Ačkoli proteinové testy mají ve výzkumu v oblasti přírodních věd řadu využití, neexistuje jediná metoda, která by byla vhodná pro všechny aplikace. Přes veškerý pokrok v moderní vědě neexistuje metoda stanovení bílkovin, která by nebyla ovlivněna žádnými nebílkovinnými složkami nebo rozdíly ve složení bílkovin. Z tohoto důvodu považují proteinové laboratoře za nezbytné mít pro výzkumné aplikace více než jeden typ proteinového testu.
Každý test má své výhody a omezení. Pokud tedy chcete získat přesné výsledky svého experimentu, měli byste být schopni vybrat pro svou aplikaci nejvhodnější test.
Typy kolorimetrických proteinových testů
Na základě použité chemie jsou dvě nejběžnější metody kolorimetrické detekce a kvantifikace celkového proteinu: test vazby proteinového barviva a/nebo chelatační test na bázi měďnatých iontů.
Testy vazby barviva
Testy vazby barviva, jako je Bradfordův (Coomassieho) a 660nm proteinový test, jsou založeny na vazbě molekul bílkovin na Coomassieho barvivo za kyselých podmínek. Jakmile se molekuly bílkovin navážou na barvivo, barva se změní z hnědé (Amax= 465nm) na modrou (Amax= 610nm). Změna hustoty barvy (která se odečítá při 595nm) je úměrná koncentraci proteinu.
Zásadní aminokyseliny (arginin, lysin a histidin) hrají zásadní roli při tvorbě komplexů barvivo-protein a výsledném spektrálním posunu, zatímco menší proteiny (méně než 3kDa) a aminokyseliny barevné změny nevyvolávají.
Testy na bázi měďnatých iontů
Při testech proteinů na bázi měďnatých iontů se roztok proteinu smíchá s alkalickým roztokem měďnaté soli, aby se usnadnila chelatace měďnatých iontů (Cu2+) s peptidovými vazbami a následná redukce měďnatých iontů (Cu2+) na měďnaté ionty (Cu+). Případný přebytek měďnatých iontů zůstane nevázaný na peptidové vazby a bude k dispozici pro detekci.
Proteinové testy založené na měďnatých iontech lze rozdělit do dvou skupin – (1) testy, které detekují redukované měďnaté ionty (Cu+), a (2) testy, které detekují nevázané měďnaté ionty (Cu2+). K detekci měďnatých iontů lze použít kyselinu bicinchoninovou (BCA) nebo Folinovo činidlo (kyselina fosfomolybdová/fosfotungová). Po redukci použitého činidla vzniká modré zbarvení. Množství vzniklé barvy lze odečíst při 650 nm až 750 nm a je úměrné množství peptidových vazeb.
Poznámka: Přítomnost tyrosinu, tryptofanu, cysteinu, histidinu a aspargininu v proteinu zvyšuje výslednou hustotu barvy.
Při testech založených na detekci nevázaných měďnatých iontů se alkalická měď smíchá s roztokem proteinu a nevázané měďnaté ionty se pak detekují pomocí činidla produkujícího barvu, které reaguje s měďnatými ionty. Množství vzniklé barvy je nepřímo úměrné množství peptidové vazby ve vzorku.
Výběr proteinových testů: Některé faktory, které je třeba zvážit
Při výběru testu je třeba zvážit řadu faktorů. Zde jsou některé z nich.
- Kompatibilita s typem vzorku a jeho složkami. Povaha proteinového vzorku a přítomnost neproteinových látek v proteinových roztocích může významně ovlivnit výsledky vašeho experimentu. Mějte na paměti, že přítomnost redukčních činidel, chelatačních činidel kovů, barviv, aminů a cukrů interferuje s bílkovinnými testy na bázi mědi, zatímco bílkovinné roztoky obsahující detergenty interferují s bílkovinnými testy na bázi barviv.
- Rozsah testu a požadovaný objem vzorku. Většina kolorimetrických testů vyžaduje pro spolehlivý odhad alespoň 0,5 µg proteinů. Proto by se u těžko dostupných vzorků měly zvážit metody, které pro spolehlivý odhad vyžadují co nejmenší množství vzorku.
- Rovnoměrnost mezi proteiny. Testy bílkovin založené na barvivech a ty, které zahrnují redukci měďnatých iontů na měďnaté ionty, vykazují značné rozdíly mezi jednotlivými bílkovinami.
- Časové hledisko. Složitost vzorku a zvolená metoda analýzy určují dobu, kterou potřebujete k provedení analýzy bílkovin. Vzorky proteinů obsahující interferující látky a testy, které používají standardní grafy nebo křivky, spotřebují více času.
- Požadavky na přístrojové vybavení. Dostupnost spektrofotometru nebo destičkové čtečky potřebné k měření barvy vzniklé (absorbance) při analýze může rovněž ovlivnit váš výběr.
.