Funkční mozková konektivita v klidovém stavu bez bolesti předpovídá individuální citlivost na bolest

Obecné úvahy

Plán studie byl vytvořen s pečlivým přihlédnutím k nedávným doporučením, požadavkům a standardům pro neurozobrazovací biomarkery50 (neuromarkery) a motivován následujícími myšlenkami.

Maximalizace prediktivní výkonnosti

Použili jsme standardizovaný postup předzpracování, abychom zajistili optimální citlivost neuromarkeru, protože dostatečná velikost účinku je základním požadavkem jakékoli klinické užitečnosti50. Použili jsme vysoce přesné zarovnání obrazu, zahrnující individuální anatomii při extrakci dat časových řad fMRI. Kromě toho jsme přijali nedávná doporučení a protokoly51 týkající se redukce artefaktů a optimalizovali jsme náš pracovní postup tak, aby vyhovoval zvláštním potřebám analýzy založené na konektivitě. Použili jsme naši vlastní, open-source softwarovou knihovnu v jazyce Python Pipelines Utilising a Modular Inventory (PUMI, https://github.com/spisakt/PUMI), která vychází z nipype52 , komunitního projektu v jazyce Python poskytujícího jednotné rozhraní ke stávajícímu neurozobrazovacímu softwaru, a částečně jsme znovu použili kód z open-source projektů C-PAC53 a niworkflows54. K využití bohatých dat, která poskytují funkční sítě mozku v klidovém stavu, a k potenciálnímu využití hyperaktivity fMRI55 byl využit přístup prediktivního modelování (strojového učení).

Ohodnocení prediktivní síly v reálných podmínkách

Použili jsme předem registrovanou, externí validační strategii, která striktně oddělovala trénink modelu a hodnocení výkonnosti. Pro trénink modelu jsme použili výhradně data ze studie 1. Pro validaci jsme provedli dvě nezávislé dílčí studie (studie 2 a 3) v různých výzkumných centrech, s různým vybavením a různými výzkumnými pracovníky. Použili jsme liberální sladění výzkumných prostředí, což umožnilo přiměřenou heterogenitu postupů, vybavení, zobrazovacích sekvencí, jazyka komunikace mezi účastníky a výzkumníky napříč studijními centry a zavedlo přiměřenou heterogenitu validačního postupu, abychom zajistili zobecnitelnost.

Ujištění, že predikce je řízena nervovým signálem a je specifická pro citlivost na bolest

Abychom se ujistili, že navrhovaný marker citlivosti na bolest je skutečně řízen nervovými signály spojenými s citlivostí na bolest, vyhodnotili jsme korelaci predikovaného skóre s různými předem definovanými (a předem registrovanými) matoucími a validujícími proměnnými.

Zajistili jsme dostupnost výsledků

Použili jsme komplexní předregistraci a zdrojový kód metody jsme zpřístupnili jako open-source a volně k dispozici komunitě. Navíc jsme poskytli na platformě nezávislý, snadno použitelný kontejner docker, který poskytuje možnost použít náš prediktivní model jako výzkumný produkt50 a získat tak out-of-the box predikce citlivosti na bolest z jakýchkoli vhodných souborů zobrazovacích dat.

Účastníci

Tří dílčích studií se zúčastnilo celkem N = 116 zdravých, mladých dobrovolníků. Věk a pohlaví účastníků jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1. Studie 1 zahrnovala N1 = 39 účastníků (stejný vzorek jako v ref. 8). Byla provedena na Ruhr University Bochum (Německo) MZ a TSW a použita jako tréninkový vzorek pro predikci citlivosti na bolest založenou na strojovém učení a navíc sloužila jako základ pro interní validaci predikce. Studie 2 a 3 (N2 = 48, N3 = 29) byly provedeny v univerzitní nemocnici v Essenu (Německo) FS a TS a na univerzitě v Szegedu (Maďarsko) BK a TK a sloužily jako vzorky pro externí validaci. Zařazovací a vyřazovací kritéria byla ve všech třech centrech do značné míry shodná a jsou uvedena v tabulce 3. Politika náboru a úhrady nákladů se v jednotlivých centrech lišila; účastníci obdrželi 20 €/h ve studiích 1 a 2 a žádnou úhradu ve studii 3.

Kovový implantát, neodstranitelný piercing, peacemaker, tetování v poloze hlava/krk, těhotenství nebo známá klaustrofobie byly považovány za kontraindikaci pro měření MR. Účastníci se museli zdržet konzumace kofeinu dvě hodiny před experimentem (s výjimkou studie 3) a konzumace alkoholu v den testování a předchozí den.

Studie byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací, splňuje všechny příslušné etické předpisy pro práci s lidskými účastníky a byla schválena místními nebo národními etickými komisemi (registrační čísla: 4974-14, 18-8020-BO a 057617/2015/OTIG na Ruhr University Bochum, University Hospital Essen a ETT TUKEB Hungary). Všichni účastníci dali před testováním písemný informovaný souhlas.

Snímkování a kvantitativní senzorické testování (QST) byly ve studii 1 provedeny ve stejný den a ve studiích 2 a 3 v průměru s odstupem 2-3 dnů (podrobnosti viz doplňková tabulka 1). Měření MRI vždy předcházelo sezení QST.

Měření-funkční MRI

Všem účastníkům byla pořízena anatomická měření s vysokým rozlišením a měření fMRI v klidovém stavu s otevřenýma očima. Parametry skenování (včetně vybavení) se v jednotlivých centrech lišily a jsou uvedeny v tabulce 4. Během měření byli účastníci poučeni, aby leželi klidně a uvolněně, neusínali a vyhýbali se jakémukoli pohybu. K omezení pohybů hlavy byly použity pěnové podložky a ve studiích 1 a 2 pneumatické polštáře. Všechna anatomická měření MRI byla prověřena na náhodné nálezy.

Měření-QST

Prahy bolesti z tepla (HPT), chladu (CPT) a mechanické bolesti (MPT) byly získány podle protokolu QST28. Jako další kontrolní měření byly získány prahy detekce tepla (WDT), chladu (CDT) a ve studii 2 a studii 3 prahy detekce mechanické bolesti (MDT). Všechna senzorická měření byla získána z dlaně levého předloktí, proximálně od zápěstního hřebene. V rámci QST se tepelné prahy stanovují metodou limitů. Za tímto účelem byly na kůži aplikovány zvyšující se a snižující se teploty pomocí termostimulátoru MSA (Somedic, Hörby, Švédsko) ve studii 1 a termostimulátorů Pathway (Medoc Ltd., Ramat Yishai, Izrael) ve studiích 2 a 3. Ve studiích 3 a 4 byly použity termostimulátory Pathway (Medoc Ltd., Ramat Yishai, Izrael). Ve všech studiích byly termody ATS použity na povrchu kůže o rozměrech 30 × 30 mm se základní teplotou 32 °C. Účastníci byli instruováni, aby stisknutím tlačítka indikovali nástup bolesti. Pro všechny tepelné prahy bylo provedeno 6, nikoli 3 (jako v původním protokolu)28 opakování podnětů, aby se snížil rozptyl mezi subjekty. Kromě toho bylo první měření vyřazeno z analýzy jako testovací podnět. HPT a CPT byly vypočteny jako aritmetické průměry pěti zbývajících prahových teplot. MPT a MDT byly stanoveny pomocí schodišťové metody. Na dlaň levého předloktí bylo střídavě aplikováno pět rostoucích a pět klesajících podnětů pinprick (MRC Systems, Heidelberg, Německo), přičemž účastník byl instruován, aby podněty kategorizoval jako nepříjemné nebo nepříjemné. Mechanický detekční práh byl hodnocen obdobně jako u stimulace von Freyovými vlákny. MPT a MDT byly vypočteny jako logaritmicky transformovaný geometrický průměr síly stanovený v pěti vzestupných a sestupných bězích po schodišti s prahovou hodnotou.

Další opatření

Před všemi měřeními byl zaznamenán věk, pohlaví, vlastní výška, hmotnost a u účastnic datum prvního dne poslední menstruace a užívání antikoncepce. U studií 1 a 2 se navíc zaznamenávala vlastní týdenní spotřeba alkoholu a úroveň vzdělání (základní škola, střední škola, vysoká škola). Před QST účastníci vyplnili dotazník citlivosti na bolest (PSQ)56, škálu katastrofizace bolesti (PCS)57, dotazník úzkosti podle stavu (STAI)58, krátkou německou verzi škály deprese (ADS-K, Center for Epidemiologic Studies)59 a ve studiích 2 a 3 navíc Pittsburghský index kvality spánku (PSQI)60 a dotazník vnímaného stresu (PSQ20)61 . Ve studiích 2 a 3 byl krevní tlak měřen jak před MRI, tak před měřením QST. U vzorku 1 byly navíc k dispozici hodnoty T50 z paralelního experimentu provedeného den před vyšetřením fMRI. T50 představuje teplotu (ve °C) potřebnou k vyvolání tepelné bolesti ohodnocené hodnotou 50 (na stupnici od 0, žádná bolest, po 100 nesnesitelná bolest). Hodnoty T50 byly získány z nelineární (polynomiální druhého řádu) interpolace hodnocení získaných v reakci na 15 tonických tepelně-bolestivých podnětů (trvání: 16 s) v rozmezí 42,5 °C až 48 °C, prezentovaných pseudonáhodným mřížkovým způsobem.

Výpočet citlivosti na bolest

Cílovou proměnnou pro predikci byla jediná složená míra individuální citlivosti na bolest shrnující HPT, CPT a MPT, jak je definována v ref. 8.

Ve studii 1 byly HPT, CPT a MPT transformovány do Z (průměr centrován a standardizován) a HPT, stejně jako MPT, byly invertovány (vynásobeny -1), takže vyšší hodnoty Z označovaly vyšší citlivost na bolest. Poté byl pro každého účastníka vypočten aritmetický průměr Z-transformovaných proměnných a definován jako skóre citlivosti na bolest. Ve studiích 2 a 3 byl použit stejný postup s tím rozdílem, že Z-transformace byla založena na populačním průměru a směrodatné odchylce studie 1, aby bylo zajištěno, že ve všech studiích byla použita stejná stupnice. Extrémní hodnoty QST byly definovány pomocí normativních 95% percentilů uvedených v ref. 28; účastníci vykazující extrémní hodnoty HPT, CPT nebo MPT alespoň ve dvou ze tří modalit byli vyloučeni. Výsledkem tohoto screeningu bylo vyloučení 0, 3 a 2 účastníků ve vzorcích 1, 2 a 3 (doplňková tabulka 2).

předzpracování fMRI

Jelikož funkční konektivita založená na fMRI je náchylná k artefaktům pohybu ve skeneru62,63, je pro úspěšnou predikci založenou na konektivitě klíčové vhodné předzpracování a vyčištění signálu. Data funkční MRI v klidovém stavu byla ve všech třech studiích předzpracována identicky. Použitý pracovní postup založený na nipype je znázorněn na doplňkovém obr. 1. Využíval neurozobrazovací software třetích stran, kód upravený ze softwarových nástrojů C-PAC53 a niworkflows54 a vlastní pythonovské rutiny.

Extrakce mozku z anatomických i strukturálních snímků a také segmentace tkání z anatomických snímků byla provedena pomocí sázky FSL a fast64. Anatomické snímky byly lineárně a nelineárně koregistrovány ke standardní šabloně mozku MNI152 s rozlišením 1 mm pomocí ANTs65 (zdrojový kód viz https://gist.github.com/spisakt/0caa7ec4bc18d3ed736d3a4e49da7415).

Funkční snímky byly koregistrovány k anatomickým snímkům pomocí registrační techniky FSL flirt založené na hranicích. Všechny výsledné transformace byly uloženy pro další použití. Předzpracování funkčních obrazů probíhalo v nativním obrazovém prostoru, bez převzorkování. Korekce pohybu na základě vyrovnání byla provedena pomocí FSL mcflirt. Výsledných šest odhadů pohybu hlavy (3 rotace, 3 translace), jejich čtvercové verze, jejich derivace a čtvercové derivace (známé jako Friston-24-expansion66) bylo vypočteno a uloženo pro korekci rušivých vlivů. Kromě toho byl pohyb hlavy shrnut jako časová řada posunutí (FD) podle Powerovy metody63 , která byla použita při cenzurování a vyřazování dat. Po korekci pohybu byly odlehlé hodnoty (např. hroty pohybu) v časových řadách dat zeslabeny pomocí AFNI despike67. Spojení erodovaných map bílé hmoty a masek komor bylo transformováno do nativního funkčního prostoru a použito pro extrakci šumu-signálu pro anatomickou korekci CompCor68.

V kroku rušivé regrese bylo z dat časových řad pomocí obecného lineárního modelu odstraněno 6 parametrů CompCor (6 prvních hlavních komponent časových řad šumu-oblasti), parametry pohybu Friston-24 a lineární trend. U zbytkových dat byla provedena časová pásmová filtrace pomocí 3DBandpass AFNI, aby bylo zachováno frekvenční pásmo 0,008-0,08 Hz. Předpokládá se, že předchozí použití despike AFNI utlumí aliasing zbytkových pohybových artefaktů do sousedních časových snímků během pásmové filtrace69. K dalšímu zmírnění vlivu pohybových artefaktů byly z dat vyřazeny potenciálně pohybem kontaminované časové snímky, definované konzervativním prahem FD > 0,15 mm (tzv. scrubbing dat)70 . Účastníci byli z další analýzy vyloučeni, pokud průměrná hodnota FD překročila 0,15 mm nebo pokud bylo vyčištěno více než 30 % snímků. To vedlo k vyloučení 4, 8 a 7 účastníků ve vzorcích 1, 2 a 3 (doplňková tabulka 2). V průběhu celého pracovního postupu byla prováděna kontrola kvality (kontrola registrace, kobercové grafy, viz např. doplňkové obr. 2-4).

Analýza funkční konektivity

Do nativního funkčního prostoru byla transformována 122parcelová verze multirezolučního funkčního atlasu mozku MIST71 a masky šedé hmoty získané z anatomického obrazu. Tento atlas (zkonstruovaný metodou BASC, tj. bootstrapovou analýzou stabilních shluků) se nedávno ukázal jako dobře fungující při prediktivním modelování založeném na konektivitě72. Oblasti atlasu v nativním prostoru byly maskovány maskami šedé hmoty, které byly získány z anatomického obrazu a dříve transformovány do funkčního prostoru. Při této atlasově-individualizační technice bude výsledný regionální signál pocházet – s vysokou pravděpodobností – z voxelů šedé hmoty u každého subjektu (což jsme u všech subjektů pečlivě ručně kontrolovali), zatímco při konvenční metodě je u každého subjektu zahrnut proměnlivý poměr voxelů šedé a bílé hmoty. Proto se očekává, že vstupní informace z procesu segmentace tkání sníží variabilitu mezi jednotlivými subjekty (příklady viz doplňkový obr. 5). Časové řady voxelů byly zprůměrovány přes tyto individualizované oblasti MIST a spolu s průměrným signálem šedé hmoty byly ponechány pro analýzu konektivity založenou na grafech.

Regionální časové řady byly pro účely vizualizace uspořádány do rozsáhlých funkčních modulů (definovaných 7parcelovým atlasem MIST) (obr. 1). Byla vypočtena částečná korelace napříč všemi dvojicemi regionů (a globální šedou hmotou), jak je implementováno v pythonovském modulu nilearn73. K vyloučení nepřímé konektivity74 byly použity spíše částečné než prosté korelace. Náš přístup k modelování grafů zajistil, že se s globálním signálem šedé hmoty při výpočtu parciálních korelačních koeficientů zachází jako se zmatkem, ale zároveň jej také považoval za signál zájmu, protože může reprezentovat procesy související s vigilitou75. Dílčí korelační koeficienty byly uspořádány do symetrických matic konektivity 123 x 123 (122 oblastí + globální signál šedé hmoty). Horní trojúhelník těchto matic byl použit jako prostor příznaků pro prediktivní modelování založené na strojovém učení.

Trénování a validace prediktivního modelu

Údaje o funkční konektivitě celého mozku v klidovém stavu studie 1 (N1 = 35, po všech vyloučeních, jako v ref. 8, doplňková tabulka 2) byly použity jako vstupní prostor příznaků (P = 7503 příznaků na účastníka) pro predikci individuálního skóre citlivosti na bolest, což vedlo k nastavení velkého P a malého N.

Zkonstruovali jsme pipeline strojového učení (https://github.com/spisakt/RPN-signature/blob/master/PAINTeR/model.py) v prostředí scikit-learn76 , která se skládá z robustního škálování rysů (odstraňuje medián a škáluje pomocí kvantilů dat), předvýběru rysů77, výběru K nejlepších rysů s nejsilnějším vztahem k cílové proměnné a regresního modelu Elastic Net78 (lineární model s kombinovanými L1 a L2-normami jako regulátorem). Použití elastické sítě bylo rozhodnutím učiněným před analýzou. Naší hlavní motivací pro volbu elastické sítě bylo, že umožňuje optimalizovat řídkost (L1 vs. L2 regularizace) jako hyperparametr, takže jsme nemuseli přijímat žádné apriorní předpoklady o řídkosti diskriminační základní pravdy (zdůvodnění viz cit.79 ). Souhrnně řečeno, volnými hyperparametry pipeline strojového učení byly počet předem vybraných rysů (K), poměr L1/L2-regularizace a váha (alfa) regularizace. Hyperparametry byly optimalizovány pomocí postupu hledání v mřížce a záporné střední kvadratické chyby jako nákladové funkce. Hodnoty pro K se pohybovaly od 10 do 200 s přírůstkem 5 a zahrnovaly poměr L1/L2 pro alfa. Optimalizace hyperparametrů byla provedena křížovou validací s vynecháním jednoho účastníka (fáze interní validace). Křížová validace zahrnovala kompletní potrubí strojového učení, aby se zabránilo zavedení závislostí mezi trénovacími a testovacími vzorky. Všimněte si, že předzpracování fMRI bylo mezi subjekty nezávislé, a proto nebylo zahrnuto do křížové validace. Bylo zjištěno, že optimální hyperparametry jsou K = 25, poměr L1/L2 = 0,999 a alfa = 0,005.

Externí validace byla provedena aplikací RPN-signatury na data fMRI studií 2 a 3 (N2 = 37, N3 = 19, po vyloučení, doplňková tabulka 2), a to jednoduše použitím transformace (škálování) příznaků získané na vzorku 1 a následným výpočtem bodového součinu mezi jednotlivými maticemi konektivity a nenulovými váhami příznaků získanými ve vzorku 1. Na základě této transformace bylo zjištěno, že hyperparametry jsou optimální. Výsledné předpovědi byly porovnány s pozorovanými skóre citlivosti na bolest na základě QST výpočtem střední absolutní chyby (MAE), střední kvadratické chyby (MSE) a vysvětleného rozptylu. Pro všechny tři míry byly pomocí balíčku mlxtend python získány p-hodnoty založené na permutaci. Kromě toho bylo použito bootstrapping s podmíněným pokrytím80 k získání p-hodnot pro prediktivní váhy konektivity, které usnadňují interpretaci. Sestavili jsme 10000 bootstrapových vzorků (s nahrazením) o velikosti rovnající se původnímu vzorku, které se skládaly z párových údajů o mozku a výsledku. Na každý vzorek byl napasován prediktivní model s optimálními hyperparametry. Nekorigované P-hodnoty byly vypočteny pro každé vybrané spojení na základě podílu vah pod nebo nad nulou, jako např. v ref. 30. Všimněte si, že interpretace těchto p-hodnot a intervalů spolehlivosti (doplňková tabulka 4) zůstává omezená, protože je podmíněna postupem výběru příznaků.

Analýza matoucích proměnných

Pro zkoumání potenciálních matoucích proměnných byly predikované hodnoty citlivosti na bolest (nebo křížově validované predikce v případě vzorku 1) konfrontovány s průměrnou a mediánovou hodnotou FD, procentem vyčištěných objemů, systolickým a diastolickým krevním tlakem před měřením MRI i QST (protože krevní tlak byl dříve popsán81 jako související s citlivostí na mechanickou bolest), časová prodleva mezi vyšetřením MRI a QST (k ověření časové stability predikce), věk, pohlaví, BMI, počet dní od prvního dne poslední menstruace, konzumace alkoholu (jednotky/týden), úroveň vzdělání, stavová a rysová úzkost (STAI), skóre depresivních symptomů (ADS-K), vlastní citlivost na bolest (PSQ) a katastrofizace bolesti (PCS), vnímaný stres (PSQ20), kvalita spánku (PSQI) a prahy detekce nedráždivých QST (CDT, WDT a MDT, pokud jsou k dispozici). Ve studii 1 byly navíc předpovědi porovnány s hodnotami T50 a hladinami GABA a glutamátu/glutaminu v mozkových oblastech zpracovávajících bolest na základě MR spektroskopie (podrobněji viz ref. 8). Asociace byly testovány pomocí lineárních modelů založených na permutaci.

Vizualizace prediktivní sítě

Prediktivní meziregionální spojení zvýrazněná nenulovými regresními koeficienty RPN-signatury byla zobrazena jako stuhový graf pomocí balíku R circlize (obr. 3). Odpovídající individualizované masky mozkových oblastí byly transformovány zpět do standardního prostoru, aby se vytvořila mapa regionální pravděpodobnosti specifická pro danou studii (odrážející přesnost koregistrace a individuální variabilitu morfologie). Mapy pravděpodobnosti byly vynásobeny součtem odpovídajících regresních koeficientů a vytvořily mapu regionální prediktivní síly, která byla poté vizualizována pomocí FSLeyes a MRIcroGL.

(https://www.mccauslandcenter.sc.edu/mricrogl) (obr. 3). Analýza zapojení sítě v klidovém stavu ve velkém měřítku (podle definice atlasu mozku MIST71) byla provedena shrnutím a Z-transformací hodnot voxelů v sedmi oblastech zájmu. Polární graf byl vytvořen pomocí balíčku R ggplot2.

Dostupnost softwaru

Skóre RPN-signatury lze vypočítat na základě strukturálních a klidových funkčních souborů dat pomocí stejnojmenného softwarového nástroje. Softwarový nástroj RPN-signature se skládá z popsaného potrubí pro zpracování MRI a predikčního modelu založeného na funkčním konektivu. Je k dispozici jako zdrojový kód na adrese https://github.com/spisakt/RPN-signature. Jelikož se software řídí specifikací Brain Imaging Data Structure (BIDS)82 a BIDS-App, poskytuje standardní rozhraní příkazového řádku a spoléhá na technologii Docker. Obraz dockeru je uložen na serveru Docker Hub: (https://cloud.docker.com/repository/docker/tspisak/rpn-signature) a není závislý na žádném softwaru mimo obraz kontejneru. To spolu s plně transparentním vývojem založeným na kontinuální integraci a automatickém označování a verzování zvyšuje dostupnost softwaru a podporuje reprodukovatelnost výsledků signatur RPN.

Souhrn zpráv

Další informace o designu výzkumu jsou k dispozici ve zprávě Nature Research Reporting Summary, která je propojena s tímto článkem.