Frontiers in Microbiology

Úvod

Bakteriofágy se dostaly do centra pozornosti vědeckého výzkumu, protože hrají důležitou roli téměř v každém mikrobiálním společenství. Jako viroví predátoři bakterií mají podstatný vliv na mikrobiální populace a dynamiku v různých prostředích. Existuje několik přehledů zabývajících se úlohou bakteriofágů v různých prostředích, jako jsou moře nebo lidské tělo (Clokie a Mann, 2006; Wahida et al., 2016; Łusiak-Szelachowska et al., 2017). Od jejich objevení před více než 100 lety, zvlášť Frederickem Twortem a poté Felixem D’Herelle (Salmond a Fineran, 2015), se bakteriofágy používají v zemích východní Evropy k léčbě bakteriálních infekcí, zatímco ve zbytku světa byla protagonisty antibiotika (Myelnikov, 2018). V současné době, kdy se infekce způsobené multirezistentními bakteriemi staly celosvětovou hrozbou (Zaman et al., 2017), jsou pacienti z celého světa léčeni v Eliavském institutu bakteriofágů, mikrobiologie a virologie v gruzínském Tbilisi, který má s bakteriofágovou terapií snad nejdelší zkušenosti (Kutateladze a Adamia, 2008), a také v oddělení bakteriofágové terapie Institutu imunologie a experimentální terapie Ludvíka Hirszfelda v polské Vratislavi (Międzybrodzki et al., 2012). Aplikace bakteriofágů by mohla být cenným řešením nejen ve zdravotnictví, ale i v dalších oblastech, kde mohou mít bakterie negativní vliv.

Některé společnosti ve Spojených státech, jako například OmniLytics Inc. (Sandy, UT, Spojené státy) a Intralytix Inc. (Baltimore, MD, Spojené státy) vyvinuly různé bakteriofágy pro použití jako dezinfekční prostředky v potravinářském průmyslu, které lze použít proti Salmonelle, Escherichia coli a Listeria monocytogenes. V Evropě uvedla na trh bakteriofágové produkty proti Salmonelle a E. coli také nizozemská společnost Micreos BV (Wageningen, Nizozemsko) a německá společnost Fink Tec (Hamm, Německo), zaměřené na E. coli (Moye et al., 2018). Širší uplatnění bakteriofágů se očekává v potravinovém řetězci včetně zemědělství a akvakultury, kde široké spektrum různých patogenů rostlin a ryb způsobuje značné ekonomické ztráty (Buttimer et al., 2017; Doss et al., 2017).

Ačkoli některé bakteriofágové produkty jsou již komerčně využívány, účinného, stálého a kontrolovatelného procesu výroby bakteriofágů ještě nebylo dosaženo. Výrobu fágů v laboratořích lze považovat za rutinní proces a protokoly jsou dobře definovány; tyto procesy však nelze snadno škálovat. Průmyslové subjekty mají hlavní zájem na získání spolehlivých metod pro produkci fágů, které umožňují rozšíření procesu. Řešení však není snadné vzhledem k biologické povaze systému a různým typům interakcí, ke kterým mezi fágy a bakteriemi dochází.

Pokusů o vytvoření spolehlivých metod pro produkci bakteriofágů bylo několik. Někteří výzkumníci použili teoretický přístup pomocí simulačních modelů, zatímco jiní zvolili praktický přístup pomocí experimentů. Tento minipřehled zkoumá vybrané příklady obou přístupů a porovnává jejich hlavní rozdíly.

Všeobecnosti při produkci bakteriofágů

Biologická povaha bakteriofágů si vynucuje jejich množení v hostitelské buňce. Proto metoda výroby bakteriofágů vyžaduje výrobní proces zahrnující nejméně dvě provozní jednotky, růst hostitelské bakterie a množení (nebo infekci) bakteriofágů. Je důležité zvážit základní parametry růstu bakterií a infekce fágů, jako jsou vybrané substráty pro bakterie a optimální teplota, a to jak pro růst bakterií, tak pro infekci fágů, protože tyto faktory mohou ovlivnit infekčnost fágů (Tokman et al., 2016). Stejně tak je důležité znát biologii produkovaného fága, včetně různých parametrů infekce, jako je rychlost adsorpce, velikost výbuchu a latentní perioda; jak však bude uvedeno později, tyto parametry se mohou měnit v závislosti na podmínkách infekce (Santos et al., 2014). Ještě důležitější je doporučit hluboké pochopení specifických interakcí, které mohou nastat mezi bakteriálním hostitelem a vybraným fágem, jako je přítomnost systému CRISPR-cas v bakterii, protože tyto faktory mohou mít silný vliv na proces fágové infekce (Levin et al., 2013). Doporučuje se také vybrat jako hostitele nevirulentní bakteriální kmen. Produkce bakteriofágů na průmyslové úrovni bude vyžadovat velké množství hostitelské bakterie, takže v procesu produkce fágů by mělo být povinné vyhnout se použití virulentních patogenů rezistentních vůči léčivům, a zejména multirezistentních patogenů (Torres-Barceló, 2018). Totéž platí pro bakterie nesoucí profágy, protože ty by mohly být během procesu indukovány, což by změnilo konečný výsledek (Stewart a Levin, 1984).

Spolehlivý proces pro velkoplošnou produkci bakteriofágů může být velmi nepolapitelný, protože údaje získané v laboratoři nejsou vždy užitečné pro škálování biologických procesů (Kwok, 2010). Tuto mezeru se vědci snažili zaplnit především prostřednictvím studií o produkci bakteriofágů založených na počítačových simulacích, z nichž některé byly ověřeny experimentálně. Zde budeme analyzovat nejprve teoretické studie zaměřené na modely produkce fágů a poté vybrané studie, které byly ověřeny experimentálně. Všechny případy se shodují s kritérii testu pro další purifikaci a validaci produktu na bázi bakteriofágů a některé z nich jsou zahrnuty v obou částech (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018a).

Teoretické modely produkce bakteriofágů

Pro popis procesu produkce fágů pomocí matematického modelu je důležité definovat kinetické parametry, které je třeba do modelu zahrnout. Třemi základními parametry produkce fágů jsou populace vnímavých neinfikovaných bakterií, bakterií infikovaných fágy a volných fágů (Krysiak-Baltyn et al., 2016). Vycházejíce z toho, různé modely zahrnovaly další proměnné, jako jsou rezistentní neinfikované bakterie (Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018) nebo více druhů bakterií (Levin et al., 1977). Všechny tyto populace se vzájemně ovlivňují řízené kinetickými parametry souvisejícími s růstem bakterií a fágovou infekcí. Má se za to, že je dobře známo, které konstanty jsou důležité pro bakterie; u bakteriofágů se však o tom stále diskutuje. Panuje shoda, že adsorpční konstanta, doba latence a velikost výbuchu jsou důležité proměnné, které je třeba brát v úvahu; jejich význam v modelu se však v různých studiích liší. Různí autoři navíc používají odlišnou nomenklaturu pro definici kinetických parametrů, což je jedním z hlavních problémů pro stanovení srovnání mezi různými modely a sjednocení obecných znalostí na toto téma. Například rychlost adsorpce fágů (ukazatel částic fágů adsorbovaných na bakterie) se běžně označuje symbolem „δ“; Beretta a Kuang (1998) však používají symbol „K“, což může být také symbol pro Monodovu konstantu substrátové specifity „Ks“. Další příklady odlišného názvosloví lze nalézt v tabulce 1. Stejně jako u jiných biologických procesů se očekává, že se autoři pracující v oblasti modelů růstu fágů a bakterií dohodnou na konkrétním algebraickém slovníku nebo ve svých článcích uvedou jasné vysvětlení pojmů a jednotek a přehlednou nomenklaturu, jak nedávno uvedli Krysiak-Baltyn et al. (2018). Na základě nomenklatury používané jinými autory (tabulka 1) navrhujeme používat řecké znaky pro pojmenování různých kinetických parametrů při rozmnožování fágů. Velikost výbuchu lze symbolizovat písmenem β, rychlost adsorpce písmenem δ, dobu zatmění písmenem ε a rychlost rozpadu fága písmenem λ. Jedinou výjimkou by byla koncentrace fága, která se běžně označuje jako „P“, a doba latence, známá jako „L“. Jednotnost tohoto matematického jazyka usnadní pochopení a vytěžování dat pro budoucí akademické nebo průmyslové recenzenty.

Počínaje Campbellem (1961) bylo vyvinuto mnoho úsilí o popis modelů produkce bakteriofágů, které popisují chování populace fágů za několika podmínek a metod. Tabulka 1 shrnuje různé modely produkce fágů, uvedené jako diferenciální nebo integrální rovnice (v závislosti na rozhodnutí jednotlivých autorů), s uvedením specifických úvah pro každý model.

Modely produkce fágů jsou obecně konzistentní při popisu změn populace fágů v čase. Ta může být reprezentována jako kinetická změna částic fágů nebo jednotek tvořících plaky (PFU) za jednotku času, konečných koncentrací získaných po dávkovém procesu nebo během časového období v kontinuálním procesu. Navzdory obecné shodě se tyto modely liší v několika tvrzeních. Modely navržené Campbellem (1961) a Berettou a Kuangem (1998) se shodují v bilancování částic fágů s podmínkami generace (uvolnění částic bakteriofágů za jednotku času) a ztrát volných bakteriofágů v důsledku adsorpce nebo rychlosti rozpadu; tyto modely jsou užitečné díky své jednoduchosti a použití standardních parametrů růstu fágů, jako je rychlost adsorpce, velikost výbuchu a doba latence, a představují rychlý způsob simulace dávkových výrobních procesů, ale nemohly by vyhovovat procesům, jako jsou populace rezistentních bakterií nebo vývoj fágů v čase. Tyto modely mají také tendenci podceňovat vliv parametrů, jako je velikost výbuchu a doba latence, zatímco novější modely ukázaly význam těchto parametrů a to, jak se mohou měnit v závislosti na dalších faktorech (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018b).

Zajímavý model nedávno navrhli Santos et al. (2014), který zohledňuje vliv rychlosti růstu bakterií na fágovou adsorpční konstantu a rovnici normálního rozdělení, která řídí hodnoty doby latence, přičemž zohledňuje variabilitu těchto parametrů. Tento model se ukázal jako velmi užitečný, protože poskytuje možnost vyhodnotit vliv substrátu na produkci fágů a zahrnutí rychlosti růstu bakterií do modelu nabízí nepřímý nástroj pro zohlednění fyziologického stavu bakterií v průběhu procesu. Závislostí parametrů bakteriofágové infekce na rychlosti růstu bakterií se později zabývali i další autoři (Krysiak-Baltyn et al., 2018; Nabergoj et al., 2018b); Nabergoj a kolegové zjistili, že velikost výbuchu lineárně roste s rychlostí růstu bakterií, zatímco adsorpční konstanta a latentní perioda klesají.

Další modely zkoumaly vliv více druhů bakterií a výskyt bakteriální rezistence (Levin et al., 1977; Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018). Ačkoli cílem těchto studií nebylo vždy vyvinout metody produkce fágů, jsou užitečné pro popis potenciálních situací, než které mohou během procesu nastat. Tyto modely zahrnují proměnné spojené se selekcí bakterií na rezistenci a mírou reverze v závislosti na bakteriální populaci (dostupnost méně nebo více citlivých bakterií v průběhu času), definují podmínky, za kterých mohou citlivé a rezistentní bakterie koexistovat, jako je silná selekční nevýhoda u rezistentních bakterií (například nižší rychlost růstu) a/nebo existence prostorového útočiště (nebo hustoty útočiště), kde (pod kterým) fág není schopen infikovat bakterie. Chaudhry et al. (2018) nabídli zajímavé vysvětlení toho, jak mohou fágy přetrvávat v populacích, v nichž dominují rezistentní bakterie, a naznačili, že tyto mohou produkovat citlivé bakterie ve frekvencích, které umožní replikaci fágů. Je zajímavé, že tento jev byl naznačen již dříve (Bastías et al., 2010). Vznik kmenů rezistentních vůči fágům v systémech produkce fágů by mohl být důvodem k obavám, a proto by měl být zahrnut do vývoje nových metod, aby se tato možnost minimalizovala. Několik autorů navrhlo, že tomuto problému lze předejít pomocí nastavení výroby fágů, o kterém bude pojednáno v následující části.

Další zajímavou studií je studie Krysiak-Baltyn et al. (2018), která rovněž zahrnuje proměnné parametry infekce v závislosti na rychlosti růstu bakterií a odhaduje provozní náklady a produktivitu v simulovaném dvoustupňovém procesním systému. Jedním z důležitých závěrů této teoretické studie je, že optimální koncentrace substrátu pro růst bakterií by neměla být nutně stejná pro produkci bakteriofágů a podle jejich analýzy by náklady na 1 ml fágů při koncentraci 4 × 1010 fágů/ml mohly být až 1,78 × 10-2 USD. Bylo by zajímavé tento odhad experimentálně ověřit a zjistit, jak je přizpůsoben různým ekonomikám nebo zemím.

Nakonec je třeba vzít v úvahu i evoluci bakteriofágů v procesu výroby, protože fágy mohou v průběhu času zvyšovat nebo snižovat svou účinnost infikovat bakterie (Lenski a Levin, 1985). Tento koncept by mohl být reprezentován jako míra infekce v experimentech s hostitelem, kde lze dosáhnout i metod pro rozšíření hostitelského dosahu pro aplikace fágové terapie (Mapes et al., 2016). Tato situace byla simulována v dávkových kulturách, přičemž se ukázalo, že výskyt fágových mutantů je silně závislý na genetické flexibilitě fágů (rychlosti mutací) (Levin a Bull, 2004). Schopnost předvídat vývoj fágů během výroby by byla užitečná pro nastavení výrobního procesu minimalizujícího pravděpodobnost změny lytických vlastností fágů. Z recenzovaných článků vyplývá, že modely produkce bakteriofágů jsou důležitým přístupem, který může pomoci najít nejlepší strategie, je však třeba je experimentálně ověřit.

Experimentální zkušenosti s produkcí bakteriofágů

Existuje několik praktických studií zahrnujících produkci fágů. Některé z nich jsou zaměřeny na produkci fágů v bioreaktorech, zatímco jiné se zaměřují na hodnocení a optimalizaci procesu. Podle očekávání se v těchto zkušenostech uvažuje také o kroku růstu bakterií a infekce/rozmnožování fágů v baňkách a bioreaktorech (tabulka 2). Tyto údaje jsou užitečné pro získání informací o tom, jak lze určité modely hostitel-bakteriofág použít pro množení a zvýšení úrovně produkce fágů. Nejčastěji používanými systémy hostitel-fág jsou kmeny E. coli a jejich fágy, pravděpodobně kvůli množství informací týkajících se těchto systémů bakterie-fág (fágy E. coli T3, T4 a T7) a nedostatku informací o jiných systémech bakterie-fág.

Podle jednoho popsaného případu mohou být dosažené titry až 1,2 × 1016 PFU ml-1 ve vsádkovém bioreaktoru (5 l) (Sochocka et al., 2015). Tato úroveň produkce se shoduje s produkcí potřebnou pro terapeutické účely (>1 1010 PFU ml-1) s ohledem na purifikační kroky, rychlost rozpadu fágů a stabilitu nebo skladovatelnost (Naghizadeh et al., 2018). Jiní autoři rovněž uvádějí slibné úrovně produkce 5 × 1012 PFU mL-1 v 1,2 L (Warner et al., 2014) a 2,4 × 1013 PFU den-1 v 1 L (Nabergoj et al., 2018a; tabulka 2).

Je obtížné stanovit srovnání, která metoda by mohla být účinnější, protože používají různé kultivační postupy a různé systémy hostitel-bakteriofág. Vsádková kultivace je nejlevnějším (nikoli nejjednodušším) způsobem produkce bakteriofágů, je však značně omezena maximálním objemem dostupného zařízení, celkovou dobou provozu a dostupností substrátu (vyšší koncentrace mohou být pro růst bakterií inhibiční). Kontinuální kultura má vyšší škálovatelnost při optimalizaci rychlosti ředění bakterií pomocí úpravy vstupního a výstupního toku. Kromě toho regulace rychlosti ředění umožní přímou kontrolu nad rychlostí růstu bakterií, která má přímý vliv na parametry infekce, jako je velikost výbuchu, adsorpční konstanta a latentní doba (Mancuso et al., 2018; Nabergoj et al., 2018b). Rychlost ředění lze také využít ke zvýšení produktivity systému, jak ukázali Nabergoj et al. (2018a), kde bylo při nízké rychlosti ředění 2 h-1 v systému Cellstat o objemu 1 l dosaženo maximální produktivity 109 fágů ml-1 h-1. Kontinuální provozní systém může být trvale funkční, a proto je pro společnost nejvhodnějším způsobem výroby biotechnologického produktu. Jejich zavedení je však obtížné a nákladné, protože vyžadují neustálé monitorování pro udržení ustáleného stavu. Zcela kontinuální proces pro růst bakterií a produkci bakteriofágů by mohl zvýšit pravděpodobnost výskytu rezistence bakteriofágů, pokud nebudou přijata specifická protiopatření (Middelboe a kol., 2001).

Někteří autoři navrhli zavedení dvoustupňových procesů, jednoho výhradně pro produkci bakterií a druhého pro množení fágů (Schwienhorst a kol., 1996; Sauvageau a Cooper, 2010; Nabergoj a kol., 2018a). Toho lze dosáhnout pomocí systému cellstat, kde jsou dva bioreaktory zapojeny do série s konstantním průtokem systémem. V tomto případě lze řídit průtok mezi reaktory a objem v každém reaktoru (a rychlost ředění a rychlost růstu bakterií přídavkem), aby bylo dosaženo maximální produktivity (Nabergoj et al., 2018a). Další zajímavé uspořádání, které navrhli Sauvageau a Cooper (2010), se skládá ze semikontinuálního systému dvoustupňového samocyklujícího procesu. V tomto případě každý stupeň funguje podobně jako dávková kultura, kdy se bakterie nejprve pěstují odděleně od fága a poté se po dosažení vhodné koncentrace zavádějí do stupně množení fága, což umožňuje zahájit proces infekce pomocí požadované multiplicity infekce (Kasman et al., 2002). Toto uspořádání má také tu výhodu, že nevyžaduje trvalé monitorování k udržení ustáleného stavu kontinuálních systémů, a bylo použito k dosažení produktivity 7,59 × 1014 PFU mol CO2-1 (Sauvageau a Cooper, 2010). Oba příklady, systém cellstat a dvoustupňový samocyklující proces, mají velkou výhodu v tom, že bakterie jsou pěstovány za nepřítomnosti fágů, a proto není během procesu podporována rezistence bakteriofágů.

Nakonec je důležité poznamenat, že existují některé parametry, které nejsou vždy uváděny ve studiích o produkci bakteriofágů. Například parametry, jako je podíl aerace nebo přívod vzduchu do bioreaktoru, jsou zmíněny pouze ve dvou zprávách (Sauvageau a Cooper, 2010; Santos a kol., 2014), přestože se jedná o jeden z nejdůležitějších parametrů při produkci bakteriofágů na průmyslové úrovni. Informace o dalších parametrech, jako je přenos energie, různé využití substrátů, konstrukce bioreaktoru, míchání, vrtule a konstrukční materiály při výrobě bakteriofágů, jsou vzácné nebo neexistují.

Závěrečný závěr

Znovuobjevení potenciálního využití fágů v širokém spektru aplikací je velmi vzrušující a slibné. Důkazy naznačují, že by měly být upřednostňovány systémy pro produkci bakteriofágů, které snižují pravděpodobnost výskytu rezistence vůči bakteriofágům, jako je například cellstat nebo dvoustupňový samocyklující proces. Tyto možnosti by také umožnily řídit proměnné a zvýšit tak produktivitu procesu. Nicméně modely pro výrobu bakteriofágů nejsou zdaleka zavedeny a lze je vylepšit několika způsoby. Stále existuje mnoho výzev, které je třeba překonat. Je zapotřebí dalších studií o optimalizované výrobě bakteriofágů ve velkém měřítku, nákladech na infrastrukturu a zařízení, různých bezpečnostních otázkách a aplikačních dávkách a zkušenosti naznačují, že těmto výzvám by se mělo čelit společným úsilím akademických a průmyslových partnerů.

Nakonec je důležité poznamenat, že většinu modelů pro výrobu bakteriofágů lze použít v určitém rozmezí hodnot parametrů fágové infekce a bakteriálního růstu. Proto bez ohledu na významné pokroky v modelech a nastaveních produkce fágů bude vždy prvním požadavkem hluboká znalost konkrétního systému fág-bakterie, aby bylo možné vytvořit účinný systém produkce fágů.

Příspěvky autorů

RG, SL a RB práci vymysleli a napsali rukopis. KG, GH a JR napsali jednotlivé části rukopisu. Všichni autoři se podíleli na bibliografické revizi, revizi rukopisu, četli a schválili předloženou verzi.

Financování

Tato práce byla financována z prostředků CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133 a Postdoctorado PUCV 2018.

Prohlášení o střetu zájmů

Autoři prohlašují, že výzkum byl prováděn bez jakýchkoli komerčních nebo finančních vztahů, které by mohly být chápány jako potenciální střet zájmů.

Poděkování

RG děkuje CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133. SL děkuje Postdoctorado PUCV 2018.

.