Frontiers in Oncology

Introduction

Gliomy jsou nejčastější intrakraniální nádory, které představují přibližně 70 % všech primárních nádorů mozku (1, 2). Je známo, že hrubá totální resekce koreluje se zlepšením přežití bez progrese a celkového přežití u pacientů s gliomy nízkého stupně (LGG) (3-6). Maximální bezpečná resekce LGG je proto v současné době považována za doporučenou primární léčbu, která má oddálit potenciální maligní transformaci (7, 8). Takovéto maximálně bezpečné resekce je však dosaženo pouze u menšiny LGG vzhledem k jejich infiltrativnímu růstu a neurčitým hranicím (9).

Pro lepší intraoperační vizualizaci nádoru byla do neurochirurgie zavedena fluorescence pomocí kyseliny 5-aminolevulové (ALA) indukované protoporfyrinem IX (PpIX) (10). V posledních dvou desetiletích se tyto fluorescencí řízené resekce uplatnily zejména při optimalizaci operací gliomů vysokého grade (HGG) (11). V tomto smyslu vede fluorescencí 5-ALA navigovaná chirurgie k významně vyšší frekvenci kompletních resekcí a prodloužení přežití bez progrese u HGG (12-17). V posledních letech se 5-ALA stále více zkoumá také při operacích radiologicky suspektních LGG (3, 7, 11, 13, 18-21). Podle údajů z těchto prvních klinických studií je fluorescence indukovaná 5-ALA účinným markerem, který umožňuje identifikovat potenciální oblasti maligní transformace (anaplastická ložiska) během operace podezřelých LGG a zabránit tak histopatologickému nedegradování. Většinu čistých LGG však podle současné literatury nelze viditelnou fluorescencí zobrazit (3, 7, 11, 13, 18, 19, 21, 22).

Přesné mechanismy akumulace PpIX, a tedy přítomnosti či nepřítomnosti viditelné fluorescence indukované 5-ALA v gliomech jsou stále nejasné. Předpokládá se, že viditelnou fluorescenci 5-ALA ovlivňuje velké množství různých faktorů, například zvýšený metabolismus a up-regulace enzymů produkujících porfyrin (23), snížený metabolismus železa v neoplastických buňkách (24) a snížení aktivity enzymu ferrochelatázy, který přeměňuje fluoreskující PpIX na hem (25). Nedávno byla provedena studie in vitro, která uvádí, že antiepileptika (AED) vedou k poškození mitochondriální membrány, a tím k inhibici syntézy PpIX v gliomových buňkách (26). V současné době se AED často podávají pacientům trpícím LGG před operací. Předpokládáme, že podávání AED může mít vliv na přítomnost viditelné fluorescence v LGG během chirurgické resekce.

Cílem této studie tedy bylo prozkoumat roli fluorescence indukované 5-ALA při operaci LGG a analyzovat vliv AED na přítomnost viditelné fluorescence.

Materiál a metody

Populace pacientů

Pacienti, kteří podstoupili resekci nově diagnostikované suspektní LGG na Neurochirurgickém ústavu Burdenko po podání 5-ALA v období od března 2014 do března 2016, byli zařazeni do studie. Do naší studie bylo nakonec zařazeno celkem 27 pacientů s histopatologicky potvrzenou LGG. Náš studijní soubor zahrnoval 19 mužů a 8 žen s mediánem věku 33 let (rozmezí: 18-66 let). Podle naší histopatologické analýzy bylo diagnostikováno 14 difuzních astrocytomů, 6 oligodendrogliomů, 4 pilocytární astrocytomy, 2 gemistocytární astrocytomy a jeden desmoplastický infantilní gangliogliom. Aplikace 5-ALA během operace byla možná u všech 27 pacientů. U žádného z našich pacientů se v naší studii nevyskytly žádné významné nežádoucí účinky související s 5-ALA. Od všech pacientů byl získán informovaný souhlas s chirurgickým výkonem a aplikací 5-ALA. Studie byla schválena místní etickou komisí Národního lékařského výzkumného centra neurochirurgie N. N. Burdenka (Moskva, Rusko).

Výběrová a vylučovací kritéria

Výběrová kritéria pro zařazení do této studie byla věk ≥ 18 let, LGG s podezřením na MRI, možná hrubá totální resekce (GTR) (tj, >90 %) podle předoperačního chirurgického odhadu, absence jakéhokoli známého jaterního onemocnění v anamnéze nebo známek významné jaterní dysfunkce a Karnofského škála ≥70. Vylučovacími kritérii pro podání 5-ALA byla fotosenzitivita v anamnéze, porfyrie v anamnéze pacienta nebo rodiny, těhotenství a kojení. V konečném souboru studie zůstali pouze pacienti s diagnózou LGG po operaci.

Chirurgický postup

Pacientům bylo ~3 h před operací perorálně podáno 25 mg/kg tělesné hmotnosti 5-ALA („Alasence“ NIOPIK, Moskva, Rusko) rozpuštěného ve 100 ml vody. V závislosti na lokalizaci nádoru byl proveden intraoperační neuromonitoring pomocí senzorických/motorických evokovaných potenciálů a/nebo přímé stimulace (Viking Select, Nicolet; n = 21 pacientů) a také operace za bdělého stavu (n = 2 pacienti). Byl použit modifikovaný neurochirurgický mikroskop (Carl Zeiss OPMI Pentero, Německo) vybavený fluorescenčním modulem s UV světlem 400 nm a specifickými filtry. Mikrochirurgické odstranění nádoru bylo ve většině případů (n = 20 pacientů) provedeno především pomocí standardního mikroskopu v bílém světle s asistencí neuronavigace. Během operace byl mikroskop opakovaně přepínán na fialovomodré excitační světlo pro vizualizaci případné fluorescence.

Intenzita fluorescence byla vizuálně hodnocena chirurgem a určena jako „slabá“, kdy pouze malá část nádoru vykazuje růžovou fluorescenci, přičemž jeho větší část vůbec nefluoreskuje, „střední“, kdy více než polovina nádoru vykazuje růžovou fluorescenci, a „jasná“, kdy větší část nádoru vypadá jasně červeně. Fluorescence pomocí spektroskopie byla kvantitativně hodnocena u 12 pacientů. Úroveň fluorescence se pohybovala od 0 hodnot až po 15 arbitrárních jednotek (po normalizaci dat) vzhledem k intaktnímu mozku. Úlohu spektroskopie jsme speciálně nevyzdvihovali, protože byla provedena pouze u některých našich pacientů. Dále byla stanovena také intratumorální homogenita fluorescence jednotlivých nádorů. V tomto smyslu byla difúzní fluorescence definována jako homogenní záření celého nádoru. Naproti tomu fokální fluorescence byla definována jako ohraničená oblast fluorescence uvnitř jinak nefluoreskujícího nádoru. V průběhu operace byly následně odebrány vzorky tkáně z fluoreskujících a/nebo nefluoreskujících oblastí uvnitř nádoru a/nebo předpokládané hranice nádoru pro histopatologickou analýzu. Aby se předešlo možné fototoxicitě související s 5-ALA, byli všichni pacienti chráněni před silnými zdroji světla po dobu nejméně 24 h po podání léku.

Histopatologie

Všechny vzorky tkáně fixované ve formalínu a zalité do parafínu byly zpracovány pro barvení hematoxylinem a eozinem (H & E). Diagnóza nádoru byla stanovena zkušeným neuropatologem podle platných histopatologických kritérií Světové zdravotnické organizace (WHO) (27). V naší studii byla u každého z odebraných vzorků tkáně zkoumána hustota buněk a míra proliferace (index značení Ki-67).

Předoperační užívání AED

Protože hlavním cílem naší studie bylo zkoumat potenciální vliv AED na fluorescenci vyvolanou 5-ALA, dokumentovali jsme u každého pacienta, zda mu byly před operací podávány AED (ano nebo ne). Pacientům byly podávány průměrné dávky AED: kyselina valproová (až 1,5 mg denně), levetiracetam (800 mg denně). Nezkoumali jsme každý lék zvlášť, protože celková série nebyla velká.

Pooperační průběh

U každého pacienta byl před operací a po ní vyšetřen neurologický stav, aby se zjistilo případné pooperační zhoršení neurologických příznaků. Kromě toho byl rozsah resekce posuzován podle výsledků časné (do 72 hodin po operaci) pooperační magnetické rezonance: (1) GTR byla přítomna, pokud bylo odstraněno alespoň 90 % nádorové masy, (2) subtotální resekce, pokud bylo odstraněno více než 50 % nádorové masy, a (3) parciální resekce, pokud bylo odstraněno <50 % nádoru.

Statistická analýza

Zpracování dat bylo provedeno pomocí softwaru R pro statistické výpočty (verze 3.4.4). Spojité proměnné byly porovnány ve skupinách pomocí Mannova-Whitneyho U-testu. K analýze vztahu mezi kategorickými proměnnými byl použit Fisherův přesný test. Při testování vlivu AED na fluorescenci byla provedena logistická regresní analýza pro úpravu na matoucí faktory. Výsledky byly považovány za statisticky významné při p < 0,05.

Výsledky

5-ALA indukovaná fluorescence a histopatologická diagnóza

Viditelnou fluorescenci jsme během operace pozorovali ve 14 (52 %) z 27 případů, zatímco ve zbývajících 13 případech (48 %) nebyla fluorescence zjištěna.

Podle histopatologické diagnózy nádoru vykazovaly viditelnou fluorescenci všechny 4 pilocytární astrocytomy, všechny 2 gemistocytární astrocytomy a jediný desmoplastický infantilní gangliogliom. Dále byla viditelná fluorescence zjištěna u 4 (29 %) ze 14 difuzních astrocytomů a u 3 (50 %) ze 6 oligodendrogliomů. Podle homogenity intratumorální fluorescence (n = 14 případů) mělo 7 nádorů „difuzní“ viditelnou fluorescenci, zatímco dalších 7 gliomů mělo „fokální“ místa viditelné fluorescence. Podrobnosti o fluorescenčních údajích našeho souboru jsou uvedeny v tabulce 1 a ilustrační případy na obrázku 1.

5-ALA indukovaná fluorescence a histologické parametry

Celkem bylo během operace odebráno 80 vzorků tkáně od 27 pacientů (medián: 3 vzorky; rozmezí 1-12 vzorků na pacienta). Z nich byla viditelná fluorescence zjištěna u 21 vzorků (26 %), zatímco 59 vzorků (74 %) nevykazovalo viditelnou fluorescenci. Hustota buněk byla významně vyšší u vzorků s pozitivní fluorescencí (2 180 mm2) než u vzorků s negativní fluorescencí (1 510 mm2; p = 0,03). Kromě toho byla míra proliferace hodnocená pomocí indexu značení Ki-67 rovněž významně vyšší u fluorescenčně pozitivních vzorků (2,52 %) než u fluorescenčně negativních vzorků (0,41 %; p = 0,04).

5-ALA indukovaná fluorescence a AED

Vzhledem k předchozí anamnéze předoperačních záchvatů užívalo 15 pacientů (56 %) z našeho studijního souboru před operací AED (finlepsin, levetiracetam, trileptal a/nebo kyselinu valproidovou). Z 15 pacientů s předoperačním užíváním AED nevykazovalo 11 pacientů (73 %) během resekce žádnou viditelnou fluorescenci. Naopak 10 (83 %) ze zbývajících 12 pacientů bez předchozího užívání AED vykazovalo viditelnou fluorescenci. Viditelná fluorescence byla tedy významně častější u pacientů bez užívání AED ve srovnání s pacienty s předoperačním užíváním AED . AED se ukázal být významným faktorem (p = 0,048) ovlivňujícím pravděpodobnost intraoperační fluorescence při adjustaci na další potenciální matoucí faktory (astrocytom/neastrocytom, frontální lokalizace, dávka dexametazonu) v logistickém regresním modelu. Ostatní faktory zahrnuté do modelu nevykazovaly signifikantní vztah s fluorescencí (p > 0,05).

Pooperační průběh

Po operaci vykazovalo 21 pacientů stabilní a čtyři pacienti zlepšení neurologických příznaků. Naopak u zbývajících dvou pacientů bylo zjištěno zhoršení neurologických příznaků. Podle časné pooperační magnetické rezonance bylo hrubé totální resekce dosaženo u 16 pacientů (59 %), subtotální resekce u 8 pacientů (30 %) a parciální resekce u tří pacientů (11 %). Fluorescence nekorelovala s rozsahem resekce.

Diskuse

Použití fluorescence indukované 5-ALA je stále populárnější s cílem maximalizovat rozsah resekce zejména u HGG a zlepšit tak pooperační prognózu pacientů. V tomto smyslu se ukázalo, že fluorescencí navigovaná operace významně zlepšuje míru kompletních resekcí u HGG ve srovnání se samotnou mikrochirurgií a tato inovativní technika také téměř zdvojnásobila 6měsíční přežití bez progrese (16). Nedávno byla viditelná fluorescence PpIX zjištěna také u dalších mozkových lézí, jako jsou meningeomy (19) a metastatické nádory (18, 28).

Současná literatura: Fluorescence 5-ALA v LGG

Dosud byla hodnota fluorescence vyvolané 5-ALA v LGG zkoumána pouze v několika studiích. V tomto smyslu Ishihara a kol. poprvé popsali v roce 2007 aplikaci 5-ALA ve dvou LGG a nezjistili žádnou viditelnou fluorescenci ve více odebraných vzorcích tkáně (29). Kromě toho Ruge et al. publikovali v roce 2009 kazuistiku devítileté dívky, která podstoupila fluorescenčně navigovanou resekci pleomorfního xantoastrocytomu pravého temporálního laloku a zjistili viditelnou fluorescenci nádoru (20). Stockhammer a kol. navíc v roce 2009 publikovali kazuistiku difuzního astrocytomu WHO grade II se střední buněčnou hustotou, vyšší mikrovaskulární hustotou a viditelnou fluorescencí (30). Případy fluorescence pilomyxoidního astrocytomu a pilocytárního astrocytomu publikovali Bernal Garcia et al (31), respektive Choo et al (32). První sérii pacientů s LGG a 5-ALA publikovali Widhalm et al (33). V této studii všech osm difuzně infiltrujících gliomů WHO grade II nevykazovalo během operace žádnou viditelnou fluorescenci vyvolanou 5-ALA. V další studii Ewelt et al. v roce 2011 zaznamenali viditelnou fluorescenci během operace pouze u jednoho (8 %) ze 13 LGG (7). Tři roky po první sérii pacientů publikovali Widhalm et al. v roce 2013 větší sérii a zjistili viditelnou fluorescenci u 4 (9 %) z 33 LGG (34). V další studii Marbachera a kol. vykazovalo viditelnou fluorescenci 8 (40 %) z 20 LGG (18). V roce 2015 Valdes založil viditelnou fluorescenci u 4 (33 %) z 12 analyzovaných LGG (35). A konečně Jaber et al. zjistili v roce 2016 v dosud největší sérii viditelnou fluorescenci u 13 (16 %) z 82 LGG (36). Podle současné literatury je tedy viditelná fluorescence pozorována pouze u menšiny pacientů s LGG.

Současná studie: Fluorescence 5-ALA u LGG

Přes tyto další studie dostupné v současné literatuře naše údaje prokázaly přítomnost viditelné fluorescence u více než poloviny našich případů během operace. Jedním z možných vysvětlení vyššího počtu LGG s viditelnou fluorescencí ve srovnání se současnou literaturou může být to, že jsme použili mírně vyšší dávku 5-ALA (25 mg/kg tělesné hmotnosti) ve srovnání s jinými studiemi (18, 33, 34). Stummer a kol. však porovnávali různé dávky 5-ALA při operacích maligních gliomů (0,2, 2, 20 mg/kg) a dospěli k závěru, že použití dávek 5-ALA vyšších než 20 mg/kg tělesné hmotnosti by pravděpodobně nevedlo ke zlepšení fluorescenčního efektu (37). Dalším vysvětlením může být, že jsme kromě difuzně infiltrujících gliomů zahrnuli i jiné nádorové jednotky, jako jsou pilocytární astrocytomy nebo jeden gangliogliom. Naše slibné výsledky však musí být potvrzeny v nezávislých multicentrických studiích zahrnujících větší soubor pacientů trpících LGG.

Zajímavé je, že jsme skutečně pozorovali viditelnou fluorescenci nejen v ohniskových intratumorálních oblastech, jak bylo popsáno dříve (33, 34), ale také difuzní fluorescenci s homogenním prozářením celého nádoru. Předpokládáme, že přítomnost fokální viditelné fluorescence v LGG by mohla představovat oblasti potenciální budoucí maligní transformace. Budoucí studie by navíc měly objasnit, zda by bylo možné optimalizovat rozsah resekce zejména u LGG s difuzní fluorescencí.

5-ALA fluorescence a histopatologie

V naší studii jsme pozorovali významně vyšší úroveň buněčné hustoty a proliferace ve vzorcích s viditelnou fluorescencí ve srovnání se vzorky bez fluorescence. To je v souladu se dvěma předchozími studiemi Widhalma et al (33, 34). Podobně Widhalm et al zjistili významně vyšší mitotickou frekvenci, hustotu buněk a jaderný pleomorfismus u vzorků s fluorescencí ve srovnání se vzorky bez fluorescence. Kromě toho byl proliferační index hodnocený pomocí MIB-1 LI významně vyšší u vzorků s viditelnou fluorescencí ve srovnání s nefluoreskujícími vzorky. V tomto smyslu tyto předchozí údaje naznačují, že viditelná fluorescence je schopna identifikovat anaplastická ložiska podle histopatologických kritérií WHO (33, 34). Vzhledem k tomu, že jsme v sérii LGG zjistili také významně vyšší hustotu buněk a míru proliferace v oblastech s viditelnou fluorescencí, domníváme se, že 5-ALA může sloužit jako časný marker probíhající maligní transformace původního LGG. K objasnění této důležité otázky jsou zapotřebí budoucí studie s dostatečnými údaji o sledování.

Fluorescence 5-ALA a AED

V současné době je u pacientů s LGG běžnou praxí medikamentózní léčba epileptických záchvatů (38-40). Hefti a spol. prokázali ve studii in-vitro, že syntéza PpIX byla v gliomových buňkách pod vlivem fenytoinu, ale nikoli levetiracetamu, snížena až o 45 % (26). V naší studii jsme zjistili, že viditelná fluorescence byla významně častější u pacientů bez užívání AED ve srovnání s pacienty s předoperačním užíváním AED (r = 0,56; p = 0,045). Z 15 pacientů s předoperačním užíváním AED nevykazovalo 11 pacientů (73 %) během resekce žádnou viditelnou fluorescenci. Naproti tomu 10 (83 %) ze zbývajících 12 pacientů bez předchozího užívání AED vykazovalo viditelnou fluorescenci. Základní mechanismy pozorovaného vlivu AED na viditelnou fluorescenci jsou zatím nejasné. Vliv AED na aktivity dehydrázy kyseliny 5-aminolevulové a uroporfyrinogen I syntetázy v erytrocytech chlapce s epilepsií s nedostatkem vitaminu B6, kterému byla podávána kyselina valproová a karbamazepin, popsali v roce 1989 také Haust a spol. z University of Western Ontario v Kanadě (41). Jednou z možných hypotéz by mohlo být, že AED mají vliv na enzymy syntézy PpIX v mitochondriích gliomových buněk, a tím způsobují přítomnost nebo nepřítomnost fluorescence v LGG. Další studie na buněčných liniích glioblastomu zjistila, že AED (fenytoin/valproáty) a dexamethason mohou inhibovat syntézu PpIX (10). Přesné mechanismy vlivu AED na viditelnou fluorescenci musí být objasněny v budoucích studiích.

Budoucí směry

V budoucnu by naše první pozorování měla být potvrzena v dalších nezávislých studiích s velkým souborem pacientů. Takové rozsáhlejší studie také umožňují analyzovat vliv různých typů AED odděleně. Kromě toho by měl být vliv AED zkoumán také u HGG. V případech s nedostatečnou vizuální fluorescencí by mohly být užitečné metody kvantitativní detekce pro lepší vizualizaci tkáně LGG. V tomto smyslu je konfokální mikroskopie také účinným nástrojem pro vizualizaci buněčné fluorescence vyvolané 5-ALA v LGG a na rozhraní mozku a nádoru (21). Přesvědčivá data z konfokální mikroskopie u velké kohorty pacientů s LGG však zatím stále chybí. Další metodu představuje spektroskopická analýza akumulace PpIX pomocí specifických sond. Tímto přístupem Valdes a spol. zjistili, že akumulaci PpIX lze u LGG detekovat kvantitativně navzdory nízké diagnostické přesnosti vizuální fluorescence (35, 42). Tento slibný přístup si proto zaslouží další zkoumání v budoucích studiích.

Závěry

V této studii jsme zkoumali úlohu 5-ALA v LGG a vliv antiepileptik na intraoperační fluorescenci. Podle našich údajů jsme v naší sérii LGG pozorovali výrazně vyšší míru viditelné fluorescence (52 %) ve srovnání se současnou literaturou. Dále byla v oblastech viditelné fluorescence zaznamenána zvýšená hustota a proliferace buněk. Fluorescence vyvolaná 5-ALA by tedy mohla zlepšit intraoperační vizualizaci podskupiny LGG a mohla by být také užitečným markerem pro optimalizovanou detekci histopatologické heterogenity během operace LGG. Kromě toho se podle našich předběžných údajů zdá, že předoperační užívání AED snižuje přítomnost viditelné fluorescence u těchto nádorů, a proto by tato otázka měla být zohledněna v klinickém prostředí. K potvrzení slibných údajů této současné studie jsou zapotřebí další nezávislé multicentrické studie zahrnující větší soubor pacientů s LGG.

Omezení

Jsme si vědomi, že analýza faktorů ovlivňujících fluorescenci by měla být vícenásobná. Abychom toho dosáhli, použili jsme model logistické regrese. AED se ukázal být významným faktorem ovlivňujícím pravděpodobnost intraoperační fluorescence, když byl v modelu logistické regrese upraven na další potenciální matoucí faktory (astrocytom/neastrocytom, frontální lokalizace, dávka dexametazonu, IDH1-mutace). Buněčná hustota a index Ki67 byly zjištěny pouze u pacientů s vícečetnými biopsiemi (10 pacientů). Bylo zjištěno, že hustota buněk a index Ki67 byly vyšší u bioptických vzorků odebraných z fluoreskující zóny ve srovnání s nefluoreskující zónou. U zbývajících 17 pacientů jsme získali jen málo důkazů o hustotě buněk, přičemž jejich index Ki67 tvořil převážně 4-5 %. Vzhledem k tomu, že se jedná o retrospektivní analýzu zahrnující 27 pacientů, neměli jsme v plánu studovat hustotu buněk a index Ki67. Bohužel nemáme kompletní soubor dat pro Ki67 a hustotu buněk, který bychom mohli zahrnout do modelu logistické regrese.

Etické prohlášení

Tato studie byla provedena místní komisí Národního lékařského výzkumného centra neurochirurgie N. N. Burdenka (Moskva, Rusko) s písemným informovaným souhlasem všech subjektů. Všechny subjekty poskytly písemný informovaný souhlas v souladu s Helsinskou deklarací. Protokol byl schválen místním výborem Národního lékařského výzkumného centra neurochirurgie N. N. Burdenka (Moskva, Rusko).

Příspěvky autorů

SG, GW a AP navrhli studii. LS, VJ a MR shromáždili data. TS, VL, GP a AR vypracovali technické detaily. MG a DC analyzovali data a napsali článek za přispění všech autorů. AS a AP text upravili. KC analyzoval data a napsal článek za přispění všech autorů.

Financování

Předkládaná studie byla financována RFBR podle výzkumných projektů č. 17-00-00158, č. 17-00-00159, a č. 17-00-00157 .

Prohlášení o střetu zájmů

Autoři prohlašují, že výzkum byl prováděn bez jakýchkoli komerčních nebo finančních vztahů, které by mohly být chápány jako potenciální střet zájmů.

Poděkování

Rádi bychom poděkovali za pomoc poskytnutou našimi kolegy: N. N. Burdenko Scientific Research Neurosurgery Institute, Moskva, Rusko za statistickou podporu.

.