Genetické polymorfismy cytochromu P450 2D6 (CYP2D6): klinické důsledky, evoluční aspekty a funkční diverzita

Farmakogenetika zabývající se dědičnými rozdíly v cílech léčiv a dispozicí léčiv v podobě receptorů a transportérů léčiv se rychle rozvíjí.1, 2, 3, 4, 5 V současné době jsou naše znalosti nejpokročilejší, pokud jde o vliv polymorfně rozložených genů kódujících enzymy metabolizující léčiva, i když poznatky o receptorech a transportérech léčiv rychle narůstají. Největší význam na interindividuální rozdíly v odpovědi na léčiva mají v současné době rozdíly ve schopnosti metabolizovat léčiva způsobené genetickým polymorfismem nebo inhibicí či indukcí metabolismu léčiv. Kromě interakcí mezi léčivy, patofyziologických faktorů a faktorů prostředí hraje genetika enzymů metabolizujících léčiva zásadní roli pro pochopení interindividuálních rozdílů v odpovědi na léčiva a nežádoucích účinků léčiv. Největší vliv mezi enzymy metabolizujícími léčiva mají cytochromy P450, hlavní enzymy fáze I.6, 7 Mezi nimi jsou CYP2C9, CYP2C19 a CYP2D6 vysoce polymorfní a společně se podílejí na jaterním metabolismu fáze I u člověka asi 40 %. Kromě toho se na interindividuálních rozdílech v metabolismu léčiv podílejí také polymorfismy CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6 a CYP2C8. CYP2D6 je pravděpodobně nejrozsáhleji studovaným polymorfně vyjádřeným enzymem metabolizujícím léčiva u lidí; jeho polymorfismus má velký klinický význam a jako první z polymorfních P450 byl charakterizován na molekulární úrovni. V současné době bylo identifikováno více než 48 různých substrátů pro tento enzym (tabulka 1) a CYP2D6 je zodpovědný za přibližně 25 % metabolismu známých léčiv. To však může být mírně nadhodnocené, protože v minulosti se cíleně hledala léčiva, která jsou metabolizována tímto enzymem, vzhledem k jeho polymorfní expresi. V tomto přehledu jsou popsány současné znalosti a důsledky molekulární genetiky CYP2D6 a také poznatky o vlivu na léčbu léky.

Všeobecná charakteristika CYP2D6

CYP2D6 je polypeptid o 497 aminokyselinách. Tento enzym tvoří pouze malé procento všech jaterních P450, ale jeho úloha v metabolismu léčiv je rozsáhle vyšší než jeho relativní obsah (viz Zanger a kol.8). Různé modely enzymu založené na trojrozměrné struktuře cytochromu P450 BM-3 nebo CYP2C5 a výsledky místně cílené mutageneze se od sebe značně liší. Navzdory úspěchu dobře difraktujících krystalů savčích CYP2B4, CYP2C5, CYP2C9 a CYP3A4 se zatím nikomu nepodařilo získat dobré krystaly CYP2D6. Předpokládá se, že takové krystaly jsou nezbytné k získání předlohy pro modely s dostatečným rozlišením a přesností, aby bylo možné například předpovídat léčiva, která budou substráty pro tento enzym. Takový model by měl vážný význam pro farmaceutický průmysl, protože pro úspěšný přípravek na trhu je stěžejní navrhovat léky tak, aby se vyhnuly sloučeninám, které jsou vysoce afinitními substráty pro CYP2D6.

Substráty CYP2D6 jsou lipofilní báze s protonovatelným atomem dusíku. Hydroxylační reakce probíhá ve vzdálenosti 5 nebo 7 Å od atomu dusíku. Experimenty s místně řízenou mutagenezí naznačují, že Asp301 je záporně nabitá aminokyselina odpovědná za vazbu na dusík substrátu8. Kromě toho se zdá, že se na vazbě substrátu podílejí také Ser304, Thr309 a Val3709 , ačkoli k potvrzení je zapotřebí dalších modelů.

CYP2D6 má velmi vysokou afinitu k alkaloidům (viz tabulka 1).10 Exprese enzymu není na rozdíl od jiných jaterních cytochromů P450 metabolizujících xenobiotika regulována žádným známým prostředím a není indukovatelná známými hormony. Vzhledem k tomu, že nebyl popsán žádný fenotyp u osob, které nemají CYP2D6 nebo mají až 13 aktivních kopií genu, lze usuzovat, že enzym nemá žádnou významnou endogenní funkci. Byla navržena role pro metabolismus některých neurotransmiterů. Nedávno byly skutečně předloženy důkazy o tom, že CYP2D6 je specifickou O-demetylázou 5-methoxyindolethylaminu11 , a také bylo prokázáno, že substrátem je 5-methoxytryptamin12 . Kromě těchto substrátů je pravděpodobné, že enzym má významnou úlohu pro metabolismus složek potravy, zejména alkaloidů (viz níže).

Působení CYP2D6 na substráty s potenciální aktivitou v mozku by znamenalo funkční fenotyp u subjektů, tj. špatných metabolizátorů (PM), kterým enzym chybí. Dvě studie totiž naznačily významný vztah mezi chováním pomocí psychologických testů a přítomností CYP2D6.13, 14 Vyvstává otázka, zda je taková aktivita nezbytná. Zajímavé je, že Pai et al.15 nedávno poskytli důkaz, že běžná varianta pseudogenu CYP2D7P může být v lidském mozku exprimována v aktivní formě, čímž vzniká funkční enzymový produkt, který je aktivní například při metabolismu kodeinu. Zda se jedná o produkt se skutečným funkčním významem, je třeba ještě objasnit, i když nález jako takový je zajímavý.

Polymorfismus CYP2D6-historické aspekty

Polymorfismus CYP2D6 byl nezávisle na sobě objeven ve třech různých laboratořích. Laboratoř Folkeho Sjöqvista ukázala, že metabolismus nortriptylinu a desimipraminu, u nichž se později ukázalo, že jsou substráty CYP2D6, vykazuje obrovské interindividuální rozdíly v plazmatických hladinách při stejném dávkování a byly identifikovány dva fenotypy.16 Následné studie Sjöqvistovy skupiny s použitím dvojčat ukázaly, že rozdíl je genetické povahy. Bob Smith a jeho spolupracovníci v Londýně studovali metabolismus dvou antihypertenziv bethanidinu a debrisochinu, které se používaly při hypertenzi. Když Bob Smith v květnu 1975 užil 40 mg debrisochinu, začal mít závratě, omdlel a trpěl těžkou hypotenzí. Následná studie s 10 mg debrisochinu u 94 subjektů identifikovala tyto dva fenotypy.17 Michel Eichelbaum v Bonnu studoval antiarytmické účinky sparteinu a dva subjekty si stěžovaly na nepříjemné vedlejší účinky, jako je rozmazané vidění, diploida, závratě a bolesti hlavy. Analýza plazmatických hladin ukázala, že měli 4-5krát vyšší hladiny než ostatní, a tyto dva fenotypy byly publikovány v letech 1978 a 1979.18, 19

Genetický základ polymorfismu debrisochinu byl objasněn o 10-15 let později. Ve společné studii laboratoří Urse Meyerse a Franka Gonzaleze byly polyklonální krysí protilátky CYP2D vyvinuté v Basileji použity jako nástroje ke klonování lidské cDNA CYP2D6 z knihovny cDNA lidských jater λgt 11 a exprimovaná cDNA měla očekávanou bufuralolhydroxylázovou aktivitu.20 Pomocí RFLP mohla Meyersova laboratoř potvrdit změněné RFLP vzorce v PM pro debrisochin21 , zatímco úplná identifikace alel CYP2D6*3 a CYP2D6*4 byla publikována v roce 1990.22

Na konci 80. let jsme v plodné spolupráci s Leifem Bertilssonem a Folkem Sjöqvistem identifikovali vzor RFLP u Číňanů aktivních v metabolismu CYP2D6, který svědčí pro PM u Kavkazanů23 , a později jsme charakterizovali nejčastější částečně defektní alelu CYP2D6 u Orientálců, CYP2D6*10.24 Jako francouzská skupina jsme oponovali naší identifikaci velikosti čínských fragmentů XbaI a znovu jsme prověřili několik různých vzorků DNA pomocí XbaI RFLP s použitím nižší hustoty agarózového gelu a našli jsme některé vzorky, o nichž jsme se domnívali, že mají neštěpenou DNA (další podrobnosti viz Ingelman-Sundberg25). Zkoumání jejich původu však ukázalo, že pocházejí od jedinců s velmi rychlým metabolismem debrisochinu, a byly identifikovány subjekty s až 12 kopiemi genu CYP2D6 navíc. Ukázalo se, že se jedná o první popis stabilně amplifikovaného aktivního genu u lidí26 a byl definován termín ultrarapidní metabolizátoři (UM).27 Následné zkoumání frekvencí v různých populacích odhalilo 30 % u Etiopanů,28 10 % u Španělů a 10 % populace v Itálii a Turecku, zatímco v severní Evropě jsou UM vzácní (1-2 %) a v Asii se v podstatě nevyskytují (odkazy viz6). U Etiopanů jsme nenašli žádného jedince homozygotního pro defektní geny CYP2D6, ale alely obsahující 2, 3, 4 i 5 kopií genu CYP2D6.28 Podobná situace byla pozorována také u Saúdských Arabů.29 Vyhodnocení počtu jedinců nesoucích duplikace genů CYP2D6 v západní Evropě ukazuje, že 5,5 % Evropanů nese více než dvě aktivní kopie genů CYP2D6 a jsou UM (tabulka 2).

Genetický polymorfismus CYP2D6

Gen CYP2D6 je lokalizován na chromozomu 22q13.1. Na tomto chromozomu je také lokalizován gen CYP2D6. Lokus obsahuje dva sousední pseudogeny, CYP2D7 a CYP2D8.30 Evoluce lidského lokusu CYP2D zahrnovala eliminaci tří genů a inaktivaci dvou (CYP2D7P a CYP2D8P) a částečnou inaktivaci jednoho (CYP2D6). V současné době je známo více než 46 různých hlavních polymorfních alel CYP2D6. Přítomnost velmi podobných blízko umístěných pseudogenů nesoucích škodlivé mutace vedla například prostřednictvím nerovnoměrných křížových reakcí ke vzniku mnoha variantních alel CYP2D6, které nejčastěji kódují defektní genové produkty. Aktivita“ lokusu CYP2D je ve srovnání například s lokusem CYP2C vysoká, a proto se v relativně krátké době vytvořilo mnoho variantních alel. Nejčastější variantní alely rozšířené v různých etnických skupinách jsou uvedeny v tabulce 3 a všechny variantní alely jsou prezentovány na domovské stránce výboru pro nomenklaturu lidských alel CYP (http://www.imm.ki.se/cypalleles/cyp2d6.htm). Variantní alely CYP2D6 lze rozdělit do kategorií, které způsobují zrušenou, sníženou, normální, zvýšenou nebo kvalitativně změněnou kataxlytickou aktivitu. Mezi nejdůležitější variantní patří CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*17 a CYP2D6*41.

Nejčastější alelou u Asiatů (frekvence alel >50 %), a tedy pravděpodobně nejčastější alelou CYP2D6 na světě, je CYP2D6*10.24 Enzym CYP2D6.10 má škodlivou mutaci P34S, která ruší důležitou sekvenci PPGP nezbytnou pro skládání P450, a je proto velmi nestabilní,24 ale má také sníženou afinitu k substrátům.31 Mezi černochy je CYP2D6*17 poprvé popsaná v roce 199632 hlavní variantou alely CYP2D6. Kóduje kromě dvou missense mutací pozorovaných u CYP2D6*2 také T107I, která zřejmě vytváří změněnou strukturu aktivního místa. To vytváří změněnou substrátovou specifitu33 , která je patrná in vitro33 , ale také při fenotypizaci osob s genotypem CYP2D6*17 in vivo34, 35 Obecně je aktivita enzymu CYP2D6.17 nižší než u enzymu divokého typu.

CYP2D6*41 je varianta CYP2D6*2 mající -1584 C místo G. Je méně exprimovaná než odpovídající alela CYP2D6*2 (viz Zanger et al.36). Je pravděpodobné, že -1584G>C je ve vazebné nerovnováze s jiným SNP, který způsobuje nedostatečný sestřih mRNA, i když to musí být výslovně prokázáno. Účinek CYP2D6*41 in vivo je však poměrně výrazný a subjekty homozygotní pro tuto alelu se fenotypově podobají jedincům intermediárního fenotypu (IM) s jednou deficientní alelou CYP2D6.36

Evoluce lokusů CYP2D

Mezi hlodavci a lidmi je drastický rozdíl v počtu aktivních genů CYP2D. Zatímco myš má devět různých aktivních genů Cyp2d,37 člověk nese pouze jeden, který skutečně chybí u 7 % kavkazské populace (obrázek 1). Je známo, že enzym CYP2D6 má velmi vysokou afinitu k rostlinným toxinům, jako jsou alkaloidy10. Lze předpokládat, že u myší zůstaly geny aktivní kvůli potřebě detoxikačního potenciálu stravy, zatímco omezenější potrava přijímaná lidmi v minulosti, včetně intelektuální schopnosti předávat informace o vhodné stravě mezi generacemi, vedla ke ztrátě selekčního tlaku, který by udržoval geny aktivní.

Gen CYP2D6 není indukovatelný v běžném slova smyslu prostřednictvím zvýšené exprese genového produktu. U drozofily dochází k selektivnímu výběru kmenů žijících např. v oblasti kaktusu Senita vylučujícího toxické isochinolinové alkaloidy a v této oblasti přežívá pouze Drosophila mettleri, ale žádný kmen Drosophila melanogaster, protože jejich schopnost indukovat CYP6 a CYP28.38 Zajímavý genetický výběr probíhá také u drozofily odolné vůči insekticidům. Od roku 1930 do roku 1960 se rychle vyvíjely skvrny odolné vůči insekticidům. Zajímavé je, že molekulárně genetickým základem se zdá být selekce na vložení transpozomu (harmonického elementu) do 5´-regulační oblasti genu Cyp6b, který způsobuje 40- až 100násobně vyšší expresi genového produktu.39 Dalším mechanismem získávání rezistence k insekticidům u drozofily je příklad selekce na tři klíčové mutace v CYP6A2, tedy R335S, L336V a V476L, které činí enzym aktivním vůči metabolismu DDT.40 Ilustrace tří různých mechanismů adaptivní reakce vůči substrátovému stresu je uvedena na obrázku 2.

Podobně jsme navrhli, že k takové selekci došlo u alel nesoucích více aktivních genů CYP2D6 v severovýchodní Africe. Základem této selekce by byla schopnost enzymu CYP2D6 detoxikovat alkaloidy, čímž by se zvýšila dostupnost potenciální potravy mezi nositeli více kopií genu CYP2D6. To by bylo velmi výhodné pro přežití v obdobích hladovění, kdy pouze část populace v této oblasti dosáhne dospělosti. Zkoumání rychlosti metabolismu debrisochinu u Etiopanů žijících v Etiopii ve srovnání s Etiopany žijícími ve Švédsku ukázalo, že rodilí Etiopané stejného genotypu mají pomalejší metabolismus ve srovnání s Etiopany ve Švédsku, zatímco v rychlosti katalytických reakcí závislých na CYP2C19 měřených s S-mefenytoinem nebyly zjištěny žádné významné rozdíly.41 To lze interpretovat tak, že složky etiopské potravy, pravděpodobně alkaloidy, inhibují aktivitu CYP2D6 a že tyto složky by skutečně mohly být spouštěčem genetické selekce. Domníváme se, že etiopská populace se zhruba před 10 000-20 000 lety rozšířila do té míry, že potrava vykazovala důležité omezení. Během období hladovění došlo k selekčnímu tlaku upřednostňujícímu přežití jedinců schopných ve větší míře detoxikovat rostlinné toxiny, čímž se zvýšil počet rostlin schopných poskytovat užitečnou potravu (obr. 3). Tím došlo k rozšíření subpopulací nesoucích více aktivních kopií genu CYP2D6 a také bez neaktivních genů CYP2D6. Vzhledem k tomu, že zdaleka nejčastějšími variantami duplikovaného a multiduplikovaného genu CYP2D6 jsou CYP2D6*2 a CYP2D6*41, přičemž obě vytvářejí dvě aminokyselinové záměny oproti CYP2D6*1, lze spekulovat, že substrátová specifita této formy enzymu je výhodná pro metabolismus některých rostlinných produktů. Následná migrace osob ze severovýchodní Afriky do oblasti Středomoří vedla k vysoké frekvenci UM v jižní Evropě (viz tabulka 2).

.