodina malých glykoproteinů vázajících N-vázané ligandy integrinů (SIBLING). Tato skupina proteinů představuje hlavní skupinu NCP v kosti i dentinu a zahrnuje: osteopontin (OPN), kostní sialoprotein (BSP), dentinový matrixový protein 1 (DMP1), dentinový sialofosfoprotein (DSPP) a matrixový extracelulární fosfoglykoprotein (MEPE) (Fisher et al., 2001). Všechny tyto proteiny prokázaly schopnost vázat se na některé specifické složky ECM nebo buňky a schopnost interagovat a vázat Ca2+ ionty. Jsou vnitřně neuspořádané, s relativně náhodnou strukturou a otevřenou konformací, která jim umožňuje interagovat s řadou dalších složek matrix (Evans, 2003; George a Veis, 2008). Jejich význam pro mineralizaci vyplývá ze studií, v nichž nedostatek jednotlivých SIBLING způsobuje defektní mineralizaci in vivo (Maciejewska a Chomik, 2012; Xiao et al., 2001; Zhang et al., 2001). Nicméně byla naznačena určitá míra redundance jejich funkce, protože žádný z proteinů nevyvolal úplné potlačení mineralizace.
Několik studií prokázalo, že DMP1 je multifunkční protein s relevantní úlohou v diferenciaci odontoblastů a událostech spojených s nukleací minerálů (He et al., 2003a; He a George, 2004; Qin et al., 2007). Studie využívající rekombinantní DMP1 (rDMP1) ukázaly, že protein podléhá samouspořádání do konfigurace β-sheet pouze v přítomnosti vápníku (He et al., 2003a,b). Toto zjištění vedlo k představě, že oligomerizace DMP1 dočasně stabilizuje nově vzniklé prekurzory fosforečnanu vápenatého tím, že je sekvestruje a zabraňuje jejich další agregaci a precipitaci (He et al., 2005). Mapování peptidů navíc odhalilo vazebná místa pro kolagen na C-konci DMP1 (He a George, 2004). Pozdější experimenty prokázaly, že v přítomnosti kolagenu typu I jak rDMP1 plné délky, tak fosforylovaný nativní DMP1 (p-DMP1) indukují nukleaci a růst HAp, zatímco N-koncová doména inhibuje tvorbu HAp a stabilizuje amorfní minerální fázi (Gajjeraman a kol., 2007). Zajímavé je, že DMP1 byl lokalizován v peritubulárním dentinu, který postrádá kolagenové fibrily. Toto zjištění naznačuje, že in vivo by se DMP1 mohl podílet na organizaci minerálů mimo kolagenní fibrily a na mineralizaci peritubulárního dentinu (Beniash et al., 2011). Další studie přispějí k lepšímu pochopení této funkce dalšími informacemi, ale je pravděpodobné, že funkce DMP1 je řízena stavem jeho fosforylace. Proto může mít DMP1 dvojí roli zahrnující inhibici růstu krystalů a podporu nukleace minerálů.
DSPP je vysoce exprimován v odontoblastech a přechodně exprimován v ameloblastech (Begue-Kirn et al., 1998; D’Souza et al., 1997). Tento protein se štěpí na dva hlavní produkty: dentinový sialoprotein (DSP) odvozený z N-konce DSPP a dentinový fosfoprotein (DPP) neboli fosforin z C-koncové oblasti. Mutace v genu DSPP byly spojeny s lidskou dentinogenesis imperfecta typu II/III, což naznačuje jeho zapojení do procesu mineralizace (McKnight et al., 2008). Studie na knockoutovaných (KO) myších totiž prokázaly, že delece nebo modifikace proteinu ovlivňuje vývoj dentinu (von Marschall et al., 2012) a mineralizaci, což vytváří podobné defekty jako lidská dentinogenesis imperfecta III (Sreenath et al., 2003). DPP, jeden z produktů štěpení, byl ve skutečnosti objeven mnohem dříve než jeho prekurzor (Veis a Perry, 1967) a je skutečně nejhojnějším NCP v ECM dentinu, tvoří 50 % NCP (MacDougall et al., 1985). DPP je vysoce exprimován a vylučován přímo na frontě mineralizace dentinu polarizovanými odontoblasty (D’Souza et al., 1997). Tento protein je považován za nosič fosfátů, protože 85-90 % Ser zbytků je fosforylováno (Butler et al., 1983; Fujisawa a Sasaki, 1983; Sabsay et al., 1991). Testy vazby DPP na kolagenové fibrily ukázaly, že DPP se váže na specifický pás v oblasti díry kolagenu, což naznačuje možnou regulaci ukládání minerálů v oblasti mezery (Traub et al., 1992). Kromě toho vysoké množství Asp a fosforylovaného serinu činí z DPP velmi polyaniontovou makromolekulu, která váže velké množství vápníku s relativně vysokou afinitou. Fragment DSP exprimovaný odontoblasty a vylučovaný do ECM je méně hojný. Studie využívající podmíněné DPP-KO myši k izolaci role DSP ukázaly částečnou záchranu fenotypu s významnou tvorbou objemu dentinu, ale s nižší minerální hustotou. Na základě těchto výsledků autoři navrhli, že by se DSP mohl podílet na iniciaci mineralizace dentinu (Suzuki et al., 2009).
Důležitou roli mohou hrát i další méně zkoumané proteiny. V dentinu však potenciální funkce během dentinogeneze dosud nebyla objasněna. Například BSP, původně izolovaný z kosti, vykazuje silné vazebné vlastnosti Ca+ 2 (Zurick et al., 2013). In vitro bylo prokázáno, že BSP podporuje nukleaci HAp interakcí s kolagenem (Baht et al., 2008). Podobně OPN je negativně nabitý kyselý protein, který obsahuje kolagenovou vazebnou část (Lee et al., 2007). Několik studií in vitro odhalilo, že OPN má buď inhibiční, nebo zesilující účinek na tvorbu HAp v závislosti na úrovni jeho fosforylace a koncentraci (Gericke et al., 2005; Hunter et al., 1994, 1996; Pampena et al., 2004). Jeden z mechanismů, který by vysvětloval jeho inhibiční účinek, je založen na adsorpci fosfátových skupin na krystal HAp, což brání dalšímu růstu krystalů, ale konkrétní interakce není dosud zcela objasněna (George a Veis, 2008). S předpokládanou úlohou ve fosfátové homeostáze je MEPE vysoce exprimován v diferencovaných odontoblastech a bylo prokázáno, že inhibuje mineralizaci (MacDougall et al., 2002). Kyselý motiv bohatý na serin/asparagovou kyselinu, který se nachází na C-konci MEPE, byl po enzymatickém štěpení identifikován jako silný inhibitor mineralizace (Addison et al., 2008; Salmon et al., 2013). Nedávná studie uvádí abnormální lokalizaci MEPE a OSP v lidském dentinu u pacientů s křivicí X-hypofosfatemie (XLH), což naznačuje roli obou proteinů v narušené mineralizaci dentinu pozorované u XLH (Salmon et al., 2014).
Všechny tyto proteiny jsou aktivními hráči v procesu mineralizace a vykazují multifunkční role, které ovlivní mineralizaci. Tyto proteiny budou působit buď na inhibici, nebo na podporu mineralizace v závislosti na jejich koncentraci, fosforylovaném stavu, stupni dalších posttranslačních modifikací a na tom, zda jsou přítomny v roztoku, nebo jsou vázány na nějakou složku ECM.