1.1 Možné fyziologické zdroje nukleotidů a nukleosidů
ATP a další popsané nukleotidy působí na metabotropní (P2Y) i ionotropní (P2X) receptory. Podjednotky receptorů P2X (P2X1-P2X7) tvoří ligandem řízené kationtové kanály jako homomultimery nebo heteromultimery. Podjednotky P2X3 přispívají k iontové propustnosti tím, že spojují pole jednotlivých podjednotek. P2X3R má nejnižší zaznamenanou relativní propustnost Ca2+ z celé rodiny. P2X7 je kromě kationtových kanálů spojován s obsahem velkých cytolytických pórů; ty se nacházejí v makrofázích a mozkových mikrogliích. Receptory P2Y mohou aktivovat nebo inhibovat adenylátcyklázu podle podtypu a následně typu spřaženého G proteinu. Objevuje se adenylátcykláza a zejména pro inhibici Ca2+ kanálů. P2Y receptory tvoří jako podskupina receptory spojené s G proteinem; většina se páruje s fosfolipázou C prostřednictvím G proteinu, ale dochází také k inhibici adenylátcyklázy a Ca2+ kanálů typu N a aktivaci K+ kanálů. Vyjádřené P2Y receptory se obecně farmakologicky rozlišují podle pořadí agonistů; některé preferují pyrimidin před purinem. Několik receptorů P2Y má velmi častou tkáňovou distribuci . Molekulární struktury ATP a BzATP jsou uvedeny na obrázku 1.
Obrázek 1.
Molekulární struktury ATP a BzATP .
Adeninové nukleotidy inhibují akumulaci cyklického AMP vyvolanou isoproterenolem a forskolinem v gliomových buňkách C6-2B potkana. K této inhibici dochází v přítomnosti inhibitoru fosfodiesterázy. Adeninové nukleotidy nezpůsobily účinky při měření přímé aktivity fosfodiesterázy v intaktních buňkách. Předběžné ošetření C6-2B gliomových buněk pertusovým toxinem blokovalo inhibiční účinky agonistů P2Y-purinergních receptorů. U řady analogů ATP a ADP bylo dosaženo pořadí účinnosti (2-methylthioadenosin 5′-trifosfát> nebo = 2-methylthioadenosin 5′-difosfát > adenosin 5′-O-(2-thiodifosfát) > 2-chloradenosin ADP = adenosin 5′-O-(3-thio- trifosfát) > ATP > UTP) očekávané od aktivace P2Y-purinergního receptoru; a agonisté P2X-purinergních receptorů, alfa, beta-methylenadenosin 5′-trifosfát a beta, gama-methylen-adenosin 5′-trifosfát, neměly žádný účinek. Aktivita fosfolipázy C se objevuje v reakci na aktivaci P2-purinergních receptorů v mnoha cílových tkáních, proto byly v buňkách C6-2B měřeny účinky agonistů P2Y receptorů na akumulaci inositolfosfátu. Nebyly nalezeny žádné důkazy o regulaci P2Y-purinergního receptoru zprostředkované metabolismem inositolových lipidů za podmínek, kdy aktivace muskarinového cholinergního receptoru nebo AIF4 zvýšila akumulaci inositolfosfátu. Tyto výsledky naznačují, že na buňkách potkaního gliomu C6-2B je přítomen podtyp P2-purinergního receptoru s odlišnými signálními vlastnostmi. Ačkoli tento receptor vyjadřuje obecné farmakologické vlastnosti fosfolipázou C vázaného P2Y-purinergního receptoru, může představovat jedinečný podtyp receptoru, protože inhibuje adenylylcyklázu .
Myslelo se, že puriny jsou omezeny na intracelulární kompartment, ve kterém se používají pro zpracování energie, syntézu nukleových kyselin a velké množství biochemických reakcí. Karl Lohmann izoloval ATP, který je klíčovou vnitrobuněčnou měnou energie, v roce 1929 . Adenosin a adenosintrifosfát však (i) jsou hojnými biochemickými složkami nádorového mikroprostředí, (ii) jsou silnými modulátory reakcí imunitních buněk a uvolňování cytokinů a (iii) jsou klíčovými hráči v interakci mezi hostitelem a nádorem. Oba nukleotidy navíc přímo ovlivňují růst nádorových buněk. Adenosin je silným imunosupresivem (účinný především na receptory A2A) a modulátorem buněčného růstu (účinný především na receptory A3). ATP je prozánětlivá látka (účinná na receptorech P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6 a P2Y12 a na receptorech P2X4 a P2X7), imunosupresivum (účinné na P2Y11) a stimulátor růstu (účinný na P2Y1, P2Y2 a P2X7). Tato komplexní signální síť vyvolává řadu inhibičních a stimulačních reakcí, které ovlivňují funkci imunitních buněk, růst nádorů a jejich metastatické šíření.
Purinergní receptory, zastoupené mnoha rodinami, jsou nejrozšířenějšími receptory v živých organismech, které se pravděpodobně vyskytovaly v raných fázích evoluce. Purinergní signalizace v periferním a centrálním nervovém systému je rychle se rozvíjející oblastí. Zkoumání těchto receptorů umožňuje vyvinout terapeutické strategie pro tyto poruchy s novými mechanismy účinku, včetně purinergních, patogenních stavů, včetně bolesti, traumatu, ischemie, epilepsie, migrény, psychiatrických poruch a drogové závislosti .
Bylo prokázáno, že extracelulární adenosintrifosfát (ATP) v mikromolárních/nanomolárních koncentracích vyvolává významné funkční změny v široké škále normálních a transformovaných buněčných typů. Ačkoli ATP může být specificky uvolňován z cytosolu poškozených buněk, je také balen v některých exocytotických vezikulách/granulích obsahujících konvenční neurotransmitery a hormony. Různé biologické odpovědi na ATP jsou zprostředkovány různými P2-purinergními receptory na povrchu buněk, které se aktivují po navázání ATP a dalších nukleotidů. Nedávné fyziologické, biochemické a farmakologické studie ukázaly, že existuje více typů podtypů receptorů ATP. Patří mezi ně: (1) ATP receptory vázané na G-protein, které indukují hydrolýzu inositolfosfolipidů, mobilizaci Ca2+ a aktivaci proteinkinázy C; (2) ATP receptory, které přímo aktivují neselektivní kationtové kanály v plazmatických membránách různých typů buněk a (3) ATP receptory schopné vyvolat cytotoxické nebo aktivační reakce v T-lymfocytech a jiných imunitních efektorových buňkách rychlou indukcí povrchových membránových pórů propustných pro ionty a endogenní metabolity (s molekulovou hmotností do 900 Da). Kromě těchto funkčních kritérií lze tyto výchozí podtypy ATP receptorů farmakologicky rozlišit podle charakteristické účinnosti pro různá strukturně modifikovaná analoga ATP .
Intracelulární nukleotidy hrají zásadní a všudypřítomnou roli v energetickém metabolismu, syntéze nukleových kyselin a regulaci enzymů. Je všeobecně známo, že extracelulární nukleotidy a nukleosidy provádějí důležité biologické akce v mnoha tkáních a buňkách . Metabolické senzory GLUT (usnadňují transport glukózy do buněk), SGLT (usnadňují zpětné vstřebávání glukózy do oběhu) a KATP (ATP-senzitivní draslíkové kanály) hrají důležitou roli v homeostáze a metabolismu glukózy v těle a v mnoha specifických orgánech (např, střevo, slinivka břišní, srdce, kosterní svalstvo a mozek) .
KATP vážou metabolické signály na buněčnou excitabilitu a hrají důležitou roli v mnoha tkáních, včetně regulace sekrece inzulínu, kontroly cévního tonu a ochrany neuronů a svalů před ischémií. KATP kanály jsou oktamerické komplexy sestávající ze čtyř sulfonamidových receptorů (SUR.x) a čtyř vnitřně rektifikujících draslíkových kanálů (Kir6.x). Jsou regulovány intracelulárním ATP a ADP. Zatímco ATP inhibuje aktivitu kanálů, ADP antagonizuje inhibiční účinek ATP v přítomnosti Mg2+ a stimuluje aktivitu kanálů. Tyto vlastnosti brány jsou nezbytné pro to, aby tento kanál detekoval metabolické změny v buňkách. V β buňkách pankreatu se tedy poměr / zvyšuje v reakci na zvýšení hladiny glukózy v krvi, což vede k uzavření KATP kanálu, depolarizaci membrány, aktivaci napěťově řízených Ca2+ kanálů a uvolnění inzulinu. Když je však hladina glukózy v krvi nízká, poměr / se sníží, KATP kanály se otevřou a sekrece inzulínu se sníží .
Katastrofické kanály ve slinivce břišní se aktivují následovně; v případě zvýšení hladiny glukózy v β buňkách se také zvýší intracelulární poměr ATP k ADP, což vede k uzavření KATP kanálu, depolarizaci buněk a uvolnění inzulínu .
Předpokládá se, že proud K′(K + ) citlivý na P je regulován proteiny vážícími GTP (G proteiny), ale cesty kombinující receptor, G protein a kanál nejsou identifikovány. Byla stanovena regulace tolbutamid-senzitivního K′ proudu v neonatálních potkaních komorových myocytech. Aktivované ATP-senzitivní K+ (K+ ) kanály jsou v buňkách přítomny při poklesu intracelulární hladiny ATP. Intracelulární hladiny ATP se vyskytují při snížení intracelulární hladiny ATP v buňce, intracelulárním kosterním svalu, mozku a slinivce břišní. O funkci K+ kanálů v srdečních buňkách je známo jen málo, ačkoli jejich důležitá úloha při řízení sekrece inzulínu z P-buněk slinivky břišní je dobře známa. Při farmakologické aktivaci tyto kanály výrazně zkracují trvání akčního potenciálu a bylo navrženo, že jsou zodpovědné za zkrácení akčního potenciálu u metabolicky nebezpečných ischemických svalů. Koncentrace ATP v metabolicky zablokované kastě však zůstává nad úrovní, která kanálům ve vyříznutých membránových políčkách brání. Možným vysvětlením tohoto rozporu je, že citlivost kanálů na ATP může být modulována intracelulárními mechanismy .
Kanály K+ reagující na ATP, zvané KATP kanály, poskytují spojení mezi buněčným metabolismem a elektrickou aktivitou membrán v různých tkáních. Izoformy kanálů jsou cílem pro sloučeniny, které stimulují a inhibují jejich aktivitu, což vede k hyperpolarizaci, respektive depolarizaci membrány. Příkladem pro tyto výše uvedené situace je hladká svalovina cév a stimulace uvolnění sekrece inzulínu . Bylo zjištěno, že agonisté adenosinu a otvírače ATP-senzitivního draslíkového kanálu (KATP) omezují velikost infarktu (IS) . ATP-senzitivní draslíkové (KATP) kanály jsou dobře definovány v srdci, kostře a hladkém svalstvu, buňkách slinivky břišní, hypofýze, centrálním a periferním nervovém systému jak elektrofyziologicky, tak farmakologicky. Jejich aktivita, a tedy i různé buněčné funkce jsou řízeny buněčným metabolismem. Obecně se předpokládá, že změny v ATP (způsobující uzavření kanálu) a v MgADP (aktivující kanál) mají dvojí metabolismus na aktivitu kanálu6. Je popsáno, že buněčná lokalizace dvou transkriptů mRNA, které mají vytvářet ATP-senzitivní K+ kanály v myším mozku. Existují důkazy, že kanál KATP v buňkách slinivky břišní se skládá z Kir6.2 a komplexu podjednotek SUR1. KATP kanály s podobnými vlastnostmi (typ I) byly popsány v různých neuronech, včetně těch s mozkovou kůrou, základní nigrou, kaudátem a hipokampem .
Téměř všechny nádorové buňky a všechny imunitní buňky exprimují receptory plazmatické membrány pro extracelulární nukleosidy (adenosin) a nukleotidy (ATP, ADP, UTP, UDP a cukr UDP). Nádorové mikroprostředí se vyznačuje neobvykle vysokou koncentrací ATP a adenosinu. Adenosin je důležitou determinantou imunosupresivního nádorového prostředí. Sériová hydrolýza extracelulárního ATP katalyzovaná CD39 a CD73 je hlavní cestou tvorby adenosinu v nádorovém intersticiu. Extracelulární ATP a forma adenosinu jsou odpovědí hostitele i nádoru. V závislosti na aktivovaném specifickém receptoru zprostředkovávají extracelulární puriny imunosupresi nebo imunostimulaci na straně hostitele a stimulaci růstu nebo cytotoxicitu na straně nádoru. Nejnovější vývoj v této oblasti poskytuje klíč k rozluštění tohoto složitého scénáře s využitím potenciálního přínosu terapie. Předklinické údaje naznačují, že cílení na dráhu produkující adenosin nebo adenosinergní receptory oslabuje imunosupresi a silně inhibuje růst nádoru. Na druhé straně je růst experimentálních nádorů silně inhibován cílením na receptor P2X7 ATP selektivních nádorových a imunitních buněk. Úloha extracelulárních purinů (purinergní signalizace) působí v interakci mezi hostitelem a nádorem a upozorňuje na nové možnosti léčby vyplývající z nedávných pokroků. V současné době panuje shoda, že ATP a adenin jsou hlavními složkami nádorového mikroprostředí (TME), v němž TME různými způsoby ovlivňuje růst nádoru, funkce imunitních buněk a interakci nádor-hostitel. Vzhledem k rozšířenému pozorování, že mnoho maligních nádorů nadměrně exprimuje několik podtypů P1R nebo P2R, by jednoduchý přístup vyžadoval zacílení na tyto receptory selektivními receptory, které by potlačily růst nádorových receptorů. Na stejné linii zásahu jsou nahlíženy enzymy podílející se na metabolismu extracelulárních nukleotidů a nukleosidů (CD39, CD73 a adenosin deamináza). Přestože byla prokázána účinnost několika jednoduchých preklinických modelů, je tento jednoduchý přístup zjevně velmi čistý. P1Rs, P2Rs a enzymy narušující ATP/adenosin jsou exprimovány společně s imunostimulačními a stromálními buňkami hostitele, které mají velmi důležité funkce pro tvorbu integrovaného komplexu hostitele kolem nádoru. Pečlivý výběr kandidátního purinergního receptoru v kombinaci s modulátory extracelulárních adenosinergních drah může umožnit inhibici růstu nádorových buněk a současně zvýšit protinádorovou odpověď hostitele. Tato protinádorová látka poskytne další mocnou zbraň pro kombinovanou léčbu .
Nukleotidy a jejich receptory se objevují jako potenciální aktéři v interakci hostitel-nádor, například jako nové a důležité zánětlivé a imunitní modulátory. Velké množství receptorů P2 a P1 exprimovaných nádorovými a zánětlivými buňkami, které vykazují různou afinitu k ligandu pro podtypy receptorů P2 a P1, je modulováno lokálními faktory získanými z ektonukleotidů a ADA na koncentraci nukleotidů a adenosinu. Údaje in vivo podporují důkazy in vitro, že snížení intratumorózní koncentrace adenosinu a cílení na receptor P2X7 mají silný protinádorový účinek. Zkoumání purinergní signalizace u rakoviny proto otevírá slibné perspektivy pro vývoj inovativních terapeutik .
Purinergní signalizace byla zaměřena na imunitní odpověď spojenou s nádorem; nukleotidy a nukleosidy mají silné přímé účinky na samotné nádorové buňky. Stimulace receptorů P2Y (P2Y1 a P2Y2) podporuje růst, proto je v závislosti na exprimovaných podtypech receptorů P2Y pravděpodobné, že akumulace ATP v mikroprostředí nádoru podporuje růst nádoru. Kromě receptorů P2Y hraje v růstu nádorů roli také P2X7. Dlouhodobým pozorováním je, že většina maligních nádorů nadměrně exprimuje P2X7 . Je známo, že tento receptor zprostředkovává silnou cytotoxickou odpověď . Proto se zjišťuje, proč by měl nádor nadměrně exprimovat „sebevražedný“ receptor. Cytotoxicitu však nejčastěji vyvolávají farmakologické (tj. téměř milimolární) dávky ATP. Naproti tomu aktivace P2X7 endogenně uvolněným ATP vyvolává trofický, růst podporující účinek .
Nukleotidy a nukleosidy v povrchové tekutině dýchacích cest regulují činnost mukociliární clearance (MCC), primárního přirozeného obranného mechanismu, který odstraňuje cizorodé částice a patogeny z povrchu dýchacích cest. Tyto účinky v dýchacích cestách jsou zprostředkovány především dvěma podtypy purinergních receptorů, Gq-spojeným receptorem P2Y2 vnímajícím ATP/UTP a Gs-spojeným adenosinovým receptorem A2b. Aktivace receptoru A2b vede k aktivaci kanálu Cın1 transmembránového regulátoru cystické fibrózy (CFTR) závislé na cyklickém AMP a ke stimulaci frekvence ciliárních pulzů. Agonistická aktivace receptoru P2Y2 podporuje inhibici CFTR-dependentní a CFTR-nezávislé sekrece Cl, ciliárního tepu a sekrece mucinu, jakož i absorpce Na+ .
Fenomén o procesu odhaluje účast biologické kaskády. V této souvislosti agonisté adenosinu a otvírače K+ kanálů citlivých na ATP (KATP) napodobují některé ochranné účinky procesu prekondicionování. Tyto účinky jsou navíc zvráceny antagonisty adenosinu a blokátory KATP; to naznačuje, že uvolňování adenosinu a aktivace KATP kanálů prostřednictvím adenosinových Al receptorů může představovat časný krok v ischemickém mozkovém preconditioningu .
Je známo, že aktivace adenosinového receptoru, proteinkinázy C (PKC) a ATP-senzitivního draslíkového (KATP) kanálu spouští preconditioning. Tyto údaje poskytují přímý důkaz, že spíše než adenosinový receptor je KATP kanál efektorem za PKC při iniciaci PKC zprostředkované prekondicionace. K podpoře skutečného ochranného účinku během kontinuální hypoxie je zapotřebí jak adenosinový receptor, tak KATP kanál . Posuzuje se možnost spojení biologické fáze účasti adenosinových receptorů A1 a kanálů KATP na protektivní události spojené se zkříženou tolerancí mezi epileptickou tolerancí vyvolanou KA nebo epilepsií vyvolanou KA a globální ischémií .
.