Frontiers in Pharmacology

Úvod

Používání přírodních léčiv je starobylou tradicí, která se stále praktikuje, přičemž >60 % světové populace řeší různé zdravotní problémy, včetně rakoviny, pomocí tradiční medicíny jako první volby (Sultana et al., 2014). Léčba rakoviny je však složitá a současné možnosti pro pacienty závisí kromě věku, pohlaví a celkového zdravotního stavu pacienta také na typu a stadiu rakoviny. Ačkoli je chemoterapie v časných stadiích rakoviny obvykle úspěšná, její účinnost závisí na schématu podávání léků a fyziologickém stavu pacienta. Nicméně hlavní obavou týkající se chemoterapie je její toxicita, protože použité léky mají tendenci působit na nádorové i normální buňky, přičemž vysoký proliferační index vytváří u pacientů vedlejší poškození. Kromě toho mohou nádorové buňky vyvinout rezistenci na léčbu, vykazovat metastázy, a tím snižovat odpověď na léčbu a snižovat možnost přežití bez onemocnění. Proto je jednou z klíčových výzev při objevování léků odbourávání toxicity chemoterapeutik a vývoj účinnějších a efektivnějších léků s cílem zlepšit léčbu, dobu rekonvalescence a celkovou kvalitu života pacientů.

Přírodní produkty poskytují bohatý zdroj chemických struktur pro vývoj protinádorové léčby. V oblasti onkologické farmacie je 49 % léčiv používaných v chemoterapii odvozeno z přírodních zdrojů, jako jsou rostliny, mikroorganismy a mořské organismy, nebo je jimi inspirováno (Newman a Cragg, 2016). Příkladem jsou alkaloidy vinca a taxany (látky vážící tubulin), dále podofylotoxiny, antracykliny a etoposidy (inhibitory topoizomerázy) (Da Rocha et al., 2001; Nobili et al., 2009). Tyto příklady ilustrují potenciál přírodních produktů při objevování léčiv.

As jsou sekundární metabolity produkované čeledí Annonaceae (obr. 1). V tradiční medicíně se plody rodu Annona používají k léčbě horečky, bolesti, revmatismu, průjmu a artritidy a jejich listy na cukrovku, bolesti hlavy a nespavost (Moghadamtousi et al., 2015a). Annona reticulate se v Africe používá jako antidysenterikum a antihelmintikum a A. squamosa se v Indii používá k léčbě různých onemocnění včetně zhoubných nádorů (Savithramma et al., 2011). Dále je A. muricata oblíbeným léčivým prostředkem v Americe, Africe a Indii k léčbě rakoviny (Moghadamtousi et al., 2015a), zatímco v Mexiku se A. macroprophyllata, A. muricata a A. purpurea používají k léčbě kožních nádorů a rakoviny žaludku (Alonso-Castro et al., 2011; Brindis et al., 2013). Podle etnofarmakologického přehledu léčivých rostlin v Mexiku by se rod Annona mohl využívat také k léčbě rakoviny tlustého střeva (Jacobo-Herrera et al., 2016). Tyto důkazy naznačují, že AA jsou molekuly s významným bioaktivním potenciálem.

Dosud bylo popsáno více než 500 AK; tyto sloučeniny jsou charakterizovány dlouhým alifatickým řetězcem s α, β-nenasyceným γ-laktonovým kruhem a 0-3 tetrahydrofuranovými (THF) kruhy (Yuan et al., 2015) a vykazují cytotoxickou aktivitu vůči různým lidským nádorovým buněčným liniím (tj. plic, prsu, tlustého střeva, ledvin, slinivky břišní, prostaty, jater a močového měchýře) (přehled v Zeng et al., 1996; Chávez a Mata, 1998; Wang a kol., 2002; Yuan a kol., 2003; Mangal a kol., 2016; Miao a kol., 2016a; Miao a kol., 2016b) kromě protinádorové aktivity in vivo (Chen a kol., 2012a; Chen a kol., 2012b). V tomto článku jsme provedli přehled nejnovějších zpráv o AA v oblasti objevování léčiv v onkologii.

Materiály a metody

Provedli jsme vyhledávání v databázi PubMed pomocí následujících klíčových slov: „acetogeniny a rakovina“, „protinádorová aktivita acetogeninů“, „cytotoxicita acetogeninů“ a „mechanismus účinku acetogeninů“ a další kombinace. Prošli jsme články publikované za posledních 15 let, které byly založeny na dvou kritériích: rostliny s léčebným využitím a metodika frakcionace řízená biologickým testem. Zde uváděné údaje in vitro jsou založeny výhradně na aktivitě čistých sloučenin, zatímco u studií in vivo byly vzhledem k nedostatku testů na zvířecích modelech zvažovány také rostlinné extrakty.

Výsledky a diskuse

Studie in vitro

V oblasti přírodních produktů hledání bioaktivních molekul obvykle zahrnuje frakcionaci extraktů řízenou biologickým testem s cílem najít hlavní molekulu nebo molekuly odpovědné za aktivitu. Mnoho sekundárních metabolitů však může působit na více charakteristických znaků rakoviny. Obecně se farmaceutický průmysl zajímá o léčiva, která vykazují více než jednu molekulární interakci a zahrnují různé molekulární cíle.

Acetogeniny jsou molekuly s velkým potenciálem pro budoucí terapii rakoviny. Jejich nejvýznamnější biologickou aktivitou je inhibice mitochondriálního komplexu I díky jejich bis-THF struktuře. Již dříve bylo totiž zaznamenáno, že mono-THF AA nesoucí alkylový řetězec, který spojuje laktonovou část se skupinou THF, jsou nekompetitivními inhibitory komplexu I (tj. NADH:ubichinon oxidoreduktázy) v dýchacím řetězci, což vede k blokádě fosforylační oxidace a následnému snížení produkce ATP (Tormo et al., 1999; Chen et al., 2012). Taková inhibice zahrnuje velkou skupinu drah, které mohou vyvolat buněčnou smrt, včetně apoptózy a autofagie, nebo působit v jiných metabolických sítích jako inhibitory enzymu laktátdehydrogenázy A, jako antioxidant nebo zastavením buněčného cyklu.

Mimo to, A. muricata (Moghadamtousi et al., 2015a) a A. squamosa L. (Chen et al., 2012a; Chen et al., 2012b; Chen et al., 2012c; Chen et al., 2016) byla zaznamenána cytotoxická aktivita vůči několika lidským nebo jiným savčím nádorovým buněčným liniím. Zejména anoskvatiny A (1) a B (2) vykazují selektivitu vůči buněčným liniím MCF-7 a A-549 (Chen et al., 2012c). V tabulce 1 jsou uvedeny nejnověji objevené AAs, které vykazují cytotoxickou aktivitu, kromě dalších méně nově objevených sloučenin, které vykazují antineoplastickou aktivitu in vivo (tabulka 2).

Apoptóza je přirozená strategie buněčné smrti, která zabíjí nepotřebné nebo poškozené buňky. Hlavními geny zapojenými do tohoto procesu jsou p53 a rodina bcl2; první z nich je nádorový supresor, zatímco druhé mohou být buď proapoptotické (mimo jiné BAD, BAX a BAK), nebo antiapoptotické (bcl2 a bcl-x) (Okada a Mak, 2004). Primární funkcí p53 je zabránit replikaci buněk s poškozenou DNA. Proto je p53 neaktivní a poškozené buňky dále rostou a replikují mutace DNA, což vede k onemocněním, jako je rakovina (Igney a Krammer, 2002; Okada a Mak, 2004). Dosavadní výzkum lze tedy rozdělit do dvou hlavních témat: indukce apoptózy nebo mechanismy rezistence vůči apoptóze.

Současné chemoterapie indukující apoptózu způsobují závažné sekundární účinky na pacienty. Hledání méně toxických léčiv je proto prioritou a očekává se, že přírodní produkty pomohou při vývoji léčiv modulujících apoptózu. V této souvislosti AŘ zvyšují aktivitu kaspázy 3 a 8 (efektory apoptózy) a zároveň snižují expresi survivinu a Bcl-2, čímž posilují apoptózu. AA annonacin (3) podporuje apoptózu v nádorových buňkách aktivací dráhy kaspázy 3 a Bax (Yuan et al., 2003), zatímco skvamocin indukuje apoptózu prostřednictvím exprese proapoptotických genů Bax a Bad, což vede ke štěpení PARP a zvýšené aktivitě kaspázy 3 v nádorových buňkách močového měchýře T24 (Yuan et al., 2006). To je v kontrastu s předchozími výsledky, kdy skvamocin nevyvolával apoptózu u buněk rakoviny prsu, ale inhiboval proliferaci blokováním buněčného cyklu ve fázi G1 (Raynaud et al., 1999).

Metanolový extrakt z A. reticulata inhibuje expresi kaspáz 6 a 9 u buněk rakoviny tlustého střeva a jater (Mondal et al..), 2007), zatímco organické a vodné extrakty A. squamosa snižují expresi Bcl-2 u buněk rakoviny prsu MCF-7 a leukemických buněk K-562, což ukazuje na jejich účinek jako induktorů apoptózy (Pardhasaradhi et al., 2005). Kromě toho extrakt z listů A. muricata indukuje expresi kaspáz 3 a 9 a inhibuje buněčnou proliferaci snížením fosfo-ERK a fosfo-AKT v buňkách MIA PaCa-2 (Yiallouris et al., 2018).

As také vedou k zástavě cyklu, což má vliv na proliferaci nádorových buněk. AAs regulují buněčný cyklus v přechodu G1/S inhibicí exprese cyklinu D1 v buňkách lidského hepatocelulárního karcinomu (Qian et al., 2015). V této souvislosti extrakt z A. muricata zastavuje buněčný cyklus ve fázi G1 a snižuje počet buněk ve fázi S v závislosti na koncentraci snížením exprese cyklinu D1, důležitého regulačního proteinu buněčného cyklu (Torres et al., 2012). Podobný výsledek byl pozorován u skvamocinu, který zastavuje buňky ve fázi G1 u buněk rakoviny močového měchýře T24 (Yuan et al., 2006). Navzdory významu buněčného cyklu se jen málo studií zabývalo tím, jak AŘ ovlivňují tento mechanismus.

Aerobní glykolýza, mechanismus používaný nádorovými buňkami k získávání energie za nepřítomnosti kyslíku (Figueroa-González et al., 2016; García-Castillo et al., 2017), je také cílem AŘ. Různé proteiny a glykolytické enzymy jsou v nádorových buňkách regulovány HIF-1, důležitým transkripčním faktorem zapojeným do aerobní glykolýzy nádoru. Zajímavé je, že extrakt z A. muricata snižoval expresi HIF-1α a NF-κB a hladiny glukózového transportéru GLUT1 a enzymů HKII a LDHA v buňkách rakoviny slinivky břišní (Torres et al., 2012). Kromě toho extrakt z listů A. muricata vykazoval antiproliferační účinky u nádorových buněčných linií a podporoval buněčnou smrt inhibicí pump NKA a SERCA (Yiallouris et al., 2018).

Na druhé straně gen MDR1 kóduje glykoprotein P buněčné membrány, klíčový transportní protein, který vytlačuje protinádorová léčiva zevnitř buněk, čímž omezuje jejich intracelulární akumulaci a snižuje jejich toxicitu (Figueroa-González et al., 2012). Sekundární metabolity, jako jsou flavonoly, ginsenosidy, polyfenoly, alkaloidy a pryskyřičné glykosidy, vykazují zajímavé výsledky v modulaci P-gp v nádorových buněčných liniích (Phang et al., 1993; Beck et al., 1988; Silva et al., 2001; Jodoin et al., 2002; Zhou et al., 2004; Figueroa-González et al., 2012). Kromě toho mohou aromatické uhlovodíky snižovat expresi genů MDR1 a MRP1 u lidského hepatocelulárního karcinomu rezistentního na léčiva, stejně jako expresi topoizomerázy IIα a glutathion S-transferázyΠ (Qian et al., 2015).

V poslední době vyvolala zájem autofagie jako mechanismus buněčné smrti. Autofagie je katabolický proces, který eukaryotické buňky aktivují při stresu, například při hladovění buněk nebo přítomnosti patogenů (He a Klionsky, 2009). Během tohoto procesu buňka recykluje proteiny nebo nefunkční organely v několikastupňovém procesu zahrnujícím lysozomální degradaci, aby nakonec obnovila buněčnou homeostázu (Kenific a Debnath, 2015). Deregulace toku autofagie jako takové by mohla vést ke vzniku rakoviny, protože recyklace makromolekul, nefunkčních organel a proteinů zajišťuje rakovinným buňkám vysoké metabolické nároky na buněčnou proliferaci (Kenific a Debnath, 2015; García-Castillo et al., 2017). V tomto scénáři se autofagie stala atraktivním terapeutickým cílem a aromatické uhlovodíky by mohly být schopny tento proces inhibovat. Liu et al. (2012) uvedli, že sloučenina AA005 (analog acetogeninu) inhibuje produkci ATP, aktivuje AMPK a blokuje dráhu mTOR komplexu 1, aby nakonec indukovala autofagii v buňkách rakoviny tlustého střeva a zastavila buněčný cyklus ve fázi G1. Tato sloučenina je napodobeninou AAs, kde ethylenglykoletherová jednotka nahrazuje dva THF kruhy. Taková chemická modalita propůjčuje vynikající biologickou aktivitu, což je příklad plasticity AAs, který je třeba považovat za inspiraci k vytvoření nových a účinnějších molekul s různými farmakologickými cíli.

Protinádorová aktivita acetogeninů na zvířecích modelech

Údaje týkající se protinádorové aktivity AAs a extraktů z Annony jsou obzvláště slibné, protože tyto sloučeniny vykazovaly protinádorovou aktivitu na zvířecích modelech. Studie in vivo poskytují klíčové informace o působení léčiva v celém organismu a umožňují vyhodnotit nejen jejich protinádorový účinek, ale také jejich toxicitu v různých orgánech. Důležité je, že zvířata jsou pokusnými subjekty, které umožňují provádět klinické sledování, včetně hodnocení klinických výsledků, progrese a přežití bez onemocnění a recidivy onemocnění.

Etylacetátový extrakt z A. squamosa, který je bohatý na AAs 12,15-cis-squamostatin-A (4) a bullatacin (5), snižoval nádorový růst hepatocelulárních nádorů u myší s maximální mírou inhibice 69,55 % ve srovnání s pozitivní kontrolou (cyklofosfamid) (Chen et al..), 2012b). Předpokládalo se, že za cytotoxickou aktivitu rostlinného přípravku může být zodpovědná konfigurace cis v jedné ze složek. Bullatacin (5) izolovaný z A. squamosa v dávce 15 μg/kg navíc účinně snížil růst nádoru u myší nesoucích xenografty S180 a HepS o 65,8 a 63,4 %. Tyto výsledky jsou lepší než výsledky získané při použití vyšších koncentrací taxolu (40 μg/kg). Bullatacin (5) má přilehlou bis-THF část a tři hydroxy skupiny, které pravděpodobně tvoří bioaktivní strukturu (Chen et al., 2012a).

Olej ze semen A. squamosa inhiboval 53,54 % růstu nádoru u myší nesoucích buňky H22 (Chen et al., 2016) a snížil expresi IL-6, Jak a různých fosforylovaných přenašečů signálu a aktivátorů transkripční dráhy p-Stat3. Bylo také zjištěno, že α, β-nenasycené γ-laktonové části přítomné v AA jsou akceptory Michaelovy reakce (Ji et al., 2012), které inhibují aktivaci Stat3, terapeutického cíle zapojeného do buněčné proliferace, apoptózy, zánětu a angiogeneze (Cafferkey a Chau, 2016). Extrakt z A. muricata zpomaloval růst nádorů v xenografech slinivky břišní (Yiallouris et al., 2018), snižuje metastazování snížením hladiny metaloproteinázy-9 a podporuje smrt nádorových buněk prostřednictvím nekrózy (Torres et al., 2012). V xenograftu prostaty extrakt z A. muricata obohacený o flavonoidy zlepšil biologickou dostupnost a vykazoval nižší toxicitu než extrakt obohacený o AO (Yang et al., 2015).

Laherradurin (6) a cherimolin-2 (7) byly izolovány z léčivé rostliny A. diversifolia a testovány in vivo proti buňkám rakoviny děložního čípku a kolorekta (Schlie-Guzmán et al., 2009). Obě AO zmenšily velikost nádorů HeLa s podobnými hodnotami jako doxorubicin; obě sloučeniny rovněž vykazovaly antiproliferační aktivitu in vitro proti stejné nádorové buněčné linii. Tyto výsledky jsou ve shodě s jinými zprávami, kde byla jako nejaktivnější uvedena molekula laherradurinu (6), která má přilehlé bis-THF části a β-hydroxy γ-methyl γ-laktonovou strukturu, zatímco cherimolin-2 (7), který obsahuje nepřilehlou bis-THF část a γ-laktonovou jednotku, vykazuje sníženou protinádorovou aktivitu. V tabulce 2 je uvedena protinádorová aktivita různých aromatických uhlovodíků na zvířecích modelech.

Studie toxicity

Experimenty se zvířaty by měly zahrnovat protokoly akutní orální toxicity pro testování chemických látek a pozorování příznaků toxicity; ty minimalizují počet potřebných zvířat, zajišťují správné podávání dávek při pokusech a zabraňují utrpení (OECD, 2008). Dosud však existuje jen málo informací o toxicitě aromatických uhlovodíků nebo extraktů z Annony. Například LD50 ethanolového extraktu z A. muricata u myší byla podle Sousa et al. (2010) 1,67 g/kg. Arthur et al. (2011) uvedli LD50 (<5 g/kg) vodného extraktu, přičemž zaznamenali, že vyšší dávka by mohla poškodit ledviny. Také bylo zjištěno, že extrakt ze semen A. squamosa může způsobit poškození jater (Miao et al., 2016b) a extrakt z A. muricata obohacený o flavonoidy vykazoval sníženou toxicitu u xenograftu prostaty (Yang et al., 2015). Cherimolin-2 izolovaný z A. diversifolia vykazoval toxické účinky a smrt u xenograftu SW480 v dávkách nad 5 mg/kg/den (Schlie-Guzmán et al., 2009).

Jak již bylo vysvětleno, AAs mohou inhibovat komplex 1 dýchacího řetězce prostřednictvím transportu elektronů v mitochondriích. AAs se připojují a blokují enzym NADH, který je v nádorových buňkách obvykle nadměrně exprimován, čímž inhibují produkci ATP, což nakonec vede k buněčné smrti. Pravděpodobně takový mechanismus naznačuje, že AAs jsou „neškodné“ pro normální buňky; přesto by měly být provedeny další studie, aby byla zajištěna selektivita těchto molekul.

Závěr

Chemoterapie není specifická pro nádorové buňky; způsobuje několik nežádoucích vedlejších účinků, jako je poškození normálních tkání a orgánů. Nejdůležitějším aspektem konvenční chemoterapie však je, že ve značném počtu případů si nádorové buňky vyvinou mechanismy rezistence, které umožňují progresi nádoru a metastazování.

Hledání nových léčiv v přírodě není novinkou. V současné době se k léčbě různých onemocnění používá několik derivátů přírodních látek. Například taxol (paklitaxel), který byl objeven na základě tradičních znalostí, je považován za nejvýnosnější léčbu rakoviny na trhu. Je zajímavé, že paklitaxel je antimitotické léčivo inhibující proliferaci buněk v buněčných kulturách, ale v nádorech bylo zdokumentováno, že vyvolává multipolární dělení, což znázorňuje, jak může mít molekula různé mechanismy účinku v závislosti na podmínkách in vitro nebo u pacienta. Tento alkaloid má 30letou historii a ilustruje hlavní překážky práce s přírodními produkty, jejich omezenou biologickou dostupnost a náklady na výrobu, a také neuvěřitelnou účinnost zabíjející nádorové buňky.

Acetogeniny jsou univerzální protinádorové molekuly způsobující smrt nádorových buněk různými mechanismy. Mohou modulovat vylučování chemoterapeutických léčiv z nádorových buněk a jsou silnými induktory apoptózy. Jejich bioaktivní flexibilita se odráží v jejich schopnosti regulovat buněčný cyklus zastavením buněk ve fázi G1, podporovat apoptózu inhibicí různých proteinů, a dokonce indukovat autofagii. Kromě toho vynikají jejich metabolické interakce, konkrétně související s transkripčními faktory HIF1 a STAT3 a jejich dopady na spotřebu energie, angiogenezi, zánět a metastazování. Protinádorová aktivita AAs in vivo je slibná (příkladem jsou bullatacin, laherradurin a cherimolin-2). Předklinické údaje však nejsou dostatečné k tomu, aby bylo možné dobře pochopit farmakodynamiku a kinetiku AAs, a k zajištění bezpečnosti a možnosti klinických zkoušek na lidech je zapotřebí více testů akutní toxicity a rozpustnosti. Kromě toho by začlenění různých ligandů (tj. protilátek, vitaminů a peptidů) nebo příprava derivátů specifických pro nádory mohly zlepšit aktivitu AA a získat vhodnější léčiva.

Rostlinné extrakty jsou chemicky složité a jejich léčebné vlastnosti často závisí na interakcích mezi sloučeninami a jejich poměrech v extraktu. Pokud jde o dopady AA na rakovinu, je stále co objevovat. Tato oblast poskytuje možnost nalezení nových molekul pro léčbu tohoto komplexního onemocnění. Standardizace extraktů je proto možnou alternativou k používání rostlinných doplňků, zejména u rostlin, kde je farmakologická aktivita založena na kombinaci více než jedné sloučeniny. V tomto minipřehledu jsou uvedeny některé dříve studované AŘ, které vykazují protinádorovou aktivitu a mohly by mít budoucnost v klinickém výzkumu rakoviny.

Příspěvky autorů

NJ-H se podílel na koncepci, psaní a diskusi článku; CP-P významně přispěl k diskusi a revizi pro rukopis; VC-T připravil všechny obrázky a tabulky; MM-V a AG-E přispěli k chemické části článku; AZ-D významně přispěl v diskusi k článku v oblasti molekulární biologie. Všichni autoři diskutovali, revidovali a schválili konečnou verzi rukopisu určenou k publikaci.

Financování

Tato práce byla podpořena Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), Mexiko (grant číslo 285884). VC-T byl financován organizací CONACYT (doktorandský grant číslo 267787).

Prohlášení o střetu zájmů

Autoři prohlašují, že výzkum byl prováděn bez jakýchkoli komerčních nebo finančních vztahů, které by mohly být chápány jako potenciální střet zájmů.

Poděkování

NJ-H děkuje společnosti CONACYT za financování projektu.

.