Exprese genů cholesterolových transportérů ABCA1 a ABCG1 v mononukleárních buňkách periferní krve u pacientů s metabolickým syndromem

Abstrakt

Geny ABCA1 a ABCG1 kódují proteiny cholesterolových transportérů, které hrají klíčovou roli v homeostáze cholesterolu a fosfolipidů. Cílem této studie bylo zhodnotit a porovnat expresi genů ABCA1 a ABCG1 u pacientů s metabolickým syndromem a zdravých jedinců. Tato studie případů a kontrol byla provedena na 36 pacientech s metabolickým syndromem a stejném počtu zdravých jedinců v Hamadánu (západní Írán) v letech 2013-2014. Celková RNA byla extrahována z mononukleárních buněk a přečištěna pomocí kolony RNeasy Mini Kit. Exprese genů ABCA1 a ABCG1 byla provedena pomocí qRT-PCR. Lipidový profil a glykémie nalačno byly měřeny kolorimetrickými postupy. Exprese genu ABCG1 u pacientů s metabolickým syndromem byla významně nižší (přibližně o 75 %) ve srovnání s expresí u kontrolní skupiny, zatímco v případě exprese genu ABCA1 nebyl mezi oběma studovanými skupinami zjištěn žádný významný rozdíl. Srovnání dalších parametrů, jako je HDL-C, FBS, BMI, obvod pasu a systolický a diastolický krevní tlak mezi pacienty s metabolickým syndromem a zdravými jedinci, ukázalo významné rozdíly (). Snížení exprese ABCG1 u pacientů s metabolickým syndromem ve srovnání se zdravými jedinci naznačuje, že hyperglykémie, související metabolity a hyperlipidémie nad kapacitu transportéru vedly ke snížení exprese ABCG1. Absence signifikantní změny v expresi genu ABCA1 mezi oběma skupinami může naznačovat odlišný mechanismus regulace exprese ABCA1.

1. Úvod

Metabolický syndrom (MetS) je definován jako soubor vzájemně souvisejících rizikových faktorů diabetu a kardiovaskulárních onemocnění (KVO) . Existují určitá kritéria pro klinickou diagnózu metabolického syndromu, která zahrnují zvýšený obvod pasu (≥ 102 cm u mužů a ≥ 88 cm u žen), zvýšené triglyceridy (≥ 150 mg/dl nebo 1.7 mmol/l), snížený lipoprotein-cholesterol o vysoké hustotě (HDL-C <40 mg/dl nebo 1,03 mmol/l u mužů a <50 mg/dl nebo 1,3 mmol/l u žen) a zvýšený krevní tlak (≥130 mm Hg systolický krevní tlak nebo ≥85 mmHg diastolický krevní tlak) . MetS lze diagnostikovat na základě pozorování tří z těchto kritérií. V posledních několika letech se prevalence MetS celosvětově zvýšila ; ve Spojených státech amerických však klesla z 25,5 % v roce 1999/2000 na 22,9 % v roce 2009/2010 . Weiss a jeho kolegové uvádějí, že obezita je přímo spojena se zvýšenou prevalencí MetS . Existuje obrácený vztah mezi KVO a plazmatickou hladinou HDL-C, což je jedno z kritérií metabolického syndromu . Lipoproteiny o vysoké hustotě, subfrakce cirkulujících lipoproteinů, hrají důležitou roli v transportu cholesterolu z periferních tkání do jaterních buněk . HDL je bohatý na proteiny Apo A-I a Apo A-II a více než dvě třetiny jeho obsahu tvoří Apo A-I .

Transmembránové přenašeče ABC mají důležitou úlohu při vychytávání cholesterolu z makrofágů do HDL a snižují tvorbu pěnových buněk . ABCA1 složený z 2261 aminokyselin se vyskytuje ve většině tkání. V posledních letech se ukázalo, že ABCA1 hraje zásadní roli v ochraně před kardiovaskulárními chorobami . Syntéza HDL přímo závisí na aktivitě ABCA1 v jaterních buňkách; jinými slovy, má klíčovou funkci v ochraně arteriálních buněk před pěnovými buňkami prostřednictvím zvýšení plazmatického HDL. Aktivita ABCA1 v arteriálních makrofázích vykázala obrácenou souvislost s tvorbou pěnových buněk, neboť se zvýšením její aktivity se tvorba pěnových buněk sníží .

Snížená nebo narušená aktivita ABCA1 by mohla způsobit některá onemocnění, jako je diabetes 2. typu , Tangerova choroba a předčasné CVD .

Gen ABCG1 se nachází na chromozomu 21q22.3 . Jak ABCA1, tak ABCG1 vedou ke snížení tkáňového cholesterolu jeho efluxem do HDL, ale ABCG1 transportuje tkáňový cholesterol do HDL2 a HDL3 a ABCA1 ho transportuje do Apo A-I bez lipidů . Makrofágy jsou nejdůležitější tkání působení ABCA1 a ABCG1 . V mnoha studiích byly zkoumány účinky upregulace a downregulace těchto genů.

Snížený eflux cholesterolu je důsledkem nedostatečné exprese ABCA1 in vitro ; může vést ke zvýšení aterosklerózy , ale upregulace ABCA1 vede ke snížení aterosklerózy . Stejný vliv na eflux cholesterolu má i downregulace ABCG1 , ale existují kontroverzní výsledky o vlivu downregulace ABCG1 na aterosklerózu .

Při MetS se mění vzorce exprese některých genů, což může vést k obezitě, diabetu a hypertenzi. V této studii jsme se zaměřili na vyhodnocení exprese genů ABCA1 a ABCG1 u pacientů s MetS, protože tyto geny se podílejí na syntéze transportérů, které mají klíčovou roli v transportu cholesterolu.

2. Materiál a metody

2.1. Metodika Subjekty

Tato studie případů a kontrol byla provedena na pacientech, kteří byli v letech 2013-2014 odesláni na endokrinologické oddělení nemocnice v Hamadánu (západní Írán). Bylo vybráno 36 pacientů s metabolickým syndromem. Jako kontrolní skupina bylo vybráno také 36 zdravých jedinců odpovídajícího věku a pohlaví. Žádný ze zdravých jedinců neměl kritéria metabolického syndromu.

Kritériem pro zařazení do skupiny s metabolickým syndromem bylo mít tři z pěti výše uvedených charakteristik. Ze studie byli vyloučeni pacienti, kteří v minulosti užívali antilipidová, antikoncepční a diuretická léčiva. Vyloučeni byli také těhotní pacienti a pacienti s diabetem, zánětem a infekcí.

2.2. Vyloučení pacientů s diabetem a zánětem. Odběr vzorků krve

Vzorek krve o objemu 2,5 ml od každého subjektu byl přidán do zkumavky obsahující EDTA a byl uchováván při teplotě 4 °C pro extrakci RNA (nejdéle po dvou hodinách).

2.3. Extrakce mononukleárních buněk periferní krve (PBMC)

Pro izolaci PBMC byly použity roztoky Lymphodex (Německo) a Henx (Írán). Asi 2 ml roztoku Henx byly přidány ke stejnému objemu krve a zcela smíchány; poté byly opatrně a pomalu nality na 3 ml roztoku Lymphodex. Následně byla směs umístěna na Lymphodex a centrifugována při 1000 g po dobu 20 minut. Mezivrstva bílé barvy mezi plazmou a Lymphodexem byla izolována jako mononukleární buňky (MC); poté byl na MC přidán Henxův pufr, zcela promíchán a odstředěn. Nakonec byl supernatant zlikvidován a proces byl ještě jednou opakován.

2.4. V případě, že se jedná o mikroorganismus, který je v roztoku, je třeba jej zlikvidovat. Extrakce RNA a syntéza cDNA

Síťová extrakce RNA byla provedena pomocí soupravy Gene JET RNA Purification kit podle protokolu výrobce. Kvalita a množství přečištěné RNA byly analyzovány pomocí NanoSpektrofotometru (Epoch, BioTek, USA); poté byla zkoumána integrita každého vzorku RNA pomocí 1% agarózového gelu, 1x TBE.

RNA byla převedena na cDNA pomocí sady RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) prostřednictvím následujícího protokolu: krok 1: žíhání primerů při 25 °C po dobu 5 min; krok 2: syntéza cDNA při 42 °C po dobu 60 min; krok 3: tepelná inaktivace při 70 °C po dobu 5 min. Produkty byly uloženy při -80 °C pro další kroky.

2.5. Návrh primerů

Specifické primery pro každý gen byly navrženy pomocí softwaru Allele ID (verze 7.6). Za účelem zvýšení specifičnosti reakce PCR v reálném čase a snížení falešně pozitivních výsledků byl jeden z každého páru primerů navržen tak, aby byl připojen k oblasti spojení exonů a exonů. Důkladná kritéria použitých primerů pro každý gen jsou uvedena v tabulce 1. Jako vnitřní kontrola byl použit housekeepingový gen 18S rRNA.

Relativní exprese genů byla vypočtena pomocí měření prahové hodnoty cyklu (CT) pro každý vzorek pomocí termocykléru C1000 a systému reálného času CFX96 (Bio-Rad, USA) a sady SYBR Premix Ex Taq 2 Kit (TakaRa č. RR820L). Jako hodnota CT byl stanoven průměr CT v trojnásobném testu každého vzorku. Množství složek qRT-PCR reakce zahrnovalo 10 μl SYBR green, 7 μl deionizované vody a po 1 μl přímého primeru, reverzního primeru a templátu. qRT-PCR se prováděla za těchto podmínek: počáteční aktivace při 95 °C po dobu 30 s a poté se opakovalo 40 cyklů následujících kroků: denaturace při 95 °C po dobu 5 s, žíhání při optimalizované teplotě žíhání po správnou dobu trvání každého genu a extenze při 72 °C po dobu 30 s a na závěr byla data získána zvýšením teploty ze 72 °C na 95 °C po 0,5 °C/0,05 s. Poté byly produkty PCR podrobeny elektroforéze (na 1% agarózovém gelu, 1x TBE), aby se ověřila specifičnost amplikonů.

2,6. Hodnocení biochemických faktorů séra

Ke každému subjektu byl odebrán dvoumililitrový vzorek krve a centrifugován při 3000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut pro oddělení séra. Celkový cholesterol (TC), LDL-C, TG, FBS a HDL-C byly vyšetřeny pomocí soupravy Pars Azmun (Írán) firmy Hitachi 911 (Německo).

2.7. Vyšetření krevního obrazu. Analýza a interpretace výsledků

Pro analýzu relativní genové exprese metabolického syndromu a kontrolní skupiny byl použit vzorec. Účinnost PCR v reálném čase byla vypočtena pro každý gen pomocí ředění 10-2; následně bylo získané číslo dosazeno do následujícího výpočetního vzorce pro měření násobných změn genové exprese :Pro statistickou analýzu byl použit software SPSS V.16 s 95% intervaly spolehlivosti. Normální rozdělení proměnných bylo ověřeno metodou Kolmogorova-Smirnova a poté byly hodnoty porovnány mezi dvěma skupinami pomocí nezávislých vzorků -testu.

3. Výsledek

Demografické charakteristiky a biochemické faktory studovaných skupin jsou uvedeny v tabulce 2. Poměr mužů a žen byl v každé skupině 1/3 (12 M a 24 Ž). Jak je uvedeno v tabulce 2, rozdíly ve všech zkoumaných parametrech byly mezi oběma skupinami statisticky významné () s výjimkou věku a LDL-C. Skupina s metabolickým syndromem měla vyšší BMI, LDL-C, TC, TG, FBS, diastolický/diastolický krevní tlak a obvod pasu ve srovnání se zdravými jedinci, zatímco HDL-C byl u metabolického syndromu významně nižší.

3.1: Základní charakteristika studovaných skupin. Výsledky qRT-PCR

Po dokončení reakce PCR byly výsledky ověřeny analýzou reakční křivky, křivky tání produktů a elektroforézou produktů PCR. Elektroforéza byla provedena na 1% agaróze s použitím 100 bp žebříčku DNA. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 1.

Obrázek 1

Agarosová elektroforéza produktů RT-PCR na gelu: Dráha 1, produkty ABCG1 s 135 bp; dráha 2, produkt 18S RNA s 151 bp; dráha 3, standardy molekulové hmotnosti s 100-1000 bp; dráha 4, negativní kontrola s <100 bp; dráha 5, produkty ABCA1 s 180 bp.

3.2. Hodnocení exprese genů v PBMC

Hladiny exprese genů byly měřeny v mononukleárních buňkách periferní krve a porovnány mezi dvěma skupinami výpočtem ΔCT pro každý gen. Mezi oběma skupinami nebyl rozdíl v expresi ABCA1, ale exprese ABCG1 byla významně nižší ve skupině MetS (). Podrobné výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Také výpočet násobné změny exprese ABCG1 () ukázal 3,1krát nižší expresi u skupiny MetS.

4. Diskuse

ABCA1 a ABCG1 mají klíčovou úlohu při zpětném transportu cholesterolu z periferních tkání, jako jsou makrofágy, do jater . Exprese genů ABCA1 a ABCG1 však byla studována u některých onemocnění; jsme nenašli žádnou zprávu na toto téma u metabolického syndromu. V této studii jsme zkoumali expresi těchto genů u osob s metabolickým syndromem a zdravých jedinců.

Zatímco v expresi genu ABCA1 nebyl mezi oběma studovanými skupinami významný rozdíl, u osob s metabolickým syndromem jsme zjistili významně nižší expresi (asi o 75 %) genu ABCG1 ve srovnání s kontrolní skupinou. Singaraja et al. prokázali, že snížený obsah ABCA1 v makrofázích a ledvinách je spojen se zvýšeným obsahem cholesterolu . Došli k závěru, že zhoršený export cholesterolu zprostředkovaný ABCA1 může přispívat ke zvýšené ateroskleróze a nefropatii spojené s diabetem . Existují zprávy, které se snaží zabývat možnými mechanismy, které regulují expresi těchto genů. Nedávno se ukázalo, že polymorfismy v ABCA1 a ABCC8 mohou souviset s metabolickým syndromem . Existují důkazy o tom, že narušení funkce ABCA1, které může být důsledkem mutace v tomto genu, může vést k familiární hypoalfalipoproteinemii, která je charakterizována nízkým HDL a zvýšeným ukládáním cholesterylesterů v několika tkáních a buňkách . Také bylo prokázáno, že nadměrná exprese genu ABCA1 může poskytovat ochranu před aterosklerózou . Tyto údaje jsou v souladu s našimi zjištěními a podporují tuto myšlenku, že nižší exprese genu ABCA1 může přispívat ke komplikacím metabolického syndromu.

Haghpassand et al. prokázali, že exprese genu ABCA1 v PBMC má přímý vztah k zátěži cholesterolem a nadměrná exprese ABCA1 vede k přenosu nadbytečného cholesterolu na apoproteiny . Wang et al. studovali reverzní transport cholesterolu u myší s vyřazeným ABCA1 a ABCG1 a dospěli k závěru, že při vyřazení ABCA1 i ABCG1 dochází k většímu reverznímu transportu cholesterolu ve srovnání s vyřazeným ABCG1 .

Protože Mauerer et al. poukázali na to, že vysoká hladina glukózy (hyperglykémie) se podílí na snížené expresi ABCA1 a ABCG1 in vitro , zdá se logické očekávat podobné změny u MetS. Promotory ABCA1 a ABCG1 mají receptorové místo pro LXR a RXR; když se k těmto faktorům připojí oxycholesterol a kyselina retinová, exprese ABCA1 a ABCG1 se zvýší. Také cAMP a NFκB jsou transkripčními faktory pro ABCA1 a ABCG1.

Získané výsledky naznačily významné snížení exprese ABCG1 u pacientů s metabolickým syndromem ve srovnání se zdravými jedinci. Tyto výsledky naznačují, že hyperglykémie, související metabolity a hyperlipidémie nad kapacitu transportéru mohou vést ke snížení exprese ABCG1. Protože nebyla pozorována žádná významná změna v expresi genu ABCA1, může to být způsobeno jiným mechanismem regulace. Vzhledem k tomu, že struktury těchto genů jsou odlišné a jsou regulovány různými transkripčními faktory, mohou být naše výsledky oprávněné . Nicméně dalším faktorem absence změn v expresi ABCA1 je omezený počet vzorků v této studii.

Dalším bodem je, že jsme zkoumali expresi těchto genů v PBMC zkoumaných subjektů; je důležité si uvědomit, že změny v expresi těchto genů v monocytech se mohou lišit od změn v ostatních klíčových tkáních, jako jsou játra a střevo, které jsou hlavními místy syntézy HDL. Navíc změny v hladinách mRNA nemusí nutně znamenat změny v souvisejících proteinech.

Konflikt zájmů

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Poděkování

Tento článek je převzat z magisterské práce Zahry Tavoosi. Autoři by rádi poděkovali Hamadan University of Medical Sciences za finanční podporu této studie.