Biosyntéza trans-4-hydroxyprolinu rekombinantními kmeny Corynebacterium glutamicum a Escherichia coli

Konstrukce rekombinantních kmenů produkujících trans-Hyp

V databázi je několik genů, o kterých se spekuluje jako o předpokládaných genech pro L-prolin 4-hydroxylázu, včetně genů u Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 a Dactylosporangium. sp. Pomocí PCR jsme klonovali a získali předpokládané geny P4H z P. stutzer a B. bronchiseptica RB50, nazvané p4hP a p4hB. Po štěpení byly ligovány do odpovídajících plazmidů a převedeny do C. glutamicum, resp. do E. coli. Délka p4hP byla 918 bps, zatímco délka p4hB byla 924 bps. Tyto sekvence byly 100% identické s geny uvedenými v NCBI. Gen trans-P4H z Dactylosporangium sp. (p4hD) byl úspěšně exprimován v E. coli a může transformovat L-prolin s dobrými enzymatickými vlastnostmi . Délka genu p4hD byla 816 bps a kódoval polypeptid o 272 aminokyselinách a molekulové hmotnosti 29 715 daltonů . V této studii byl p4hD použit s některými modifikacemi na jaderných bázích. Byla analyzována původní sekvence genu p4hD (http://www.kazusa.or.jp/codon/) a výsledky ukázaly, že existují některé vzácné kodony pro C. glutamicum i E. coli. Bylo zjištěno, že vzácné kodony jsou silně spojeny s nízkou úrovní exprese proteinu . Bylo často prokázáno, že optimalizace kodonů pro heterologní expresi proteinů drasticky zvyšuje expresi proteinů . Proto byly vzácné kodony genu p4hD nahrazeny kodony používanými s vysokou frekvencí v C. glutamicum a obsah GC byl upraven ze 73 % na 61 % prostřednictvím synonymní konverze, která byla blízká obsahu GC v C. glutamicum. Modifikovaný gen p4hD byl syntetizován podle výše uvedených úprav (Additional file 1).

Exprese P4H je jedním z důležitých aspektů na výstavbě biosyntetické dráhy trans-Hyp. Obrázek 2 ukazuje SDS-PAGE trans-P4H exprimovaných v rekombinantním C. glutamicum a E. coli. Všechny rekombinantní trans-P4Hs byly exprimovány jako rozpustné proteiny bez inkluzních tělísek. Bylo zřejmé, že rekombinantní trans-P4Hs v E. coli byly exprimovány mnohem více než v C. glutamicum (obr. 2). Na expresi cizorodých proteinů má vliv mnoho faktorů, včetně promotorů, systému hostitel-vektor a kultivačních podmínek atd. Vzhledem k tomu, že se jednalo o první expresi trans-P4Hs v C. glutamicum, budou v naší budoucí práci zváženy komplexnější studie, jako je výběr promotoru a optimalizace kultivačních podmínek.

Srovnání aktivit P4H

Oxygenázy mají široké uplatnění v průmyslu, protože mohou katalyzovat vysoce specifickou oxyfunkcionalizaci neaktivovaných vazeb C-H za mírných podmínek, zejména přenos molekulárního kyslíku na substrát . P4H patří do rodiny dioxygenáz závislých na 2-oxokyselinách, které jsou monomerním proteinem a využívají spíše monomerní než polymerní substráty . V této studii byly měřeny aktivity trans-P4H pomocí rekombinantních celých buněk (tabulka 1). Naše údaje ukázaly, že hladina exprimovaného proteinu a enzymatická aktivita byla vyšší při 30 °C. Výsledky také ukázaly, že plazmidy byly velmi stabilní, protože stabilita plazmidů rekombinantních kmenů E. coli a C. glutamicum byla na konci fermentace u všech více než 98 %.

Rekombinantní buňky s expresí různých genů vykazovaly různé úrovně katalytických aktivit vůči L-prolinu. Aktivita trans-P4H exprimovaného kmenem E. coli BL21/ pET28a-p4hD byla nejvyšší ze všech zkonstruovaných rekombinantních kmenů. Nové klonované a exprimované geny z P. stutzeri a B. bronchiseptica rovněž vykazovaly zajímavé aktivity. Pokud jde o různé hostitelské kmeny, E. coli byla zastoupena lépe než C. glutamicum, což může souviset s výkonností příslušného plazmidu. Jako expresní hostitelské kmeny byly použity čtyři kmeny C. glutamicum produkující L-prolin a výsledné rekombinantní kmeny vykazovaly různé enzymatické aktivity. Nejvyšší specifická enzymatická aktivita mezi kmeny C. glutamicum byla 40,7 U/mg – vlhké buňky u C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB. Specifická enzymatická aktivita rekombinantního kmene E. coli/pET28a -p4hD však dosahovala až 60,4 U/mg mokré buňky. Růst tří rekombinantních kmenů E. coli byl podobný. Mezi rekombinantními kmeny C. glutamicum však byl významný rozdíl. Rekombinantní kmeny C. glutamicum s vyšší specifickou enzymatickou aktivitou rostly méně než kmeny s nižší specifickou enzymatickou aktivitou. Kromě toho byla enzymatická aktivita E. coli BL21 /pET28a -p4hD podobná jako u E. coli W1485/pWFH1 a vyšší než u E. coli BL21/pET24-p4h1 z . p4hD u E. coli W1485/pWFH1 byla původní u Dactylosporangium sp., zatímco p4hD u E. coli BL21/pET24-p4h1 byla modifikovaná. Ačkoli byla optimalizace kodonů v této studii navržena pro C. glutamicum, výsledky ukázaly, že byla úspěšná i u E. coli.

Produkce trans-Hypu v baňkách

Produkce trans-Hypu různými rekombinantními kmeny C. glutamicum a E. coli byla rovněž uvedena v tabulce 1. Výtěžky trans-Hypu těmito rekombinantními kmeny závisely jak na enzymatické aktivitě P4H, tak na růstu buněk. Nejvyšší výtěžek měla E. coli BL21/ pET28a-p4hD, což se shodovalo s její specifickou enzymatickou aktivitou. Ačkoli rekombinantní kmeny E. coli rostly v produkčním médiu podobně, existoval významný rozdíl v produkci trans-Hypu, který si neudržel stejnou úroveň se specifickou enzymatickou aktivitou. Produkce trans-Hypu rekombinantními kmeny C. glutamicum byla také mnohem nižší než u E. coli BL21/pET28a-p4hD. Bylo to způsobeno jak menší expresí trans-P4H, tak menším růstem buněk C. glutamicum. Produkce L-prolinu u čtyř kmenů C. glutamicum byla rovněž nižší než 1 g/l. Mezi rekombinantními kmeny C. glutamicum se stejným genem p4hD byl malý rozdíl v produkci trans-Hypu, přestože některé kmeny měly lepší enzymatickou výkonnost a produkci prolinu.

Při použití rekombinantních kmenů k přímé syntéze trans-Hypu z glukózy fermentací bylo dosaženo, protože byly k dispozici jak enzymy, tak prekurzory potřebné v procesu. Nadměrně exprimované cizorodé trans-P4Hs katalyzovaly hydroxylaci L-prolinu v poloze trans-4, zatímco 2-ketoglutarát byl dodáván glukózou prostřednictvím TCA cyklu a poté oxidativně dekarboxylován na sukcinát (obr. 1). Bylo hlášeno, že prolin byl požadován při výrobě Hyp rekombinantní E. coli pouze s genem p4h. Uhlík v prolinu přidaný během fermentace proudil pouze do aminokyselin syntetizovaných z meziproduktů TCA cyklu a nikoli do glukoneogeneze . Nicméně akumulovaný Hyp byl v této studii na relativně vysoké úrovni i bez přídavku prolinu. Z toho lze vyrozumět, že Corynebacterium mělo výkonnou biosyntetickou dráhu prolinu . Biosyntetická dráha prolinu byla identifikována také u E. coli, což může přispívat k syntéze trans-Hyp rekombinantními kmeny E. coli. Modifikace dráhy prolinu v E. coli zvýšila výtěžnost Hyp, přičemž tvorba Hyp může také zmírnit zpětnovazební inhibici prolinu . Množství prolinu (0-4 mM) podporovalo produkci trans-Hyp. Kontinuální přídavek L-prolinu však výtěžnost produkce výrazně nezlepšil (tab. 2). V této studii byla doba kultivace výrazně kratší než doba uváděná v literatuře, což lze přičíst rozdílným použitým médiím a také naznačuje, že při optimalizaci existuje velký potenciál. Ve skutečnosti bylo v baňkách s malou modifikací média rekombinantní E. coli vyprodukováno 2,28 g/l trans-Hypu bez přidání L-prolinu a 6,72 g/l bylo dosaženo přidáním pouze 4 mM L-prolinu.

Pro další zvýšení biosyntézy trans-Hyp rekombinantní C. glutamicum a E. coli je třeba zvážit i alternativní přístupy. U E. coli by měla být překonána degradace prolinu. Ačkoli produkce trans-Hypu mutantem putA E. coli nebyla dále zlepšena, výtěžek na základě využitého prolinu se výrazně zvýšil. Jak u C. glutamicum, tak u E. coli se exprese rekombinantní P4H jako jedné z oxygenáz podílí na fyziologickém metabolismu hostitelských buněk včetně kofaktoru, ko-substrátu a kyslíku. Navíc bez výkonné syntetické dráhy prolinu v E. coli bude dostupnost a transport substrátu vážně omezovat transformaci

.