Isolation and Characterization of Impurities Present in 8-Chlorotheophylline

Korespondující autor: GABHE E-mail: S. Y:

Abstrakt

K oddělení tří nečistot přítomných ve vzorku 8-chloroteofylinu byla použita jednoduchá izokratická vysokoúčinná kapalinová chromatografie s obrácenou fází. Pro charakterizaci nečistot byla použita LC-MS. Na základě hmotnostních spektrálních dat byly struktury těchto nečistot charakterizovány jako 3,7-dihydro-1,3-dimethyl-1H-purin-2,6-dion (nečistota I), 3,7-dihydro-1,3,7-trimethyl-1H-purin-2,6-dion (nečistota II) a isomer 8-chlor-1,3-dimethyl-2,6(3H,1H)-purinedionu (nečistota III).

Klíčová slova

8-chloroteofylin, nečistota, LC-MS, HPLC na obrácené fázi, theofylin

Úvod

Velkoobjemová léčiva tvoří základnu všech farmaceutických odvětví, protože jsou zdrojem účinných farmaceutických látek (API) stanovené kvality. Hlavní výzvou pro průmysl hromadně vyráběných léčiv je hospodárná výroba konečného léčiva požadované kvality a čistoty. Čistota API závisí na několika faktorech, jako jsou suroviny, metody jejich výroby a typ krystalizace nebo purifikačního procesu. Je však téměř nemožné získat absolutně čisté materiály, protože nečistoty se do nich dostávají buď během výroby, čištění nebo skladování. Nečistota je jakákoli složka léčivé látky (s výjimkou vody), která není chemickou jednotkou definovanou jako léčivá látka. Pro léčivou látku vyrobenou chemickou syntézou klasifikuje ICH nečistoty do tří kategorií, jako jsou organické nečistoty, anorganické nečistoty a zbytková rozpouštědla. Nečistoty přítomné v látce mohou být toxické, mohou měnit fyzikální nebo chemické vlastnosti látky, čímž ji činí medicínsky nepoužitelnou. Nečistoty mohou snížit dobu použitelnosti přípravku a mohou způsobit potíže při formulaci. Proto je pro průmysl hromadně vyráběných léčiv kritickým problémem nejen kontrola nečistot, ale také jejich kvalifikace.

Antihistaminika, jako je dimenhydrinát a promethazin teoklát, jsou široce používanými léčivy při léčbě nevolnosti z pohybu. 8-Chloroteofylin, chemicky 8-chlor-1,3-dimethyl-2,6(1H, 3H)-purinedion, je meziprodukt, který se používá při přípravě solné formy těchto léčiv. Je nezbytný pro zajištění čistoty a bezpečnosti dimenhydrinátu a promethazin theoklátu. Aby toho bylo možné dosáhnout, musí být 8-chlorothylofilin získán v nejvyšší čistotě a se známým profilem nečistot.

Z přehledu literatury vyplývá, že Wadke a kol. studovali interakce 9-methylisoalloxazinu a 3,9-dimethylisoalloxazinu s 8-chlorothylofilinem. Jako vnitřní standard pro stanovení urátu metodou HPLC byl použit 8-chloroteofylin. Ten byl rovněž stanoven potenciometricky. Současné stanovení chlorfenoxamin-hydrochloridu, 8-chloroteofylinu a kofeinu ve vícesložkové lékové formě bylo provedeno tenkovrstvou chromatograficko-denzitometrickou metodou. Gil a spol. zkoumali elektroanalytické chování 8-chloroteofylinu pomocí cyklické voltametrie a diferenční pulzní polarografie a stanovili jeho obsah ve farmaceutických přípravcích pomocí diferenční pulzní polarografie. Pro 8-chloroteofylin spolu s difenhydraminem a kofeinem byla vyvinuta a validována metoda RP-HPLC indikující stabilitu. Byly rovněž vyvinuty poměrové spektrofotometrické a chemometrické metody s nulovým křížením první derivace pro simultánní stanovení kofeinu, 8-chloroteofylinu a chlorfenoksamin-hydrochloridu v ternárních směsích. Dosud nebyla popsána žádná chromatografická a spektroskopická metoda pro separaci a charakterizaci nečistot přítomných v 8-chloroteofylinu. Proto byla tato práce provedena s cílem izolovat a charakterizovat nečistoty přítomné v 8-chloroteofylinu pomocí moderních analytických technik.

8-chloroteofylin byl darovaný vzorek od společnosti Kores (India) Ltd., Thane. Všechny ostatní chemikálie a činidla byly získány od společnosti S. D. Fine Chemicals Ltd (Bombaj, Indie). Rozpouštědla použitá pro TLC a preparativní TLC studie byla analytické kvality a rozpouštědla použitá pro HPLC studie byla HPLC kvality. Pro přípravu pufru byl použit trihydrát octanu sodného třídy AR.

Na začátku byly provedeny TLC studie za účelem zjištění počtu nečistot přítomných ve vzorku. Jako stacionární fáze byly použity předem potažené TLC desky ze silikagelu 60GF254 (Merck). Vzorek byl rozpuštěn v minimálním množství octanu ethylnatého a tento roztok byl použit pro nanesení na TLC desky. Byly vyzkoušeny různé mobilní fáze. Ethylacetát:toluen:ledová kyselina octová (10:0,3:0,5 v/v/v) vykazovaly lepší separaci ve srovnání s ostatními mobilními fázemi. Ze vzorku 8-chloroteofylinu byly pomocí TLC separovány čtyři složky s hodnotami Rf 0,029, 0,132, 0,198 a 0,852 v uvedeném pořadí. 8-chloroteofylin měl Rf 0,852.

Po vytvoření mobilní fáze pro TLC byl učiněn pokus o separaci směsi pomocí preparativní TLC. Vzorek byl rozpuštěn v minimálním množství ethylacetátu a rozetřen ve formě pásu. Všechny tři nečistoty byly odděleny od 8-chloroteofylinu pomocí preparativní TLC za použití stejných chromatografických podmínek, které byly použity při TLC studiích. Jednotlivé pásy byly shromážděny odděleně a extrahovány pomocí ethylacetátu. Protože množství jednotlivých izolovaných nečistot I, II a III bylo velmi malé, bylo rozhodnuto izolovat tyto nečistoty společně. Nečistoty I, II a III byly souhrnně označeny jako frakce I. Frakce I byla izolována z 8-chloroteofylinu pomocí preparativní TLC. Protože každá nečistota nebyla izolována zvlášť, nemohly být provedeny různé identifikační techniky, jako je IR, NMR. Bylo rozhodnuto provést další zkoumání pomocí LC-MS, která umožňuje současnou separaci a charakterizaci. Před analýzou LC-MS byl pro frakci I vytvořen profil HPLC. Pro HPLC studie byl použit vysokoúčinný kapalinový chromatograf Tosoh vybavený pístovým čerpadlem CCPM, řídicí jednotkou čerpadla PX8010 a UV detektorem. K jednotce vstřikovacího ventilu byla připojena smyčka o objemu 20 µl. Frakce I byla rozpuštěna v acetonitrilu a byla podrobena HPLC analýze na reverzní fázi s mobilní fází složenou z acetonitrilu: trihydrátu octanu sodného (pH 3,57; 0,01 M) (5:95 v/v). Byla zvolena kolona Phenomenex ODS (250 × 4,6 mm I.D.; velikost částic 5 µm). Průtoková rychlost byla 1,5 ml/min a detekce byla sledována při vlnové délce 280 nm. Mobilní fáze byla před použitím filtrována přes filtr ze slinutého skla G5 ve vakuu a sonikována pro odstranění vzduchových bublin. HPLC analýza frakce I rovněž odhalila tři píky se středními retenčními časy 8,324 min, 14,275 min a 20,933 min (obr. 1). Pík se střední retenční dobou 2,086 min byl píkem rozpouštědla.

Frakce I byla poté podrobena LC-MS analýze pro charakterizaci nečistot. LC-MS studie byly provedeny na systému, v němž LC část tvořila HPLC řady 1100 (Agilent Technologies, USA) sestávající z vakuového odplyňovače (G1322A), kvartérní pumpy (G1311A), automatického vzorkovače (G1313A) a UV/viditelného detektoru (G1314A) a MS část tvořil trojitý kvadrupólový hmotnostní spektrometr Quattro II (Micromass UK Ltd.),

Ve studiích LC-MS bylo kapalinové chromatografické separace dosaženo pomocí kolony Phenomenex C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) při pokojové teplotě s mobilní fází acetonitril: pufr octanu sodného (5:95, v/v) při průtoku 1,5 ml/min. Hmotnostní spektrometr pracoval v režimu ionizace pozitivním rozprašováním elektronů (ESI) s poměrem hmotnost/náboj (m/z) v rozmezí 120-500 m/z. Jako rozprašovací plyn byl použit dusík. Data byla získána a zpracována pomocí softwaru Masslynx. Byla získána hmotnostní spektrální data nečistot (obr. 2, 3 a 4). Fragmentační dráha tří píků je charakterizována ztrátou methylové skupiny a/nebo karbonylové skupiny. Píky s hodnotami m/z 180,9, 195,7 a 214,9 odpovídají píkům +, + a +. Podle získaných MS dat byly nečistotami eluujícími v 8,324 min, 14,275 min a 20,933 min theofylin (mol. hm. 180), kofein (mol. hm. 194) a isomer 8-chloroteofylinu (mol. hm. 214,5) (tabulka 1). Byly tak separovány tři nečistoty a jejich struktura byla objasněna na základě hmotnostních spektrálních dat (schéma 1).