Zásady sestavování získané ze studií in vitro
Funkční bakteriální ribozomální podjednotky 30S a 50S lze rekonstituovat in vitro z rRNA a jednotlivých ribozomálních proteinů. Podrobné studie biochemických a biofyzikálních principů, které jsou základem sestavování ribozomů in vitro, poskytly užitečná paradigmata, jimiž se řídí výzkum biogeneze ribozomů in vivo.
Jedním z prvních principů odhalených těmito experimenty je, že sestavování r-proteinů do ribozomálních podjednotek probíhá hierarchickým způsobem. Rekonstituční studie bakteriálních ribozomálních podjednotek 30S definovaly „montážní mapu“ pro pořadí asociace jednotlivých r-proteinů s rRNA. Na základě pořadí v hierarchii vazeb se r-proteiny označují jako primární (vážou se přímo na rRNA), sekundární (vazba závisí na primárních vazebných proteinech) nebo terciární (vazba závisí na sekundárních vazebných proteinech). Ačkoli se taková mapa závislostí ukázala jako velmi užitečný výchozí bod, neposkytuje žádné informace o kinetice vazby proteinů. Dráha sestavení může spíše do značné míry odrážet pořadí, v jakém jsou jednotlivé r-proteiny nejstabilněji spojeny s rRNA. Mapa sestavování navíc nezohledňuje ani cestu skládání 16S rRNA nezávisle na r-proteinech, ani roli, kterou při sestavování ribozomu hraje nukleolytické zpracování prekurzorů rRNA, k němuž dochází in vivo. Nedávno byly tyto aspekty sestavování podjednotky 30S podrobněji prozkoumány pomocí technik, jako je chemické a hydroxylové radikálové zkoumání konformace RNA, aby se zjistily změny konformace rRNP v čase, a pulzní/masové spektrometrie (PC/MS), aby se určila kinetika vazby r-proteinu na rRNA.
Možným vysvětlením pozorování primárních vazebných r-proteinů v mapě sestavení je, že jejich vazebná místa jsou alespoň částečně vytvořena konformací, kterou 16S rRNA zaujímá nezávisle na r-proteinech. V souladu s touto myšlenkou a názorem, že ribozomy se vyvinuly z RNA katalyzátoru, bylo totiž prokázáno, že 5′ doména 16S rRNA se může skládat a vytvářet terciární kontakty v nepřítomnosti všech r-proteinů. Tato terciární struktura pravděpodobně není v nepřítomnosti proteinových kontaktů zcela stabilní, a proto je s největší pravděpodobností stabilizována vazbou r-proteinů na místa, která vznikají přechodnými konformacemi přijatými rRNA při jejím skládání. Druhý princip tedy naznačuje, že skládání rRNA poskytuje základ vazby r-proteinů během sestavování ribozomu.
Třetí princip, který vyplynul ze studií bakteriálních ribozomů in vitro, je, že s postupujícím sestavováním ribozomu dochází k posilování vazby r-proteinů s rRNA. Mnoho r-proteinů se dotýká více nukleotidů na rRNA. Časově rozlišený hydroxylový radikálový footprinting odhalil, že některé z těchto nukleotidů jsou chráněny dříve než jiné, což naznačuje, že s postupující biogenezí ribozomů navazují r-proteiny více kontaktů s rRNA, čímž se stabilněji integrují s ribozomy.
Počáteční vytvoření několika kontaktů mezi r-proteiny a rRNA potenciálně stabilizuje určité konformace RNA a vyvolává změny v konformaci rRNA, které poskytují vazebná místa pro další (sekundární nebo terciární) r-proteiny. Vazba r-proteinů tedy upevňuje zisky ze skládání RNA a dodává procesu skládání směrovost. To naznačuje model, v němž sestavování probíhá prostřednictvím střídavé řady konformačních změn RNA a vazby proteinů, které postupně stabilizují konečnou strukturu RNA. Kinetické údaje odhalily, že sestavování zralých podjednotek 30S probíhá prostřednictvím více paralelních cest skládání RNA, které se všechny sbíhají ke konečnému produktu. To vedlo k pojetí krajiny sestavování jako protikladu k jedinečné cestě, po které probíhá sestavování ribozomálních podjednotek.
Studie in vitro nakonec odhalily, že sestavování ribozomů probíhá ve směru od 5′ ke 3′. PC/MS a chemické sondování sekundární struktury rRNA ukázaly, že vazbu r-proteinu na 5′ doménu rRNA lze pozorovat dříve, než dojde ke kontaktu proteinu s 3′ doménou rRNA. Naproti tomu testy otisků hydroxylových radikálů ukázaly počáteční výbuch ochrany nukleotidů po celé délce 16S rRNA, což naznačuje, že při skládání RNA se nukleotidy skládají z mnoha různých míst rozprostřených po celé RNA, a ukazuje tak na nedostatek 5′ až 3′ směrovosti při skládání. Tato protichůdná pozorování lze smířit, vezmeme-li v úvahu povahu různých experimentálních uspořádání. PC/MS měří kinetiku vazby proteinu na rRNA, a proto lze detekovat pouze stabilní interakce mezi r-proteinem a rRNA, protože r-proteiny, které se během pulzu slabě vážou, mohou být během pronásledování vymyty. Naproti tomu footprintingové testy mohou zachytit ochranu nukleotidů jak slabě interagujícími, tak stabilně asociovanými r-proteiny. Celkově tyto údaje naznačují, že zatímco sestavování ribozomů může probíhat napříč celou rRNA, ke konečnému těsnému spojení r-proteinů s rRNA dochází ve směru od 5′ k 3′.
Je důležité zvážit, jak tyto experimenty in vitro mohou nebo nemusí odrážet sestavování in vivo. Například když dochází k sestavování ribozomů in vivo, je spojeno s transkripcí rRNA, která pravděpodobně také přispívá k pozorovanému směru 5′ až 3′ asociace r-proteinů. rRNA se mohla vyvinout tak, aby se při syntéze skládala 5′ až 3′, a tím začlenila r-proteiny, čímž se sestavování spojilo s transkripcí rRNA. Kromě toho požadavek na zahřívací krok při rekonstituci ribozomálních podjednotek in vitro a identifikace řady bakteriálních mutantů, které jsou defektní v produkci ribozomů, naznačují potřebu trans působících faktorů během biogeneze ribozomů in vivo.
.