- Abstract
- 1. Úvod
- 2. Kazuistika (klinický popis)
- 3. Metody
- 3.1. Varianta c.1596A>G (p.Lys533Glu). Strukturní modelování
- 4. Výsledky
- 4.1. Vyhledávání konformačních variací Studium struktury a funkce
- 4.2. Vliv tvorby dimerů
- 5 . Diskuse
- 6. Závěr
- Zkratky
- Dostupnost dat
- Souhlas
- Konflikty zájmů
- Příspěvky autorů
- Financování
- Poděkování
- Poděkování
Abstract
Základní informace. Protein ABCD1 (ATP-binding cassette, subfamily D, member 1) je peroxizomální polotransportér, který umožňuje odbourávání mastných kyselin s velmi dlouhým řetězcem (VLCFA). Patogenní varianty ABCD1 způsobují hromadění VLCFA v různých tkáních a tělesných tekutinách, což vede k poruše zvané X-vázaná adrenoleukodystrofie (X-ALD). Tato porucha se nejčastěji vyznačuje adrenokortikální insuficiencí a vysokou koncentrací VLCFA a v závislosti na fenotypu má různý stupeň neurologického postižení. Například pouze Addisonova forma X-ALD nemá žádný neurologický dopad, zatímco mozková forma X-ALD často způsobuje těžkou ztrátu smyslů, poruchu motorických funkcí, pokles kognitivních funkcí a smrt. Metody. Nově charakterizovaná a podezřelá patogenní varianta v ABCD1 byla analyzována pomocí naší platformy pro proteinovou informatiku (PIP). Na základě dat z genetického testování byly dokončeny personalizované molekulární studie na úrovni proteinů, které doplnily analýzu a klinickou studii. Výsledky. Je prezentován případ adrenomyeloneuropatie dospělých (AMN) a nové varianty ABCD1. Je diskutován unikátní protein ABCD1 a případ probanda je porovnán s existujícími zprávami o AMN. Závěry. Fúze dat z více zdrojů byla zkombinována do komplexního přístupu, který přinesl obohacené hodnocení pacientova onemocnění a prognózy. Na variantě bylo provedeno molekulární modelování pro lepší charakterizaci jejího klinického významu a potvrzení patogenity.
1. Úvod
Protein ABCD1 (ATP-binding cassette, subfamily D, member 1) je součástí nadrodiny ATP-binding cassette transporterů, která se skládá z transmembránových proteinů zodpovědných za přenos lipidů, metabolitů a dalších molekul mezi buňkami nebo intracelulárními strukturami. Je kódován genem ABCD1, který se nachází na Xq28 . ABCD1 je peroxizomální polopřenašeč, který importuje mastné kyseliny s velmi dlouhým řetězcem (VLCFA) do peroxizomu vazbou ATP. Dysfunkční ABCD1 není schopen přesunout VLCFA do peroxizomu, kde se rozloží, což vede k hromadění VLCFA v tělesných tekutinách a tkáních . Tato abnormální hladina VLCFA slouží jako charakteristický biomarker X-vázané adrenoleukodystrofie (X-ALD), nejčastější peroxizomální poruchy . X-ALD je genetické onemocnění spojené především s demyelinizací, neurodegenerací a adrenokortikální insuficiencí . V rámci genu ABCD1 bylo zaznamenáno více než 800 variant . Přesto nebyly pozorovány jasné korelace mezi genotypem a fenotypem .
Hemizygotní muži obvykle vykazují nejvýznamnější příznaky, zatímco u heterozygotních žen se v pozdějším věku často objevuje menší stupeň postižení . Tři klasické fenotypy jsou pouze Addisonova choroba, adrenomyeloneuropatie (AMN) a mozková ALD. U jedinců s pouhou formou Addisonovy choroby se adrenokortikální insuficience obvykle projeví mezi 2. a 7. rokem života. Neurologická degenerace není zpočátku přítomna, ale často se rozvíjí s věkem jedince . AMN obvykle nastupuje ve třetí až čtvrté dekádě života a postihuje především míchu . Přítomným klinickým příznakem je často progresivní ztuhlost a slabost nohou. Nedostatečnost nadledvin se vyskytuje zhruba u 2/3 pacientů s AMN a mozkové změny postihují přibližně polovinu z nich . Mozková ALD je nejzávažnějším fenotypem, kdy mozková demyelinizace způsobuje rychlé zhoršení sluchu, zraku, motorických funkcí a poznávacích schopností . Tato varianta X-ALD se nejčastěji vyskytuje u dětí nebo dospívajících a často končí smrtí do 2-4 let od projevení příznaků .
Tato zpráva podrobně popisuje anamnézu probanda, u kterého byla ve třiceti letech diagnostikována AMN. Molekulární analýza genu ABCD1 identifikovala u tohoto jedince variantu nejistého významu. Zajímavé je, že tato varianta byla v databázi ALD Mutation Database uvedena jako patogenní, ale informace týkající se klinického případu nebyly publikovány. Klinický případ našeho probanda je zařazen pro lepší podporu patogenity této varianty ABCD1. Pro komplexní molekulární modelování byla využita platforma pro proteinovou informatiku (PIP), která dále charakterizuje význam této varianty a objasňuje diagnózu probanda.
2. Kazuistika (klinický popis)
Probandem byl 31letý muž, který se dostavil k vyšetření progresivního neurologického stavu. Příznaky tohoto stavu se poprvé objevily před 2 lety, kdy proband začal stále častěji zakopávat. Později se u něj objevila generalizovaná svalová slabost a ztuhlost spolu s další dysfunkcí chůze. V rámci boje s tímto problémem používal proband posledních 7 měsíců pojízdné chodítko, které mu pomáhalo při chůzi. Vyvinula se u něj také močová inkontinence. Dále udával mozkovou mlhu, ztrátu paměti, poruchy pozornosti, úzkost a únavu. Základní duševní úkoly mu v důsledku toho trvaly déle. Podle probanda užívání alkoholu tyto deficity zhoršovalo. Nakonec proband od začátku svého stavu zhubl o 20 kg a přes veškerou snahu se mu nepodařilo znovu přibrat na váze. Tento úbytek hmotnosti byl částečně způsoben příznaky nevolnosti a zvracení, které se nejčastěji objevovaly ráno.
Při fyzikálním vyšetření nebyl proband schopen vstát ze sedu bez použití rukou. Byla zjištěna mírná ataxická dysartrie. Testy zrakové fixace odhalily řídké záškuby ve tvaru čtvercové vlny. Hladké pronásledování bylo sakadické a vykazoval pomalé, plné sakády ve vertikálním i horizontálním směru. Protahovací reflexy na horních končetinách byly patologicky rychlé. Proband měl také patologicky rychlé mitotické protahovací reflexy na dolních končetinách, včetně trvalého klonu na kotnících. Byla přítomna mírně narušená propriocepce velkých prstů. Na dolních končetinách byla pozorována mírná slabost distribuce horních motorických neuronů s ušetřením iliopsoas. Při testování od paty k bérci byla zjištěna dyssynergie. Při ambulanci se proband díval na nohy a pohyboval se zkráceným krokem. Kolena měl hyperexponovaná, měl tendenci chodit po špičkách a občas mu klouzala chodidla. Byl přítomen Rombergův příznak. Při stání byly přítomny třesavé pohyby nohou – převážně kvadricepsů. Proband se během 3 pokusů otočil o 360 stupňů, což vyžadovalo 9 až 15 kroků na jednu otočku. Jeho posturální reflexy byly abnormální a „Pull“ test byl -3.
MRI mozku byla normální a MRI krční páteře odhalila nálezy svědčící pro mírnou, difuzní atrofii míchy. Nebyla prokázána subakutní kombinovaná degenerace ani jiné získané onemocnění míchy (obr. 1). Byl léčen pro boreliózu, protože jeho titry IgM borelií byly pozitivní, ale nebylo zaznamenáno žádné výrazné zlepšení. Jeho mozkomíšní mok byl popsán jako acelulární. Vyhodnocení HIV, HTLV1, hepatitidy C, hepatitidy B a cytomegaloviru bylo negativní. Rodinnou anamnézu s podobnými příznaky nebylo možné stanovit, protože znalosti probandovy anamnézy byly omezené (obr. 2).
Profil peroxizomálních mastných kyselin probanda byl získán po předchozích vyšetřeních a zobrazovacích vyšetřeních. Byly přítomny abnormální koncentrace C26 : 0, C24/C22 a C26/C22, což naznačovalo hemizygozitu pro X-vázanou adrenomyeloneuropatii. Bylo naměřeno 528 pg/ml adrenokortikotropního hormonu (RR: 7,2-63). Poté byla dokončena sekvenační a deleční/duplikační analýza genu ABCD1. Proband byl hemizygotní pro variantu nejistého významu v genu ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Tato varianta nebyla přítomna v online databázi ExAC, ačkoli byla uvedena jako patogenní v databázi mutací ALD. Dvě podobné varianty, c.1596A>G (p.Lys533Glu) a c.1598A>G (p.Lys533Arg), byly rovněž již dříve hlášeny jako klinicky významné .
3. Metody
3.1. Varianta c.1596A>G (p.Lys533Glu). Strukturní modelování
Sekvence lidského ATP-vazebného kazetového členu podrodiny D 1 (známého jako ABCD1) je pravděpodobně transportní protein, který má nukleotidovou vazebnou oblast se záhybem, který může fungovat jako ATP-vazebná podjednotka s ATPázovou aktivitou. Je známo, že k vytvoření aktivního transportéru je nutná správná dimerizace. ABCD1 je členem podrodiny ALD, která se podílí na peroxizomálním importu mastných kyselin do organel. Tyto peroxisomální ABC transportéry jsou „poloviční transportéry“, což znamená, že vyžadují partnerskou poloviční molekulu transportéru – funkční forma je vždy homodimerní nebo heterodimerní. Předpokládá se, že ABCD1 je klíčový pro peroxizomální transport nebo katabolismus mastných kyselin s velmi dlouhým řetězcem. Je známo, že ABCD1 interaguje s PEX19 a je kódován genem ABCD1, který byl převzat z referenční přístupové sekvence NCBI: NP_000024: verze NP_000024.2, který je kódován pro sekvenci aminokyselin; a byl použit pro počítačem podporované modelování. Na mutantovi byly provedeny simulace Monte Carlo, které umožnily lokální regionální změny pro plnou délku 745 aminokyselin.
Rentgenové upřesnění pro Monte Carlo bylo vytvořeno pomocí metody YASARA SSP/PSSM . Struktura byla relaxována do silového pole YASARA/Amber pomocí potenciálů založených na znalostech v rámci YASARA. Boční řetězce a rotamery byly upraveny pomocí potenciálů založených na znalostech, simulovaného žíhání s explicitním rozpouštědlem a malých ekvilibračních simulací pomocí protokolu pro zjemnění YASARA . Byla modelována celá struktura v plné délce a doplněny všechny mezery nebo nevyřešené části z rentgenového záření.
Zpřesnění finalizovaných modelů bylo dokončeno buď pomocí modulu Schrodinger’s LC-MOD založeného na Monte Carlo, nebo protokolů NAMD2. Tato zpřesnění začala počátečním zpřesněním vygenerovaným systémem YASARA a variantou . Superpozicí a následným zpřesněním překrývajících se oblastí byl získán kompletní model pro ABCD1. Konečné struktury byly podrobeny energetické optimalizaci pomocí PR konjugovaného gradientu s dielektrikem závislým na R.
Soulad atomů byl zkontrolován pro všech 745 aminokyselin (12 201 atomů) modelu plné délky divokého typu (WT) a 745 aminokyselin (12 221 atomů) pro variantu, přičemž byla ověřena správnost názvu řetězce, dihedrálů, úhlů, torzí, nevazeb, elektrostatiky, typizace atomů a parametrů. Předpokládá se model dimeru, který se skládá z 24 402 atomů včetně kofaktorů a iontů. Každý model byl exportován do následujících formátů: Maestro (MAE) a YASARA (PDB). Manipulace s modelem byla provedena pomocí programu Maestro (Macromodel, verze 9.8, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2010) nebo Visual Molecular Dynamics (VMD) . Analýzy byly zdůrazněny na oblast N-konce obsahující prvních 350 aminokyselin vzhledem k délce a vzdálenosti C-konce od místa mutace.
Vyhledávání dynamiky Monte Carlo (hybridní MC nebo prostřednictvím zesíleného vzorkování MDS) bylo dokončeno na každém modelu pro konformační vzorkování pomocí metod dříve popsaných v literatuře . Stručně řečeno, každý systém varianty ABCD1 byl minimalizován s uvolněnými omezeními pomocí Steepest Descent nebo Conjugate Gradient PR, poté se nechal podrobit kritériím vyhledávání MC, jak je uvedeno v literatuře . Hlavním účelem MC je v tomto scénáři zkoumání případné konformační variability, která se může vyskytnout u různých mutací v oblasti v blízkosti mutace, a možného vlivu na vazbu nebo zpracování DNA pomocí ABCD1.
4. Výsledky
4.1. Vyhledávání konformačních variací Studium struktury a funkce
Pro WT versus variantu p.K533E jsme zjistili, že stabilita objektu z energetických výpočtů pro ΔG na aminokyselinu zůstává relativně stejná, takže WT má stabilitu objektu 114,67 kcal/mol∗Å2. Varianta p.K533E způsobuje čisté zvýšení volné energie o 2,321 kcal/a∗mol∗Å2, což by mohlo být destabilizující pro místní oblast . Tato stabilita objektu byla pozitivní, což naznačuje, že při molekulární simulaci pro konformační vzorkování jsou pravděpodobné určité dynamické změny. Proto jsme prozkoumali lokální zbytky a určili, že elektrostatický výpočet může být užitečný pro vysvětlení změny funkce. Molekulární model pro úplnou strukturu a její variantní podobu je uveden (obrázek 3 a)) s použitím našich nejmodernějších metod, které byly zavedeny . Dimerický model je kritický pro funkci a ukazuje důležité interakce v místě mutace, které jsou narušeny variantní mutací.
Lokální rezidua ve vzdálenosti 12 Å v blízkosti místa varianty (p.K533E) zahrnují rezidua z obou monomerů. Monomer obsahující variantu (monomer 1, šedé uhlíky) má následující blízká rezidua s polohou 533-interakce: E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 a K624 (obrázek 3b). Tato variantní struktura (p.Lys533Glu) byla analyzována a bylo naznačeno přímočařejší narušení lokálního prostředí z kladného náboje lysinu (+) převráceného na záporný náboj kyseliny glutamové (-), který dosti narušuje sousední nabité zbytky (výše). Zejména zbytky K624, E499 a Y532 se dostaly do různých interakcí (obrázek 3b). Lokální ΔG na aminokyselinu zvyšuje čistou kladnou hodnotu odpovídající nepříznivé stabilitě v kapse a k určení celkového účinku by byla nutná delší dynamika, ale lze očekávat, že bude destabilizující. Zbytek K533E má zajímavé interakce s Q472, I474, I475 a E499. K533E se nachází v oblasti šroubovice-šroubovice, kde je jeho nabitý postranní řetězec umístěn směrem ven k opačně nabitým druhům; existuje také určitá interakce šroubovice-šroubovice se sousedními šroubovicemi (obrázky 3b) a 3c). Ve variantě jsou zapojena stejná rezidua, ale pozice je změněna u několika reziduí včetně P534, P535 a K624 (obrázek 3(c)). Tato interakce by mohla být příčinou změny funkce v důsledku změny dynamického chování pro lokální strukturální stabilitu (obrázek 3c). Pro další analýzu byly dokončeny elektrostatické výpočty (obrázek 4). Zejména zbytky K624, E499 a Y532 jsou umístěny do různých interakcí (obrázek 3b). Lokální ΔG na aminokyselinu zvyšuje čistou kladnou hodnotu odpovídající nepříznivé stabilitě v kapse a k určení celkového účinku by byla nutná delší dynamika, ale lze očekávat, že bude destabilizující.
4.2. Vliv tvorby dimerů
Zobrazení elektrostatiky bylo provedeno pomocí Poissonova-Boltzmannova výpočtu pro solvataci na celé struktuře 745 aminokyselin. Vliv změn se silně projevil na elektrostatickém rozložení s mezní hodnotou +3 KT/E pro oba. Částice WT (všech 745 aa) vykazuje výrazné rozložení náboje v okolí K533, které vykazuje málo záporně nabitých oblastí a velké neutrální kapsy v důsledku bohatých hydrofobních zbytků nacházejících se ve výše zmíněných šroubovicích. Zdá se, že mutace threoninu mění rozložení nábojů a umisťuje pozice pro záporné náboje dále od sebe a zároveň zvětšuje velikost neutrálně nabitých oblastí (obr. 4(a) a 4(b)). Lokální oblast p.K533E je nabitá tak, že odpovídá kladnému lysinovému zbytku se sousedními zbytky kyseliny glutamové (v rozmezí 6 Å) (obrázek 4(b)). Naopak zbytek K533 má kladné náboje, které jsou ovlivněny zbytky ve vzdálenosti 6 Å, konkrétně E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 a K624 (obrázek 4(a)) . Zdá se, že varianta p.K533E nemá žádný vliv na samotný dimer (obrázky 3 a 4), protože se nachází distálně od rozhraní mezi monomery. Dochází však k výraznému narušení v lokálním okolí, kde je lysin nativně vložen do kapsy se svými blízkými zbytky, které jsou opačně nabité a zapojují se do H-vazby a interakcí solného můstku, což se ztrácí se záporným nábojem ze záměny kyseliny glutamové (obr. 3).
5 . Diskuse
Pro pacienty s AMN jsou v současné době možnosti léčby omezené. Nedávný výzkum s myšími modely však představuje potenciální řešení. U pacientů s X-ALD je hromadění VLCFA doprovázeno zvýšenou hladinou radikálových forem kyslíku. Tyto radikály jsou hnacím motorem progrese onemocnění, poškozují tkáně a nakonec způsobují vznik neurologických příznaků. Myši s analogy X-ALD byly úspěšně léčeny směsí antioxidantů, čímž se hladina radikálů dostala pod kontrolu a tento patogenní proces se zastavil . Pokud se pozdější pokusy nadále ukáží jako slibné, je možné, že náš proband a další pacienti s AMN budou jednoho dne léčeni podobným způsobem.
Ačkoli se u našeho probanda vyskytovala špatně pochopená varianta v ABCD1, jeho případ se nijak výrazně nelišil od typického fenotypu AMN. Příznaky začaly v jeho pozdních dvaceti letech, což přesně zapadá do očekávaného věkového rozmezí 20 až 40 let. Pro AMN je typické postižení míchy, což potvrdila i probandova magnetická rezonance. Jeho slabost nohou a poruchy chůze jsou pro toto onemocnění charakteristické, stejně jako močová inkontinence. Zvracení a nevolnost jsou spojeny s nedostatečností nadledvin, zatímco řeč a mentální abnormality probanda by mohly souviset s mozkovými změnami . Přesto je třeba říci, že pacient, který má stejnou variantu ABCD1 vyjádřenou naším probandem, by mohl mít odlišné příznaky. Patogenní varianty v ABCD1 zřídka vedou k předvídatelným fenotypům – dokonce i když identickou verzi mají členové rodiny .
Proteinová informatika odvozená z výpočtů statistické mechaniky aplikovaných na molekulární modelování pro varianty oproti divokému typu nám dává jasné indicie pro dysfunkci normálního chování proteinu na molekulární úrovni, která by ovlivnila funkci. Například jsme zjistili, že varianta p.K533E způsobuje čisté zvýšení volné energie o 2,321 kcal/aamolÅ2, což destabilizuje lokální oblast do 12 Å od zbytku K533. Vzhledem k lokální strukturní změně zmírněné prostřednictvím páteřních zbytků a změn sekundárních strukturních interakcí (síť H-vazby není zobrazena) umožňují korelačnímu pohybu šířit se po celé struktuře, což dále frustruje správnou tvorbu dimeru.
Vzhledem k vzácnosti varianty ABCD1 našeho probanda nebyla komerční laboratoř schopna s jistotou označit tuto variantu za patogenní. Navíc logistické problémy a malá velikost rodiny probanda způsobily, že rodinná segregační analýza byla nepraktická. V důsledku toho nemohl být tento proces dokončen, aby nám pomohl lépe pochopit význam jeho varianty. Naštěstí nám molekulární modelování poskytlo další příležitost. Molekulární modelování proteinu podpořilo podezření, že tato varianta ovlivní funkci proteinu klinicky významným způsobem. Bylo bez jakéhokoli podezření, že by tato varianta nebyla klasifikována jako patogenní vzhledem k hrubé změně struktury, což silně podpořila analýza PIP.
6. Závěr
Závěrem uvádíme probanda se vzácnou variantou v ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Nedostatek informací o této variantě zabránil společnosti provádějící genetické testování klasifikovat jeho variantu jako patogenní, ale molekulární náboje zřejmě naznačují, že tato oblast proteinu je výrazně vychýlena z rovnováhy (obrázek 3b). Využití modelování proteinu také poskytlo informace pro začlenění do širšího klinického obrazu probanda. Kromě toho je jeden případ patogenity této varianty uveden v databázi mutací ALD. Kombinace těchto důkazů umožnila s jistotou stanovit diagnózu AMN. Náš proband měl typické příznaky AMN, ale fenotypová variabilita vlastní ABCD1 by mohla vést k odlišnému projevu X-ALD u jiných jedinců s touto variantou.
Zkratky
| ABCD1: | ATP-vázající kazeta, podrodina D, člen 1 (gen) |
| VLCFA: | Mastné kyseliny s velmi dlouhým řetězcem |
| X-ALD: | X-vázaná adrenoleukodystrofie |
| AMN: | Adrenomyeloneuropatie. |
Dostupnost dat
Soubory dat a materiálů jsou podrobně popsány v rukopise.
Souhlas
Všechny použité postupy byly v souladu s etickými normami příslušné komise pro pokusy na lidech (institucionální a národní) a s Helsinskou deklarací z roku 1975, revidovanou v roce 2000 (5). Od všech pacientů byl získán informovaný souhlas se zařazením do studie.
Konflikty zájmů
Všichni autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.
Příspěvky autorů
Všichni výše uvedení autoři se významně podíleli na koncepci nebo návrhu práce; nebo na získávání, analýze nebo interpretaci údajů pro práci A vypracování návrhu práce nebo její kritické revizi s ohledem na důležitý intelektuální souhlas A dali konečný souhlas s verzí, která má být publikována A souhlasili s tím, že budou zodpovědní za všechny aspekty práce při zajištění toho, že otázky týkající se přesnosti nebo integrity jakékoli části práce budou náležitě prozkoumány a vyřešeny.
Financování
Financování poskytlo Centrum individualizované medicíny na klinice Mayo, které poskytlo finanční prostředky na dokončení této studie.
Poděkování
TC děkuje Centru individualizované medicíny na klinice Mayo v Jacksonville za podporu výzkumu.
Poděkování
TC děkuje za podporu výzkumu.