Potenciální využití indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC) v personalizovaných aplikacích regenerativní medicíny může být rozšířeno pomocí transgeniky, včetně exprese konstitutivních buněčných značek, reportérů diferenciace nebo modulátorů fenotypů onemocnění. Existuje tedy precedens pro reprodukovatelnou expresi transgenů mezi subklony iPSC s izogenním nebo různorodým genetickým pozadím. Při použití virových nebo transpozonových vektorů je obtížné kontrolovat místa integrace transgenů a počty jejich kopií a je téměř nemožné je reprodukovat u více buněčných linií. Navíc náhodně integrované transgeny často podléhají pleiotropním účinkům polohy v důsledku epigenetických změn, které jsou vlastní diferenciaci, což zpochybňuje aplikace v iPSC. Abychom tento problém vyřešili, přizpůsobili jsme populární nukleázové technologie TALEN a CRISPR/Cas9, abychom zavedli transgeny do předem definovaných lokusů a překonali náhodné poziční efekty. AAVS1 je příkladný lokus v rámci genu PPP1R12C, který umožňuje robustní expresi transgenů řízených promotorem CAG. Cílení genu řídí počet kopií transgenu tak, že expresní vzorce reportérů jsou reprodukovatelné a škálovatelné ∼2násobně. Kromě toho je exprese genu zachována během dlouhodobé kultivace lidských iPSC a diferenciace in vitro v mnoha liniích. Zde uvádíme náš protokol cílení AAVS1 s použitím standardizovaných dárcovských vektorů a konstrukčních metod a rovněž uvádíme praktické úvahy o kultivaci iPSC, výběru léčiv a genotypizaci.
.