Diagnostická síla laboratorních testů pro hereditární sférocytózu: Srovnávací studie u 150 pacientů seskupených podle molekulárních a klinických charakteristik

Abstrakt

Východiska: Laboratorní diagnostika hereditární sférocytózy se běžně opírá o testy osmotické fragility červených krvinek založené na NaCl nebo glycerolu; nedávno byl navržen test zaměřený přímo na molekulární defekt hereditární sférocytózy (test vazby eosin-5′-maleimidu). Žádný z dostupných testů neidentifikuje všechny případy hereditární sférocytózy.Návrh a metody Srovnávali jsme účinnost testu vazby eosinu-5′-maleimidu, studií NaCl-osmotické křehkosti na čerstvé a inkubované krvi, testu glycerolové lýzy, testu acidifikované glycerolové lýzy a Růžového testu na sérii 150 pacientů s hereditární sférocytózou rozdělených do skupin podle klinického fenotypu a defektního proteinu s konečným cílem najít kombinaci testů spojenou s nejvyšší diagnostickou silou i u nejlehčích případů hereditární sférocytózy.Výsledky Test vazby eosin-5′-maleimidu měl 93% senzitivitu a 98% specificitu pro detekci hereditární sférocytózy: senzitivita byla nezávislá na typu a množství molekulárního defektu a na klinickém fenotypu. Test lýzy okyseleným glycerolem a Pinkův test vykazovaly srovnatelnou citlivost (95 % a 91 %). Citlivost testů osmotické fragility NaCl, které jsou běžně považovány za zlatý standard pro diagnostiku hereditární sférocytózy, byla 68 % u čerstvé krve a 81 % u inkubované krve a dále se snížila u kompenzovaných případů (53 % a 64 %). Kombinace eosin-5′-maleimidového vazebného testu a testu lýzy okyseleným glycerolem umožnila identifikovat všechny pacienty s hereditární sférocytózou. Test s vazbou eosin-5′-maleimidu vykazoval největší specifičnost pro toto onemocnění. závěry Každý typ testu nedokáže diagnostikovat některé případy hereditární sférocytózy. Spojení eosin-5′-maleimid-vázacího testu a testu lýzy okyseleným glycerolem umožnilo identifikovat všechny pacienty s hereditární sférocytózou v této sérii, a proto představuje v současnosti účinnou diagnostickou strategii hereditární sférocytózy včetně mírných/kompenzovaných případů.

Úvod

Hereditární sférocytóza je nejčastější vrozená hemolytická anémie u bělochů, která postihuje přibližně 1 z 1000-2000 jedinců.1,2 Molekulární defekt je velmi heterogenní a zahrnuje geny kódující spektrin, ankyrin, band 3 a protein 4.2,3 a stupeň hemolýzy se značně liší, od plně kompenzované až po anémii závislou na transfuzích.

Typickým laboratorním znakem hereditární sférocytózy, i když ne specifickým, je přítomnost sférocytů v nátěru periferní krve, které jsou detekovatelné u 97 % pacientů.4 U některých pacientů4,5 však může být sférocytů velmi málo, a proto je k jejich detekci nutná kvalifikovaná obsluha; v éře laboratorní automatizace se navíc stále častěji upouští od mikroskopického vyšetření erytrocytů. Laboratorní diagnostika hereditární sférocytózy se proto běžně opírá o testy, které využívají poměr plochy povrchu a objemu, typicky snížený u sférických erytrocytů, zejména testy osmotické fragility červených krvinek při různých koncentracích chloridu sodného (NaCl) na čerstvé a inkubované krvi6 a testy, které měří rozsah nebo rychlost lýzy červených krvinek suspendovaných v pufrovaných roztocích glycerolu, tj.glycerolový lyzační test (GLT)7 , acidifikovaný glycerolový lyzační test (AGLT)8 a Růžový test9. Tyto testy však nezachytí různou část případů hereditární sférocytózy, zejména těch nejlehčích,6,10-12 a neodliší hereditární sférocytózu od sekundární sférocytózy spojené s jinými stavy, zejména autoimunitními hemolytickými anemiemi.13-15

Nejnověji byly jako nové metody pro identifikaci hereditární sférocytózy navrženy test kryohemolýzy,16,17 založený na pozorování, že červené krvinky pacientů s hereditární sférocytózou jsou zvláště citlivé na ochlazení při 0 °C v hypertonických podmínkách, a průtoková cytometrická analýza intaktních červených krvinek značených eosin-5′-maleimidem (test vazby EMA)18 . Zejména posledně jmenovaný test se ukázal jako citlivý a specifický diagnostický test pro hereditární sférocytózu12,18,20-29 zaměřený přímo na strukturální změnu tohoto onemocnění, protože fluorescenční sonda, eosin-5′-maleimid, interaguje s proteinovým komplexem band 3.30

Výkon dostupných přímých nebo nepřímých diagnostických testů byl většinou hodnocen individuálně a na omezeném počtu případů. Citlivost testů se značně liší a každá metoda nedokáže identifikovat několik pacientů s hereditární sférocytózou.4,6,12 V této studii jsme na souboru 150 pacientů s hereditární sférocytózou rozdělených do skupin podle klinického fenotypu a molekulárního postižení porovnávali výsledky testů vazby EMA, osmotické fragility čerstvé a inkubované krve indukované NaCl, GLT, AGLT a Pink s konečným cílem najít kombinaci testů spojenou s nejvyšší diagnostickou silou hereditární sférocytózy, včetně nejlehčích případů, které jsou obvykle obtížně diagnostikovatelné.

Design a metody

Subjekty

Bylo vyšetřeno sto padesát po sobě jdoucích pacientů s hereditární sférocytózou (79 mužů a 71 žen, medián věku 26 let, rozmezí 0-79 let) patřících do 128 nepříbuzných rodin. V době studie bylo 22 pacientů po splenektomii a 128 pacientů nebylo po splenektomii.

Všichni pacienti podstoupili klinické a fyzikální vyšetření a následující laboratorní testy: kompletní krevní obraz, vyšetření krevního nátěru, počet retikulocytů, stanovení koncentrace bilirubinu a haptoglobinu, posouzení stavu železa, přímý antiglobulinový test (DAT), screening abnormálních nebo nestabilních hemoglobinů, test osmotické křehkosti NaCl na čerstvé a inkubované krvi, GLT, AGLT, Pink test a test vazby EMA. V některých případech byla vyšetřena aktivita nejdůležitějších enzymů glykolytické a pentózofosfátové dráhy. U několika pacientů byl také proveden mitogenem stimulovaný DAT31 k vyloučení diagnózy DAT-negativní hemolytické anémie.

Heditární sférocytóza byla diagnostikována na základě klinických a laboratorních známek chronické hemolýzy, přítomnosti sférocytů při vyšetření nátěru periferní krve, pozitivity alespoň jednoho testu fragility červených krvinek, případné rodinné anamnézy hereditární sférocytózy a vyloučení jiných příčin sekundární sférocytózy.19 Anémie byla definována jako těžká (Hb<8 g/dl), středně těžká (Hb 8-10 g/dl), lehká (Hb>10 a <11,5 g/dl u žen a Hb>10 a <13,5 g/dl u mužů) a kompenzovaná (Hb>11,5 g/dl u žen a >13,5 g/dl u mužů).

Vzorky od všech pacientů byly podrobeny polyakrylamidové gelové elektroforéze s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) pro analýzu membránových proteinů červených krvinek a rozděleny podle toho, zda se jednalo o nedostatek pásu 3, spektrinu nebo ankyrinu, kombinovaný nedostatek spektrinu/ankyrinu a žádný detekovatelný defekt.4

Pět set sedmdesát pět zdravých dárců krve a 84 případů s hemolytickou anémií jinou než hereditární sférocytóza (17 s autoimunitní hemolytickou anémií, 10 s poruchami enzymů červených krvinek, 10 s hereditární eliptocytózou, 15 s vrozenou dyserytropoetickou anémií, 9 s paroxyzmální noční hemoglobinurií, 3 se stomatocytózou, 3 s mechanickou anémií a 17 s anémií neznámé příčiny).

Hematologická vyšetření

Periferní krev byla odebrána pacientům a kontrolním osobám během diagnostických postupů po získání informovaného souhlasu a schválení institucionální komisí pro výzkum na lidech. Použité postupy byly v souladu s mezinárodními etickými normami pro pokusy na lidech z Helsinek. Převážná většina vzorků byla odebrána v našem ústavu; vzorky odebrané z jiných center byly odeslány při zachování teploty 4 °C a zpracovány vždy do 24 h. Všechna vyšetření byla provedena na jednom pracovišti. Žádnému z pacientů nebyla během 3 měsíců předcházejících studii podána transfuze. Hematologické parametry byly stanoveny na automatickém hematologickém analyzátoru (Automatic Beckman Coulter LH-750, CA, USA). Rutinní hematologická vyšetření byla prováděna podle Dacie &Lewise.32 Hladiny bilirubinu, haptoglobinu a feritinu byly stanoveny pomocí přístroje Integra 800 (Roche, Mannheim, Německo). Počet sférocytů v periferní krvi hodnotili dva nezávislí a odborní operátoři. Osmotická fragilita červených krvinek byla hodnocena provedením testu osmotické fragility NaCl na čerstvé i inkubované krvi,6 standardního GLT,7 AGLT8 a Růžového testu9 na vzorcích od každého pacienta.

Test vazby EMA byl proveden podle popisu Kinga et al.18 s drobnými úpravami. Konkrétně byla intenzita fluorescence vyjádřená jako medián fluorescence kanálu stanovena pro 10 000 událostí v kanálu FL-1 pomocí průtokového cytometru Becton Dickinson FACSCanto II (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Zásobní roztok barviva EMA byl uchováván v malých alikvotech při -80 °C po dobu 6 měsíců. Test byl prováděn jednou týdně seskupením všech případů ve stejný den25 po potvrzení reprodukovatelnosti výsledků na krevních vzorcích uchovávaných až 6 dní při 4 °C.

V zájmu snížení variability uvnitř testu byly vzorky pacientů porovnány se vzorky šesti normálních kontrol. Výsledky byly vyjádřeny jako procento snížení fluorescence vzorku pacienta ve srovnání s průměrnou fluorescencí šesti normálních kontrol, jak navrhl Girodon et al.25 Ke stanovení optimální hranice mezi hodnotami od pacientů s hereditární sférocytózou a hodnotami od normálních jedinců byla použita křivka ROC (receiver operating characteristic) založená na logistické regresní analýze. Podle analýzy křivky ROC byl optimální pokles fluorescence pro oddělení normálních osob od pacientů s hereditární sférocytózou 11 %. Za těchto podmínek byla specificita testu vypočtená na 575 zdravých osobách 98 %.

Duchy červených krvinek byly připraveny do 24 hodin od odběru krve metodou popsanou Dodgem a spol.33 s drobnými úpravami.4 Membránové proteiny červených krvinek byly analyzovány do 15 dnů od přípravy duchů pomocí SDS-PAGE s použitím gradientu akrylamidu od 4 % do 12 % podle Fairbankse a spol.34 a diskontinuálního pufrovacího systému Laemmliho35 s lineárním gradientem akrylamidu od 6 % do 14 %, jak bylo popsáno dříve.4 Aktivity enzymů glykolytické a pentózofosfátové dráhy byly stanoveny metodami popsanými Beutlerem.36

Výsledky

Tabulka 1 uvádí hematologické a biochemické údaje pacientů s hereditární sférocytózou rozdělených do skupin podle toho, zda nebyli splenektomováni, nebo byli splenektomováni před provedením studie, a podle klinického fenotypu (pouze u pacientů bez splenektomie). Většina nesplenektomovaných osob měla mírnou až kompenzovanou hemolýzu; 18 % mělo velmi málo sférocytů (≤ 3 %). Nejčastějšími proteinovými abnormalitami byly deficity spektrinu a bandu 3 jak u nesplenektomovaných, tak u splenektomovaných pacientů. Defekt membránových proteinů nebyl detekován u devíti (7 %) nesplenektomovaných osob, z nichž sedm mělo pozitivní rodinnou anamnézu hereditární sférocytózy; zbývající dvě osoby vykazovaly mírnou anémii, retikulocytózu a 5 % sférocytů při absenci jiných příčin chronické hemolytické anémie.

Tabulka 2 porovnává citlivost diagnostických laboratorních testů pro hereditární sférocytózu. Vazba EMA nedokázala identifikovat 10/150 (7 %) případů (4 s defektem band 3, 5 s defektem spektrinu a 1 s nezjištěným defektem). Průměrný pokles fluorescence byl 27 % ± 10 % u pacientů s hereditární sférocytózou oproti 0 % ± 8 % u referenčních subjektů (P<0,001). Procentuální snížení fluorescence přímo souviselo s počtem sférocytů a nepřímo se středním tělním objemem; nebyla zjištěna žádná korelace s koncentrací hemoglobinu, absolutním počtem retikulocytů nebo šířkou distribuce červených krvinek. Citlivost testu byla nezávislá na typu a množství molekulárního defektu, i když byla mírně nižší u pacientů s nezjištěnými defekty, kteří měli nejmenší medián poklesu fluorescence (15 % oproti 30 % a 28 % u deficitu pásma 3 a spektrinu). Za zmínku stojí, že citlivost testu vazby EMA byla mírně vyšší u splenektomovaných než u nesplenektomovaných pacientů (obr. 1).

Senzitivita různých zkoumaných testů fragility červených krvinek byla velmi variabilní a obecně vyšší u splenektomovaných než u nesplenektomovaných pacientů s hereditární sférocytózou a nižší (s výjimkou AGLT) u pacientů s nezjištěnými defekty než u pacientů s detekovatelnými defekty (tab. 2A). Pokud jde o test osmotické křehkosti NaCl, citlivost byla vyšší, pokud byl proveden na inkubované krvi, než na čerstvé krvi. Celkově měly testy osmotické křehkosti NaCl (jak na čerstvé, tak na inkubované krvi) nižší citlivost než častěji používané testy na bázi glycerolu. Z posledně jmenovaných testů měl AGLT nejvyšší citlivost, a to i v případech s nezjištěnými defekty, srovnatelnou s citlivostí testu vazby EMA.

Tabulka 1. Hematologické a biochemické údaje pacientů s hereditární sférocytózou rozdělených do skupin podle toho, zda byli nebo nebyli po splenektomii.

Všichni pacienti s hereditární sférocytózou měli pozitivní výsledky alespoň dvou různých testů s výjimkou dvou pacientů (1 s deficitem band 3 a 1 s deficitem spektrinu), kteří byli pozitivní pouze v testu vazby na EMA. Zjistili jsme, že kombinace EMA a AGLT umožnila identifikovat všechny pacienty s hereditární sférocytózou (tabulka 2B). Konkrétně 133/150 (88 %) případů hereditární sférocytózy bylo EMA pozitivních, AGLT pozitivních, 7/150 (5 %) bylo EMA pozitivních, AGLT negativních a 10/150 (7 %) bylo EMA negativních, AGLT pozitivních.

Při analýze výkonnosti jednotlivých testů u pacientů bez splenektomie v závislosti na klinickém fenotypu si vazba na EMA, AGLT a růžový test zachovaly vysokou citlivost v různých klinických podskupinách, zatímco citlivost testu osmotické křehkosti NaCl na čerstvé krvi a po inkubaci výrazně klesla u kompenzovaných případů (obrázek 1).

Výsledky různých testů u série 84 pacientů s jinými hemolytickými stavy než s hereditární sférocytózou jsou znázorněny na obrázku 2. Vazba na EMA vykázala větší specifitu onemocnění, když byla negativní u všech pacientů s autoimunitní hemolytickou anémií, a to i v přítomnosti výrazné sférocytózy.

Diskuse

Jedná se o první rozsáhlou srovnávací studii v současnosti nejpoužívanějších laboratorních metod pro diagnostiku hereditární sférocytózy, která byla provedena na velkém počtu pacientů seskupených podle molekulárního defektu, stupně hemolýzy a přítomnosti či nepřítomnosti sleziny. Zjištění, že polovina vyšetřovaných pacientů měla mírnou/kompenzovanou anémii, a proto byla obtížněji diagnostikovatelná, a že 18 % mělo v nátěru periferní krve velmi málo sférocytů, činí vyšetřovanou populaci zvláště vhodnou pro studie citlivosti. Do této studie jsme nezařadili test kryohemolýzy17 , protože podstata citlivosti červených krvinek hereditární sférocytózy na chlazení nebyla dosud objasněna a názory na jeho rutinní využití pro diagnostiku hereditární sférocytózy jsou sporné.4,5,16,17,19,37,38

Tabulka 2. (A) Citlivost jednotlivých testů u pacientů s hereditární sférocytózou (HS) seskupených podle biochemického defektu. (B) Citlivost kombinovaných testů u všech případů HS. Číslo představuje poměr pozitivních případů/celkový počet případů s procentuálními hodnotami v závorkách.

Obrázek 1. Citlivost různých diagnostických testů u 22 splenektomovaných a 128 nesplenektomovaných pacientů s hereditární sférocytózou (HS). Nesplenektomovaní pacienti s HS byli rozděleni podle klinického fenotypu.

Z uvažovaných diagnostických metod je jistě nejzajímavější nedávno navržený test vazby na EMA, který je pro svou vysokou senzitivitu a specificitu stále častěji používán specializovanými laboratořemi.12,18,23-29 Tato metoda se přímo zaměřuje na strukturální poškození nemoci, protože fluorescenční sonda eosin-5′-maleimid interaguje s transmembránovými proteiny band 3, Rh proteinem, Rh glykoproteinem a CD47, které jsou sníženy v červených krvinkách pacientů s hereditární sférocytózou;30 defekty dalších cytoskeletálních proteinů, jako je spektrin a protein 4.2, rovněž vyvolávají snížení intenzity fluorescence, pravděpodobně proto, že vytvářejí modulační účinek na dálku na vazebné místo barviva v proteinu band 3.39 Citlivost testu vazby EMA v této sérii je vyšší než citlivost, kterou nedávno uvedli Crisp a spol.12 , a podobná citlivosti, kterou zjistili jiní;18,23-29 navíc se zdá, že výkonnost testu nezávisí na typu deficitu membránových proteinů červených krvinek a u pacientů s hereditární sférocytózou s nedetekovatelným defektem klesá jen mírně, což je v souladu s tím, co pozorovali King a spol.18 a Girodon a spol.25 Zajímavé je, že citlivost je nezávislá na klinickém fenotypu a je vysoká i u pacientů s kompenzovanou anémií. Oddělená analýza nesplenektomovaných a splenektomovaných pacientů s hereditární sférocytózou ukázala, že citlivost se zvýšila u druhé skupiny, což je zjištění obecně společné pro všechny zkoumané testy; toto pozorování poukazuje na potřebu přesně definovat klinické charakteristiky pacientů při testování účinnosti diagnostických metod pro hereditární sférocytózu a případně omezit analýzu na nesplenektomované subjekty. Další výhodou testu s vazbou na EMA je, že výsledky nejsou ovlivněny přepravou nebo skladováním po dobu až 6 dnů, jak ukazuje obrázek 3, což umožňuje přepravu vzorků, jak uvádí Girodon a spol.25. Výsledky navíc nejsou ovlivněny nedávnými transfuzemi, protože metoda rozlišuje různé populace červených krvinek.20

Obr. 2. Výsledky jednotlivých diagnostických testů u pacientů s jinými hemolytickými anemiemi než hereditární sférocytózou (HS) ve srovnání s pacienty s HS. Vystínovaná oblast představuje normální referenční intervaly. CDA: vrozená dyserytropoetická anémie; AIHA: autoimunitní hemolytická anémie; HE: hereditární eliptocytóza; PNH: paroxysmální nokturální hemoglobinurie

Pokud jde o testy osmotické fragility NaCl, zjistili jsme, že tyto testy nedokázaly identifikovat téměř čtvrtinu pacientů s hereditární sférocytózou, což potvrzuje výsledky jiných výzkumníků,12,13,19,40,41 a že jejich senzitivita byla obecně nižší než senzitivita ostatních diagnostických laboratorních testů hodnocených v této sérii. Navzdory tomu je inkubovaná osmotická fragilita NaCl stále běžně považována za zlatý standard pro diagnostiku hereditární sférocytózy u pacientů s Coombsovými negativními hemolytickými anemiemi.5,11,42 Analýza literatury skutečně ukazuje, že v minulosti nebyly provedeny žádné systematické studie citlivosti tohoto testu a že tvrzení, že se jedná o nejlepší metodu pro diagnostiku hereditární sférocytózy, je založeno na studiích provedených na omezeném počtu pacientů s ne zcela jasně definovanými klinickými charakteristikami; navíc interpretace křivek osmotické fragility NaCl může být v méně typických případech obtížná.8 Vysoký počet pacientů uvažovaných v této sérii nám umožnil korelovat výsledky testu osmotické fragility NaCl s klinickým projevem onemocnění: zjištění, že v případech kompenzované hereditární sférocytózy klesá senzitivita testu osmotické fragility na téměř 60 %, což je mnohem více, než uvádí Korones & Pearson,13 dále omezuje užitečnost této metody v nejlehčích a méně typických případech. To potvrzuje i zjištění, že u pacientů s hereditární sférocytózou s nedetekovatelným biochemickým defektem klesá citlivost na 30 %.

Testy fragility červených krvinek na bázi glycerolu, s výjimkou původní verze GLT, jsou citlivější než test osmotické fragility NaCl; konkrétně v této sérii měl AGLT citlivost 95 %, což je podobná citlivost, jakou zjistili jiní1,15,43,44 a vyšší, než jakou uvádějí Cynober et al.10 a Bucx et al.45 Senzitivita AGLT byla rovněž vysoká u kompenzovaných případů a u případů s nezjištěným biochemickým defektem. Navíc stojí za zmínku, že AGLT identifikoval deset EMA negativních případů hereditární sférocytózy.

Spojení vazby na EMA a AGLT umožnilo identifikovat všechny případy hereditární sférocytózy v této sérii; protože průtokový cytometr není dostupný ve všech diagnostických laboratořích, stojí za zmínku, že AGLT plus test osmotické křehkosti NaCl na inkubované krvi zvyšuje diagnostickou senzitivitu na 97 %, podobně jako bylo dříve uvedeno u větší série pacientů4: v každém případě je tato hodnota vyšší než hodnota získaná kombinací vazby EMA a testu kryohemolýzy, jak nedávno uvedli Crisp et al.12

Obr. 3. (A) Průměrné hodnoty fluorescence kanálů u normálních kontrol a pacientů s hereditární sférocytózou (HS) v různých dnech skladování. (B-C) Výsledky testu vazby EMA u vzorků od 150 pacientů s HS rozdělených do skupin podle přepravy (B) a dnů skladování před testováním (C). ■ Kontroly, – HS nezaslaná, ○ HS zaslaná.

Obrázek 4. Vývojový diagram pro laboratorní diagnostiku hereditární sférocytózy (HS).

Specifičnost diagnostických testů pro hereditární sférocytózu byla hodnocena zařazením velké skupiny pacientů s různými typy hemolytických anémií, které mohou vykazovat morfologické a laboratorní znaky podobné znakům hereditární sférocytózy. Podle očekávání byly výsledky vazby EMA, pokud jde o procento snížení fluorescence, přímo závislé na počtu sférocytů pouze u pacientů s hereditární sférocytózou, ale ne u pacientů s autoimunitní hemolytickou anémií, a to ani u pacientů s výraznou sférocytózou: toto pozorování je v souladu s vysokou specifitou tohoto testu pro dané onemocnění, kterou uvádějí jiní.19-21,25 Zjistili jsme, že ostatní testy, zejména testy na bázi glycerolu, jsou méně specifické než test na vazbu EMA, protože, jak bylo uvedeno dříve,8,9,14,15,46 jsou často pozitivní i u získaných hemolytických anémií. Za zmínku stojí, že žádný z dostupných diagnostických testů hereditární sférocytózy, ať už přímý nebo nepřímý, neodliší hereditární sférocytózu od vrozené dyserytropoetické anémie II. typu. Tato druhá porucha, ačkoli je méně častá než hereditární sférocytóza, může napodobovat klinický obraz, morfologii červených krvinek a zvýšenou osmotickou fragilitu červených krvinek hereditární sférocytózy a k její identifikaci může být nutná analýza SDS-PAGE: Mariani a kol. uvádějí, že u 13 % případů odeslaných do referenční laboratoře s předběžným označením hereditární sférocytózy se při vyšetření SDS-PAGE ukázalo, že se jedná o vrozenou dyserytropoetickou anémii typu II.47

Diagnostické pokyny pro hereditární sférocytózu od Britského výboru pro standardy v hematologii,19 které jsou zatím jediné dostupné, doporučují jako screeningovou metodu buď vazbu EMA, nebo test kryohemolýzy,16 přičemž rozhodujícím faktorem pro výběr je dostupnost průtokového cytometru. Pokyny neupřesňují, zda by v případě nejednoznačných nebo hraničních výsledků měly být provedeny oba testy. V každém případě i spojení těchto dvou testů dává citlivost 93 %, což je podobná citlivost jako u EMA-vázání nebo AGLT použitých samostatně a mnohem nižší než citlivost získaná kombinací EMA-vázání plus AGLT.

Jak je vidět na obrázku 4, v přítomnosti pacienta s DAT-negativní chronickou hemolýzou se sférocyty umožňuje negativita EMA i AGLT vyloučit hereditární sférocytózu. Pozitivita vazby EMA (s pozitivním nebo negativním AGLT) vede k diagnóze hereditární sférocytózy s výjimkou těch nedominantních případů s nedostatečnou retikulocytózou11 , které vyžadují SDS-PAGE analýzu k vyloučení vrozené dyserytropoetické anémie typu II. Analýza SDS-PAGE může být rovněž nutná u vzácných EMA-negativních, AGLT-poistických případů s negativní rodinnou anamnézou, a to vzhledem k menší specifičnosti AGLT pro dané onemocnění.

Závěrem lze říci, že žádný test není schopen identifikovat všechny případy hereditární sférocytózy. Spojení vazby EMA, která se přímo zaměřuje na strukturální defekt hereditární sférocytózy, a AGLT, který využívá poměr plochy povrchu červených krvinek k jejich objemu, nám umožnilo identifikovat všechny pacienty s hereditární sférocytózou v této sérii, a proto představuje velmi účinnou diagnostickou strategii hereditární sférocytózy i u mírných/kompenzovaných případů. Je však třeba zdůraznit, že diagnóza hereditární sférocytózy je posledním krokem diagnostického vyšetření založeného nejen na laboratorních testech, ale také na klinickém vyšetření, osobní rodinné anamnéze a vyloučení možných příčin sekundární sférocytózy.

Poznámky

• Financování: Tato práce byla podpořena grantem nadace IRCCS Ca‘ Granda Ospedale Maggiore Policlinico z Milána, RC2009 160/01 a projektem ENERCA III, EC 2008, konvence č. 210.
• Autorství a odhalení informacíInformace poskytnuté autory o příspěvcích osob uvedených jako autoři a v poděkování jsou k dispozici s plným textem tohoto článku na www.haematologica.org.
• Finanční a další informace poskytnuté autory s použitím jednotného formátu ICMJE (www.icmje.org) pro zveřejnění konkurenčních zájmů jsou rovněž k dispozici na adrese www.haematologica.org.

• Přijato 4. srpna 2011.
• Revize přijata 11. října 2011.
• Přijato 26. října 2011.

1. Eber SW, Pekrun A, Neufeldt A, Schröter W. Prevalence zvýšené osmotické fragility erytrocytů u německých dárců krve: screening pomocí modifikovaného glycerolového lyzačního testu. Ann Hematol. 1992; 64(2):88-92. PubMedhttps://doi.org/10.1007/BF01715351Google Scholar
2. Tse WT, Lux SE. Poruchy membrán červených krvinek. Br J Haematol. 1999; 104(1):2-13. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1999.01130.xGoogle Scholar
3. Gallagher PG. Poruchy membrán červených krvinek. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2005;13-8. Google Scholar
4. Mariani M, Barcellini W, Vercellati C, Marcello AP, Fermo E, Pedotti P. Clinical and hematologic features of 300 patients affected by hereditary spherocytosis grouped according to the type of the membrane protein defect. Haematologica. 2008; 93(9):1310-7. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.12546Google Scholar
5. Hematologie kojeneckého a dětského věku. Saunders: Philadelphia; 2009. Google Scholar
6. Parpart AK, Lorenz PB, Parpart ER, Gregg JR, Chase AM. The osmotic resistance (fragility) of human red cells [Osmotická odolnost (křehkost) lidských červených krvinek]. J Clin Invest. 1947; 26(4):636-40. PubMedhttps://doi.org/10.1172/JCI101847Google Scholar
7. Gottfried EL, Robertson NA. Doba glycerolové lýzy inkubovaných erytrocytů v diagnostice hereditární sférocytózy. J Lab Clin Med. 1974; 84(5):746-51. PubMedGoogle Scholar
8. Zanella A, Izzo C, Rebulla P, Zanuso F, Perroni L, Sirchia G. Acidified glycerol lysis test: a screening test for spherocytosis. Br J Haematol. 1980; 45(3):481-6. PubMedGoogle Scholar
9. Vettore L, Zanella A, Molaro GL, De Matteis MC, Pavesi M, Mariani M. Nový test pro laboratorní diagnostiku sférocytózy. Acta Haematol. 1984; 72(4):258-63. PubMedGoogle Scholar
10. Cynober T, Mohandas N, Tchernia G. Red cell abnormalities in hereditary spherocytosis: relevance to diagnosis and understanding of the variable expression of clinical severity. J Lab Clin Med. 1996; 128(3):259-69. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-2143(96)90027-XGoogle Scholar
11. Perrotta S, Gallagher PG, Mohandas N. Hereditary spherocytosis. Lancet. 2008; 372(9647):1411-26. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0140-6736(08)61588-3Google Scholar
12. Crisp RL, Solari L, Vota D, García E, Miguez G, Chamorro ME. Prospektivní studie k posouzení prediktivní hodnoty hereditární sférocytózy pomocí pěti laboratorních testů (test kryohemolýzy, průtoková cytometrie s eosin-5′-maleimidem, test osmotické fragility, test autohemolýzy a SDS-PAGE) u 50 rodin s hereditární sférocytózou v Argentině. Ann Hematol. 2011; 90(6):625-34. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s00277-010-1112-0Google Scholar
13. Korones D, Pearson HA. Normální osmotická fragilita erytrocytů u hereditární sférocytózy. J Pediatr. 1989; 114(2):264-6. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-3476(89)80794-2Google Scholar
14. Apel D, Maria ska B, Maj S. Diagnostická hodnota testu acidifikované glycerolové lýzy (AGLT) u hereditární sférocytózy a vybraných hematologických onemocnění. Acta Haematol Pol. 1993; 24(3):267-71. PubMedGoogle Scholar
15. Brabec V, Marík T, Feixová H, Slavíková V. Nové testy pro laboratorní diagnostiku sférocytózy. Vnitrní lék. 1991; 37(11-12):883-7. PubMedGoogle Scholar
16. Iglauer A, Reinhardt D, Schröter W, Pekrun A. Cryohemolysis test as a diagnostic tool for hereditary spherocytosis. Ann Hematol. 1999; 78(12):555-7. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s002770050557Google Scholar
17. Streichman S, Gescheidt Y. Cryohemolysis for the detection of hereditary spherocytosis: correlation studies with osmotic fragility and autohemolysis. Am J Hematol. 1998; 58(3):206-12. PubMedhttps://doi.org/10.1002/(SICI)1096-8652(199807)58:3<206::AID-AJH8>3.0.CO;2-VGoogle Scholar
18. King MJ, Behrens J, Rogers C, Flynn C, Greenwood D, Chambers K. Rapid flow cytometric test for the diagnosis of membrane cytoskeleton-associated haemolytic anaemia. Br J Haematol. 2000; 111(3):924-33. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02416.xGoogle Scholar
19. Bolton-Maggs PH, Stevens RF, Dodd NJ, Lamont G, Tittensor P, King MJ, Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis. Br J Haematol. 2004; 126(4):455-74. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2004.05052.xGoogle Scholar
20. King MJ, Telfer P, MacKinnon H, Langabeer L, McMahon C, Darbyshire P, Dhermy D. Using the eosin-5-maleimide binding test in the differential diagnosis of hereditary spherocytosis and hereditary pyropoikilocytosis. Cytometry B Clin Cytom. 2008; 74(4):244-50. PubMedGoogle Scholar
21. King MJ, Bruce L, Whiteway A. The mutant erythrocyte band 3 protein in Southeast Asian ovalocytosis does not bind eosin-5-maleimide. Int J Lab Hematol. 2009; 31(1):116-7. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2007.01019.xGoogle Scholar
22. King MJ, Jepson MA, Guest A, Mushens R. Detekce hereditární pyropoikilocytózy pomocí testu vazby eosin-5-maleimidu (EMA) je způsobena výrazným snížením transmembránových proteinů reagujících na EMA. Int J Lab Hematol. 2011; 33:205-211. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2010.01270.xGoogle Scholar
23. Kedar PS, Colah RB, Kulkarni S, Ghosh K, Mohanty D. Experience with eosin-5′-maleimide as a diagnostic tool for red cell membrane cytoskeleton disorders. Clin Lab Haematol. 2003; 25(6):373-6. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.0141-9854.2003.00557.xGoogle Scholar
24. Stoya G, Gruhn B, Vogelsang H, Baumann E, Linss W. Průtoková cytometrie jako diagnostický nástroj hereditární sférocytózy. Acta Haematol. 2006; 116(3):186-91. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000094679Google Scholar
25. Girodon F, Garçon L, Bergoin E, Largier M, Delaunay J, Fénéant-Thibault M. Usefulness of the eosin-5′-maleimide cytometric method as a first-line screening test for diagnosis of hereditary spherocytosis: comparison with ektacytometry and protein electrophoresis. Br J Haematol. 2008; 140(4):468-70. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2007.06944.xGoogle Scholar
26. Kar R, Mishra P, Pati HP. Hodnocení průtokového cytometrického testu s eosin-5-maleimidem v diagnostice hereditární sférocytózy. Int J Lab Hematol. 2010; 32(1 Pt 2):8-16. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2008.01098.xGoogle Scholar
27. Riley CH, Nikolajsen K, Kjaersgaard E, Klausen TW, Mourits-Andersen T, Clausen N, Lausen B, Rosthøj S, Birgens H. Flowcytometric diagnostics of hereditary spherocytosis. Ugeskr Laeger. 2009; 171(49):3610-4. PubMedGoogle Scholar
28. D’Alcamo E, Agrigento V, Sclafani S, Vitrano A, Cuccia L, Maggio A. Reliability of EMA binding test in the diagnosis of hereditary spherocytosis in Italian patients. Acta Haematol. 2011; 125(3):136-40. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000322253Google Scholar
29. Tachavanich K, Tanphaichitr VS, Utto W, Viprakasit V. Rapid flow cytometric test using eosin-5-maleimide for diagnosis of red blood cell membrane disorders. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2009; 40(3):570-5. PubMedGoogle Scholar
30. King MJ, Smythe JS, Mushens R. Eosin-5-maleimide binding to band 3 and Rh-related proteins forms the basis of a screening test for hereditary spherocytosis. Br J Haematol. 2004; 124(1):106-13. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2003.04730.xGoogle Scholar
31. Barcellini W, Clerici G, Montesano R, Taioli E, Morelati F, Rebulla P, Zanella A. In vitro quantification of anti-red blood cell antibody production in idiopathic autoimmune hemolytic anaemia: effect of mitogen and cytokine stimulation. Br J Haematol. 2000; 111(2):452-60. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02380.xGoogle Scholar
32. Dacie JV, Lewis SM. Praktická hematologie. Churchill Livingston: London; 2001. Google Scholar
33. Dodge JT, Mitchell C, Hanahan Dj. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes [Příprava a chemické vlastnosti duchů lidských erytrocytů bez hemoglobinu]. Arch Biochem Biophys. 1963; 100:119-30. PubMedhttps://doi.org/10.1016/0003-9861(63)90042-0Google Scholar
34. Fairbanks G, Steck TL, Wallach DF. Elektroforetická analýza hlavních polypeptidů membrány lidských erytrocytů. Biochemie. 1971; 10(13):2606-17. PubMedhttps://doi.org/10.1021/bi00789a030Google Scholar
35. Laemmli UK. Štěpení strukturních proteinů při sestavování hlavy bakteriofága T4. Nature. 1970; 227(5259):680-5. PubMedhttps://doi.org/10.1038/227680a0Google Scholar
36. Beutler E. Red cell metabolism: a manual of biochemical methods. Grune &amp; Stratton Inc: New York, NY; 1984. Google Scholar
37. Iolascon A, Avvisati RA. Korelace genotyp/fenotyp u hereditární sférocytózy. Haematologica. 2008; 93(9):1283-8. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.13344Google Scholar
38. Romero RR, Poo JL, Robles JA, Uriostegui A, Vargas F, Majluf-Cruz A. Usefulness of cryohemolysis test in the diagnosis of hereditary spherocytosis. Arch Med Res. 1997; 28(2):247-51. PubMedGoogle Scholar
39. Golan DE, Corbett JD, Korsgren C, Thatte HS, Hayette S, Yawata Y, Cohen CM. Řízení laterální a rotační mobility skupiny 3 skupinou 4.2 v intaktních erytrocytech: uvolňování oligomerů skupiny 3 z vazebných míst s nízkou afinitou. Biophys J. 1996; 70(3):1534-42. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0006-3495(96)79717-5Google Scholar
40. Godal HC, Gjønnes G, Ruyter R. Does preincubation of the red blood cells contribute to the capability of the osmotic fragility test to detect very mild forms of hereditary spherocytosis?. Scand J Haematol. 1982; 29(1):89-93. PubMedGoogle Scholar
41. Praktická hematologie. Churchill Livingstone; 1991. Google Scholar
42. Iolascon A, Miraglia del Giudice E, Perrotta S, Alloisio N, Morlé L, Delaunay J. Hereditary spherocytosis: from clinical to molecular defects. Haematologica. 1998; 83(3):240-57. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000015191Google Scholar
43. Mittler U, Radig K, Kluba U, Aumann V, Röppnack R. Experience with the glycerol lysis test in acid medium in diagnosis of hereditary spherocytosis. Kinderarztl Prax. 1993; 61(6):219-22. PubMedGoogle Scholar
44. Hoffmann JJ, Swaak-Lammers N, Breed WP, Strengers JL. Diagnostická užitečnost preinkubovaného okyseleného glycerolového lyzačního testu u hemolytických a nehemolytických anémií. Eur J Haematol. 1991; 47(5):367-70. PubMedGoogle Scholar
45. Bucx MJ, Breed WP, Hoffmann JJ. Srovnání testu lýzy okyseleným glycerolem, Růžového testu a testu osmotické fragility u hereditární sférocytózy: vliv inkubace. Eur J Haematol. 1988; 40(3):227-31. PubMedGoogle Scholar
46. Rutherford CJ, Postlewaight BF, Hallowes M. An evaluation of acidified glycerol lysis test. Br J Haematol. 1986; 63(1):119-21. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1986.tb07501.xGoogle Scholar
47. Mariani M, Vercellati C, Bianchi P, Marzorati S, Caneva L, Soligo C. Congenital dyserythropoietic anemia type II (CDA II) imitting hereditary spherocytosis (HS): report of 12 cases detected by SDSPAGE. Hematol J. 2002; 3:353. Google Scholar