Interakce 4-1BB/4-1BBL podporuje obezitou indukovaný tukový zánět tím, že spouští obousměrnou zánětlivou signalizaci v adipocytech/makrofázích

Abstract

Obezitou indukovaný tukový zánět je charakterizován náborem makrofágů do tukové tkáně a uvolňováním zánětlivých cytokinů. Kostimulační receptor 4-1BB moduluje zánětlivé procesy prostřednictvím interakce se svým ligandem 4-1BBL na povrchu imunitních buněk. V této studii jsme zkoumali, zda se interakce 4-1BB/4-1BBL mezi adipocyty a makrofágy podílí na obezitou vyvolaném tukovém zánětu. Zjistili jsme, že 4-1BB je exprimován na adipocytech a je regulován faktory souvisejícími s obezitou, které také zvyšují expresi 4-1BBL na makrofázích. Agonisté 4-1BB a/nebo 4-1BBL aktivovali zánětlivé signální molekuly (MAPK/IκBα a MAPK/Akt) v adipocytech a makrofázích a zvýšili uvolňování zánětlivých cytokinů (MCP-1, TNF-α a IL-6). Přerušení interakce 4-1BB/4-1BBL navíc snížilo uvolňování zánětlivých cytokinů z kontaktních kokulovaných adipocytů/makrofágů. Tato zjištění naznačují, že obousměrná signalizace zprostředkovaná 4-1BB/4-1BBL v adipocytech/makrofázích podporuje tukový zánět. 4-1BB a 4-1BBL mohou být užitečnými cíli pro ochranu před obezitou vyvolaným tukovým zánětem.

1. Úvod

Zánět vyvolaný obezitou je považován za potenciální příčinu metabolických poruch, jako je inzulinová rezistence, diabetes 2. typu a kardiovaskulární onemocnění . Tuková tkáň se aktivně podílí na zánětu vyvolaném obezitou prostřednictvím náboru makrofágů a T-buněk a uvolňováním zánětlivých cytokinů (monocytární chemotaktický protein-1, MCP-1; tumor nekrotizující faktor alfa, TNF-α; interleukin-6, IL-6), které modulují diferenciaci adipocytů, metabolismus a lokální/systémové zánětlivé reakce, což způsobuje nežádoucí metabolickou nerovnováhu . Je zajímavé, že nedávné studie ukázaly, že přímá kontaktní kokultura adipocytů a makrofágů vede k výrazně zvýšenému uvolňování zánětlivých cytokinů , což naznačuje, že interakce mezi povrchovými molekulami těchto buněk je důležitá pro podporu jejich zánětlivých reakcí.

4-1BB (známý také jako CD137 a TNFRSF9) je klasickým příkladem kostimulační molekuly a dobře známým zánětlivým receptorem, který je exprimován aktivovanými T buňkami v místech zánětu . Stimulace 4-1BB na T buňkách vede k expanzi buněk, produkci cytokinů a rozvoji cytolytických efektorových funkcí . Ligand 4-1BB (4-1BBL, známý také jako CD137L a TNFSF9) je vysoce exprimován většinou imunitních a mnoha neimunitních buněk a může přijímat a vysílat zpětné signály do buněk, jako jsou makrofágy . Hromadící se důkazy ukazují, že obousměrné interakce 4-1BB/4-1BBL na buněčném povrchu imunitních buněk jsou rozhodující pro zahájení a modulaci různých zánětlivých reakcí (např. revmatoidní artritida, autoimunitní myokarditida a hematologické malignity) . K interakcím zprostředkovaným 4-1BB/4-1BBL navíc dochází také mezi imunitními a neimunitními buňkami, což opět ovlivňuje zánětlivé reakce. Například interakce mezi 4-1BB a 4-1BBL na endoteliálních buňkách a makrofázích se podílí na cévním zánětu a interakce mezi těmito dvěma molekulami na epiteliálních buňkách a buňkách přirozených zabíječů se podílí na poškození ledvin ischémií a reperfuzí . Již dříve jsme ukázali, že exprese 4-1BB a 4-1BBL je zvýšená v tukové tkáni, která je zanícená v důsledku obezity, a že ablace 4-1BB snižuje tukový zánět . Proto jsme předpokládali, že interakce mezi 4-1BB a 4-1BBL na tukových buňkách a imunitních buňkách, jako jsou makrofágy, hraje roli v tukovém zánětu při obezitě.

V této studii jsme poprvé ukázali, že 4-1BB je exprimován na adipocytech a je regulován faktory souvisejícími s obezitou, a prokázali jsme, že obousměrná signalizace zprostředkovaná 4-1BB/4-1BBL v adipocytech/makrofázích hraje klíčovou roli v iniciaci a podpoře obezitou indukované tukové zánětlivé kaskády.

2. Materiál a metody

2.1. Zánětlivá kaskáda v adipocytech

2. Zánětlivá kaskáda v adipocytech

2. Materiál a metody

2.2. Zánětlivá kaskáda v adipocytech Zvířata

Myši C57BL/6 (samci, stáří 8 týdnů) (Orient Ltd., Busan, Korea) byly po dobu 9 týdnů krmeny dietou s vysokým obsahem tuku (HFD, 60 % kalorií z tuku (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA); obézní myši) nebo dietou s nízkým obsahem tuku (LFD; 10 % kalorií z tuku (Research Diets); neobézní myši). Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny etickou komisí pro zvířata na univerzitě v Ulsanu a odpovídaly směrnicím Národního institutu zdraví (National Institutes of Health).

2.2. Pokusy na zvířatech. Protilátky

Nahým myším byl podán pristan a intraperitoneálně injikován subklonovaný hybridom produkující agonistickou monoklonální protilátku (Ab) proti 4-1BB (3E1) k vyvolání tvorby ascitu . Monoklonální Ab byla přečištěna z tekutiny ascitu pomocí afinitní kolonové chromatografie s proteinem G-Sepharose (Sigma-Aldrich). Rekombinantní 4-1BB Fc (r4-1BB Fc) byl zakoupen od společnosti Adipogen (Soul, Korea). Antagonistická monoklonální Ab proti 4-1BBL (TKS-1) byla zakoupena od společnosti e-Bioscience (San Diego, CA, USA). Krysí imunoglobulin G (Rat IgG) a lidský IgG1 byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) a použity jako kontrola.

2.3. Imunoglobulin G (Rat IgG) byl zakoupen od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) a použit jako kontrola. Buněčné kultury a ošetření

Buněčná linie myších makrofágů Raw264.7 byla získána z Korean Cell Line Bank (KCLB40071, Soul, Korea). Tato buněčná linie byla udržována v RPMI1640 (Gibco BRL, NY, USA) obsahující 10 % (obj.) FBS (fetální bovinní sérum) (Gibco BRL, NY, USA) a inkubována při 37 °C ve zvlhčeném prostředí s 5 % CO2. Preadipocyty 3T3-L1 byly udržovány v DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) s vysokým obsahem glukózy (Gibco BRL, NY, USA) obsahujícím 10 % FBS. Konfluentní preadipocyty 3T3-L1 (den 0) byly inkubovány v DMEM obsahujícím 10 μg/ml inzulinu (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (dexamethason, Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (3-isobutyl-1-methyl-xantin, Sigma-Aldrich) a 10 % FBS po dobu 2 dnů. Krátce, buňky 3T3-L1 byly diferencovány na zralé adipocyty inkubací v DMEM s 10 % FBS a 5 μg/ml inzulínu po dobu 2 dnů. Zralé adipocyty byly udržovány v tomto médiu a kultivační médium bylo každé dva dny nahrazeno čerstvým. Volná mastná kyselina (FFA, směs kyseliny palmitové, Sigma-Aldrich) byla před použitím rozpuštěna v ethanolu obsahujícím hovězí sérový albumin (BSA, 25 μM) a konjugována s BSA v molárním poměru 10 : 1. V případě, že se jedná o volnou mastnou kyselinu, byla použita směs kyseliny palmitové. Adipocyty 3T3-L1 (3 × 105 buněk/jamku) nebo makrofágy Raw264.7 (3 × 105 buněk/jamku) ve 24jamkových destičkách byly ošetřeny faktory souvisejícími s obezitou (kyselina palmitová : pal, lipopolysacharid : LPS) po dobu 24 h, resp. 4 h. V případě obezity byla použita směs BSA. Pro stimulaci 4-1BB na adipocytech byly 3T3-L1 adipocyty na 24jamkových destičkách inkubovány s agonistickou 4-1BB Ab (3E1, 1 μg/ml) nebo krysím IgG po dobu 48 h v médiu bez séra. Pro imobilizaci r4-1BB Fc nebo lidského IgG1 na kultivačních destičkách byly r4-1BB Fc nebo lidský IgG1 inkubovány na 24jamkových destičkách při 37 °C po dobu 1 h v CO2 inkubátoru a jamky byly vypláchnuty fosfátovým pufrem (PBS). Destičky byly poté inkubovány s RPMI (10 % FBS) při 37 °C po dobu 1 h v inkubátoru s CO2 a jamky byly vypláchnuty PBS. Surové264.7 makrofágy byly inkubovány v počtu 5 × 105 buněk/jamku ve 24jamkových destičkách s plochým dnem, které byly předem potaženy 100 ng/ml r4-1BB Fc nebo lidského IgG1 po dobu 24 h.

2.4. Makrofágy byly inkubovány ve 24jamkových destičkách s plochým dnem. Izolace stromálních cévních buněk z tukové tkáně

Pro izolaci stromální cévní frakce (SVF) z tukové tkáně byly epididymiální tukové polštářky myší C57BL/6 (samci, stáří 8 týdnů) rozemlety a tráveny 30 minut při 37 °C kolagenázou typu 2 (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) v DMEM (pH 7,4). Vzniklé suspenze byly centrifugovány při 500 g po dobu 5 minut. Pelety byly resuspendovány v lyzačním pufru pro erytrocyty a suspenze byly inkubovány při pokojové teplotě po dobu 3 minut a poté centrifugovány při 500 g po dobu 5 minut. Po promytí v DMEM byly suspenze propasírovány přes sterilní 100 μm nylonové síťky (SPL Lifescience, Pocheon, Korea). Přefiltrované buňky byly přeneseny do misek o velikosti 100 mm2 obsahujících DMEM doplněný 10 % FBS a 0,4 % Fungizonu a udržovány v inkubátoru při 37 °C a 5 % CO2. Buňky se nechaly přilnout a plovoucí buňky se odstranily odsátím a kultivační médium se doplňovalo každý den. Po dvou dnech byly buňky SVF odebrány. Buňky SVF byly rozmístěny v počtu 5 × 105 buněk na jamku ve 24jamkových destičkách. Konfluentní preadipocyty odvozené z SVF byly diferencovány na adipocyty působením DMEM obsahujícího 10 μg/ml inzulínu (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (Sigma-Aldrich) a 10 % FBS po dobu 2 dnů. Zralé adipocyty byly udržovány v kultivačním médiu, které bylo každé 2 dny nahrazeno čerstvým médiem. Pro zjištění exprese 4-1BB a 4-1BBL na adipocytech odvozených z SVF vystavených obezitogenním faktorům byly tyto buňky inkubovány s kyselinou palmitovou 250 μM, LPS 100 ng/ml po dobu 24 h.

2.5. Izolace peritoneálních makrofágů

Myši C57BL/6 (samci, stáří 8 týdnů) byly 4 dny před usmrcením intraperitoneálně injikovány 3 ml 3% thioglykolátového bujónu (Difco, Detroit, MI, USA). Peritoneální makrofágy byly odebrány centrifugací v médiu MEM (Minimum Essential Medium, Gibco) a získaný pelet byl promyt a resuspendován v kultivačním médiu MEM s 10 % FBS. Peritoneální makrofágy byly purifikovány adherencí na destičky tkáňových kultur po dobu 2 hodin . Pro zjištění exprese 4-1BB a 4-1BBL na peritoneálních makrofázích vystavených obezitogenním faktorům byly tyto buňky inkubovány s kyselinou palmitovou 250 μM, LPS 100 ng/ml po dobu 4 h.

2.6 . Kokultivace adipocytů a makrofágů

Adipocyty 3T3-L1 byly kultivovány a diferencovány po dobu 6 dnů. Kokultivace adipocytů a makrofágů byla prováděna dvěma metodami: přímou kontaktní kokulturou a transwellovou kokulturou. V systému přímého kontaktu byly makrofágy Raw264.7 (3 × 105 buněk: 50 % makrofágů, 3 × 104 buněk: 10 % makrofágů) nebo peritoneální makrofágy (3 × 105 buněk) umístěny do 24jamkových destiček obsahujících adipocyty 3T3-L1 (3 × 105 buněk). Buňky byly kultivovány 24 h ve vzájemném kontaktu a poté sklizeny. Jako kontrola byly adipocyty a makrofágy kultivovány také odděleně, přičemž počet buněk v jamce byl stejný jako v kontaktním systému a po sklizni byly smíchány. V systému trans-well byly buňky kokultivovány pomocí trans-well vložek s 0,4 μm porézní membránou (Corning, NY, USA), aby se oddělily adipocyty (3 × 105 buněk, spodní jamka) od makrofágů (3 × 105 buněk, horní jamka). Po inkubaci po dobu 4 h, 8 h a 12 h byly odebrány supernatanty.

2.7. Měření hladin cytokinů

Hladiny cytokinů v kultivačních supernatantech byly měřeny pomocí enzymatické imunosorbční analýzy (ELISA). Testy byly provedeny pomocí soupravy OptEIA pro myší TNFα, soupravy pro myší MCP-1 (BD Bioscience Pharmingen, CA, USA) a soupravy pro myší IL-6 a adiponektin (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) a soupravy pro IL-10 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Hodnoty hladin cytokinů byly odvozeny ze standardních křivek pomocí programu SOFTmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

2,8. Kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR)

Celková RNA extrahovaná z kultivovaných buněk byla reverzně přepsána pro vytvoření cDNA pomocí M-MLV reverzní transkriptázy (Promega, Madison, WI, USA). Amplifikace cDNA metodou PCR v reálném čase byla provedena ve dvou opakováních pomocí soupravy SYBR premix Ex Taq (TaKaRa Bio Inc., Foster, CA, USA) za použití termálního cykléru Dice (TaKaRa Bio Inc., Japonsko). Všechny reakce byly provedeny stejným postupem: počáteční denaturace při 95 °C po dobu 10 s, následovaná 45 cykly při 95 °C po dobu 5 s a 60 °C po dobu 30 s. Všechny hodnoty pro zájmové geny byly normalizovány na hodnoty pro housekeeping geny (36B4 pro adipocyty; β-aktin pro makrofágy a kokultury). Použité sekvence myších primerů jsou uvedeny v tabulce 1.

Data byla analyzována pomocí softwaru Thermal Cycler Dice Real Time System (Takara Bio, Inc.). Relativní standardní křivky byly vytvořeny vynesením prahových hodnot cyklu (Ct). Na základě hodnot Ct získaných z každého vzorku bylo pomocí standardních křivek vypočteno relativní množství cílových genů pomocí softwaru Takara Thermal Cycler Dice Real Time System

2.9. Separace adipocytů a makrofágů

Kultivované adipocyty 3T3-L1 a makrofágy Raw264.7 ve stejném počtu (jak bylo popsáno dříve) byly separovány podle protokolu výrobce pomocí systému CD11b MicroBeads (MACS; Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, USA). Stručně řečeno, kokulované buňky byly shromážděny, dvakrát promyty pufrem (PBS doplněný 2 mM EDTA a 0,5 % hovězího sérového albuminu-BSA) a inkubovány s mikročásticemi CD11b po dobu 15 minut při 4 °C. Promyté a resuspendované buňky byly naneseny na kolonu MACS, která zachytila CD11b+ buňky a umožnila průchod negativním buňkám (adipocytům). Kolona byla poté vyjmuta ze separátoru a umístěna na vhodnou sběrnou zkumavku. Na kolonu bylo pipetováno příslušné množství pufru, aby se pozitivní buňky (makrofágy) vyplavily pomocí pístu dodaného s kolonou. Tato metoda vedla k získání 90-95 % čistých CD11b+ buněk, jak bylo vyhodnoceno průtokovou cytometrií.

2.10. Analýza průtokovou cytometrií (FACS)

3T3-L1 adipocyty a Raw264.7 makrofágy ošetřené faktory souvisejícími s obezitou (jak bylo popsáno dříve) byly jemně trypsinizovány, dvakrát promyty v PBS a inkubovány s protilátkami blokujícími Fcγ receptor (24G2) po dobu 10 minut na ledu, poté obarveny fykoerytrinem (PE) konjugovaným s anti-4-1BB (eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-4-1BBL (eBioscience) nebo anti-Rat (eBioscience), Golden Syrian Hamster IgG (eBioscience) a anti-CD11b (eBioscience) jako kontrola k definování brány pro adipocyty/makrofágy. Buňky byly poté promyty pufrem FACS a analyzovány na přístroji FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) se softwarem CellQuest (BD Biosciences). Čísla v grafech udávají procenta pozitivních buněk.

2.11. Analýza Western Blot

3T3-L1 adipocyty byly rozmístěny v počtu 1 × 106 buněk/jamku v 6jamkových destičkách a inkubovány s 3E1 (1 μg/ml) nebo krysím IgG po dobu 3 h. Raw264.7 makrofágy byly rozmístěny v počtu 1 × 106 buněk/jamku v 6jamkových destičkách potažených r4-1BB Fc nebo lidským IgG po dobu 1 hodiny. Adipocyty ošetřené 3E1 a makrofágy ošetřené r4-1BB Fc byly opláchnuty PBS, resuspendovány seškrábnutím v lyzačním pufru (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM MgCl2, 0,5% deoxycholát, 1% IGEPAL a koktejl inhibitorů proteáz) a odstředěny při 3000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Vzorky obsahující 10-30 μg celkového proteinu byly podrobeny western blot analýze s použitím polyklonálních protilátek proti fosforylované IKK (I kappa B kináza alfa/beta; p-IKK α/β, Ser180/Ser181), celkové IKKβ, p-p38 MAPK (mitogenem aktivovaná proteinkináza), p-JNK (c-Jun amino-terminální kináza), celkové JNK, p-Akt (proteinkináza B; Ser473), celkový Akt (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) a IκBα (inhibitor jaderného faktoru-κB alfa; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) a β-aktin (Sigma).

2.12. Statistická analýza

Výsledky jsou prezentovány jako průměry ± SEM tří nezávislých měření provedených ve dvou opakováních. Statistická srovnání byla provedena pomocí Studentova -testu nebo ANOVA s Duncanovým testem vícenásobného rozsahu. Rozdíly byly považovány za významné při hodnotě .

3. Výsledky

3.1. Exprese 4-1BB a 4-1BBL v adipocytech/makrofázích a tukové tkáni

Nejprve jsme měřili expresi 4-1BB během adipogeneze na úrovni mRNA pomocí qRT-PCR. Zjistili jsme, že hladiny transkriptů 4-1BB byly po diferenciaci vyšší v adipocytech odvozených od SVF (obr. 1(a)). Důležité je, že látky související s obezitou, jako je kyselina palmitová a LPS, významně zvyšovaly hladiny transkriptů 4-1BB v adipocytech odvozených z SVF a transkriptů 4-1BBL v peritoneálních makrofázích (obr. 1(b)). Zvýšená regulace transkriptů se potvrdila i v adipocytech 3T3-L1 a/nebo makrofázích Raw264.7 (obr. 1(c)). Analýza FACS také ukázala, že protein 4-1BB na adipocytech 3T3-L1 a protein 4-1BBL na makrofázích Raw264.7 (obr. 1(d)) jsou těmito faktory spojenými s obezitou zvýšeny. Kromě toho se transkripty 4-1BB a 4-1BBL zvýšily v kokulturních adipocytech/makrofázích (obr. 1(e)) a také v epididymální tukové tkáni obézních myší krmených HFD (obr. 1(f)). Uvolňování zánětlivých cytokinů a aktivace zánětlivých signálních molekul stimulací 4-1BB a 4-1BBL v adipocytech, respektive makrofázích

Pro zjištění, zda 4-1BB na adipocytech nebo 4-1BBL na makrofázích poskytují zánětlivý signál, jsme každý typ buněk ošetřili agonisty, kteří tyto molekuly specificky stimulují; 3T3-L1 adipocyty byly ošetřeny agonistickou protilátkou 4-1BB (3E1) po dobu 48 h a Raw264.7 makrofágy s r4-1BB-Fc po dobu 24 h a poté jsme měřili hladiny zánětlivých cytokinů v příslušných buňkách. Jak stimulace 4-1BB adipocytů, tak stimulace 4-1BBL makrofágů výrazně zvýšila produkci prozánětlivých cytokinů, jako jsou MCP-1, TNF-α a IL-6, na úrovni mRNA (obr. 2(a) a 2(c)) i proteinu (obr. 2(b) a 2(d)). Sekrece adiponektinu z adipocytů nebyla stimulací 4-1BB změněna (údaje nejsou uvedeny). Stimulace makrofágů 4-1BBL snížila transkripty IL-10 (obrázek 2(c)), ale nebyla pozorována žádná změna v uvolňování proteinu IL-10 (obrázek 2(d)).

Obrázek 2

4-Stimulace 1BB nebo 4-1BBL zvyšuje uvolňování různých zánětlivých cytokinů z adipocytů nebo makrofágů. Adipocyty 3T3-L1 a makrofágy Raw264.7 byly ošetřeny 1 μg/ml 3E1, resp. 100 ng/ml r4-1BB Fc po dobu 48-24 h. Poté byly měřeny transkripty a proteiny MCP-1, TNF-α, IL-6 a IL-10 v adipocytech 3T3-L1 (a-b) a makrofázích Raw264.7 (c-d). Fosforylace IKKα/β (p-IKKα/β)/IKKβ, IκBα, p-p38, p-JNK/JNK, pAkt/Akt a β-aktin byly měřeny pomocí western blotu. Adipocyty 3T3-L1 byly inkubovány s 1 μg/ml 3E1 po dobu 3 h (e) a makrofágy Raw264.7 se 100 ng/ml r4-1BB Fc po dobu 1 h (f). Výsledky denzitometrie byly uvedeny v procentech kontroly. Údaje jsou průměrem ± SEM ze tří nezávislých experimentů provedených ve dvou opakováních. ; ; ; (ve srovnání s kontrolou).

Abychom pochopili molekulární mechanismy, kterými 4-1BB a/nebo 4-1BBL aktivují zánětlivou signalizaci v adipocytech a/nebo makrofázích, zkoumali jsme účinky stimulace 4-1BB/4-1BBL na intracelulární signální molekuly. Stimulace 4-1BB na adipocytech zvýšila fosforylaci p38 MAPK a JNK i fosforylaci IKK, předřazené molekuly NF-κB, a indukovala degradaci IκBα (obr. 2 e), zatímco stimulace 4-1BBL zvýšila fosforylaci Akt a p38 MAPK a JNK (obrázek 2(f)), ale neměla žádný vliv na degradaci proteinu IκBα (obrázek 2(f)) a fosforylaci IKK (údaje nejsou uvedeny). V souladu s předchozími zprávami , signalizace 4-1BBL nejen aktivovala p38 MAPK, ale také indukovala aktivaci Akt v makrofázích, což vedlo ke zvýšené expresi zánětlivých cytokinů.

3.3. Vlivem signalizace 4-1BBL došlo k aktivaci p38 MAPK. Uvolňování zánětlivých cytokinů v kontaktním kokulturním systému

Protože stimulace 4-1BB/4-1BBL zvýšila uvolňování zánětlivých cytokinů z adipocytů, respektive makrofágů, zkoumali jsme, zda interakce mezi buňkami prostřednictvím povrchových molekul, pravděpodobně 4-1BB/4-1BBL, hraje roli při iniciaci a spouštění zánětlivých reakcí. Nejprve jsme kokultivovali adipocyty 3T3-L1 a makrofágy Raw264.7 v systému přímého kontaktu a zjistili jsme, že produkce zánětlivých cytokinů IL-6, MCP-1 a TNF-α souvisí s počtem makrofágů v kultuře (obr. 3(a)-3(c)) a zvyšuje se s časem (obr. 3(d)-3(f)).

3.4. Vliv přerušení interakce mezi 4-1BB a 4-1BBL na uvolňování zánětlivých cytokinů v systému kontaktní kokultury

Pro ověření, zda se interakce mezi adipocyty a makrofágy zprostředkovaná 4-1BB/4-1BBL podílí na zánětlivé odpovědi v kontaktní kokultuře 3T3-L1 adipocyty/Raw264.7 makrofágy, jsme tuto interakci zablokovali pomocí neutralizační protilátky (TKS-1). Neutralizační monoklonální protilátka reaguje specificky s myší 4-1BBL, díky čemuž se 4-1BBL nemůže vázat na receptor 4-1BB a může přerušit interakci mezi 4-1BBL a 4-1BB. Proto může být signál zprostředkovaný 4-1BB v adipocytech i signál zprostředkovaný 4-1BBL v makrofázích otupen působením TKS-1. Zjistili jsme, že léčba TKS-1 významně snížila hladiny mRNA IL-6, MCP-1 a TNF-α v kontaktních kokulovaných adipocytech/makrofázích (obr. 4 a)). Snížení exprese těchto zánětlivých cytokinů bylo potvrzeno i na úrovni proteinů (obr. 4(b)). Kromě toho jsme také zjistili, že narušení interakce mezi 4-1BB a 4-1BBL snižuje uvolňování zánětlivých cytokinů z peritoneálních makrofágů kokulovaných s adipocyty (obrázek 4(c)). Abychom prozkoumali relativní podíl signalizace 4-1BB a 4-1BBL na expresi zánětlivých genů v kokulturovaných adipocytech/makrofázích, oddělili jsme makrofágy od adipocytů a měřili hladiny transkriptů zánětlivých cytokinů v obou typech buněk (obr. 4(d)). Neutralizační protilátka významně snížila zvýšení hladin mRNA IL-6, MCP-1 a TNF-α v adipocytech i v makrofázích (obr. 4(e) a 4(f)).

4. Diskuse

Obezitou vyvolaný tukový zánět je charakterizován náborem makrofágů do tukové tkáně a makrofágy jsou důležitým zdrojem zánětlivých reakcí. Kontakt mezi buňkami adipocytů a makrofágů je považován za důležitý pro spuštění zánětlivých drah v tukové tkáni , i když není jasné, které molekuly se na něm podílejí. Nedávné studie ukázaly, že zapojení ko-stimulačního receptoru 4-1BB s jeho ligandem 4-1BBL prostřednictvím buněčného kontaktu moduluje různé zánětlivé reakce . V předchozí práci jsme zjistili, že nedostatek 4-1BB snižuje tukový zánět tím, že snižuje nábor makrofágů a uvolňování zánětlivých cytokinů . Na základě těchto zjištění jsme předpokládali, že interakce mezi tukovými buňkami a makrofágy zprostředkovaná 4-1BB/4-1BBL může být důležitá při vzniku a/nebo udržování obezitou vyvolaného tukového zánětu. Je zajímavé, že transkripty 4-1BB v adipocytech a transkripty 4-1BBL v makrofázích byly výrazně regulovány faktory souvisejícími s obezitou (např. FFA a LPS) a jejich exprese byla také silně zvýšena v kontaktních kokulturách adipocytů/makrofágů. Navíc byla upregulace těchto molekul doprovázena zvýšeným uvolňováním zánětlivých cytokinů z buněk. Tato zjištění spolu s upregulací v obézní tukové tkáni a snížením tukového zánětu u obézních myší s deficitem 4-1BB naznačují, že se 4-1BB a 4-1BBL podílejí na vzniku a/nebo podpoře zánětlivých reakcí vyvolaných adipocyty/makrofágy.

Abychom zjistili, zda je za zánětlivé signály vyvolávající zánětlivé reakce zodpovědný 4-1BB na adipocytech nebo 4-1BBL na makrofázích, stimulovali jsme buňky agonisty, kteří se specificky vážou na 4-1BB nebo 4-1BBL. Poprvé jsme zjistili, že stimulace 4-1BB na adipocytech výrazně zvýšila uvolňování zánětlivých cytokinů MCP-1, TNF-α a IL-6. Při stimulaci adipocytů jsme zjistili, že 4-1BB na adipocytech výrazně zvyšuje uvolňování zánětlivých cytokinů. Stimulace reverzní signalizace zprostředkované 4-1BBL, která, jak známo, aktivuje makrofágy , rovněž zvýšila hladiny zánětlivých cytokinů. Nejnovější důkazy naznačují, že signalizace 4-1BB vede k aktivaci dráhy MAPK/NF-κB, která je v lymfocytech závislá na faktoru asociovaném s receptorem TNF (TRAF)-2 . V adipocytech jsme zjistili, že stimulace 4-1BB aktivuje p38 MAPK, JNK, IKK a indukuje degradaci proteinu IκBα. Na druhou stranu stimulace 4-1BBL vedla v makrofázích k aktivaci zánětlivých signálních molekul, jako jsou Akt a p38 MAPK, což je v souladu s předchozími studiemi . Důležitější je, že jsme zjistili, že léčba protilátkou neutralizující 4-1BBL snižuje uvolňování zánětlivých cytokinů v kokulturách na úrovni mRNA i proteinů. Tato zjištění společně naznačují, že interakce mezi adipocyty a makrofágy zprostředkovaná 4-1BB/4-1BBL spouští obousměrnou zánětlivou signalizaci a je silným induktorem zánětlivých reakcí v obézní tukové tkáni (obr. 5).

Obrázek 5

Schematické znázornění obousměrného přenosu signálu vyvolaného interakcí mezi adipocyty a makrofágy zprostředkovanou 4-1BB/4-1BBL. Uvolňování zánětlivých cytokinů (MCP-1, TNF-α a IL-6) v reakci na obousměrnou signalizaci se zřejmě podílí na tukovém zánětu.

Zajímavé je, že přerušení interakce 4-1BB/4-1BBL zcela nepotlačilo uvolňování zánětlivých cytokinů z kokultivovaných adipocytů a makrofágů. To může být způsobeno přítomností dalších povrchových buněčných molekul, které se účastní interakcí mezi buňkami a zprostředkovávají zánětlivé reakce. Adipocyty a makrofágy totiž na svém povrchu exprimují mnoho zánětlivých receptorů a ligandů . Například CD40 a herpes virus entry mediator (HVEM), které jsou exprimovány na adipocytech, jsou považovány za mediátory kontaktně závislé signalizace makrofágů a ablace těchto receptorů snižuje zánětlivé reakce vyvolané obezitou . Lze tedy předpokládat, že na interakci mezi adipocyty a makrofágy, která vede k iniciaci a udržování zánětlivých reakcí, se kromě 4-1BB a 4-1BBL podílejí i další receptory a ligandy.

Závěrem lze říci, že jsme poprvé prokázali, že na kontaktu závislá interakce mezi adipocyty a makrofágy zprostředkovaná receptory 4-1BB a 4-1BBL, která vytváří obousměrné signály, hraje klíčovou roli při uvolňování zánětlivých cytokinů z těchto buněk. 4-1BB a 4-1BBL spolu s dalšími molekulami, které se podílejí na interakci mezi buňkami adipocytů a makrofágů, mohou být cennými cíli pro prevenci obezitou vyvolaného tukového zánětu.

Konflikt zájmů

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Poděkování

Tato práce byla podpořena výzkumným programem Midcareer prostřednictvím grantu KOSEF (2009-0079485) Národní výzkumné nadace (NRF), financovaného Ministerstvem školství, vědy a technologie (MEST), a grantem programu Science Research Center (Center for Food & Nutritional Genomics) (2012-0000643) korejské NRF, financovaného MEST.

.