Proteinová exprese, purifikace a testovací postupy hAASS-SDH
Vektor: pFB-LIC-Bse
Buněčná linie: DH10Bac
Tagy a přídavky: N-koncová, hexahistidinová značka štěpitelná TEV proteázou
Sekvence proteinu:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(podtržená sekvence obsahuje vektorově kódovaný His-značku a štěpné místo TEV proteázy*)
Sklizené buňky byly resuspendovány v lyzačním pufru (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 % glycerolu, 20 mM imidazolu pH 7,4, 0,5 mM TCEP, 1 µl na 1 ml koktejlu inhibitoru proteázy bez EDTA)
Buněčný pelet byl rozpuštěn v přibližně 200 ml lyzačního pufru a rozbit homogenizací dvěma průchody při 12 000 psi. Buněčné zbytky byly peletovány při 35000 x g, 1 h a supernatant byl použit k purifikaci na gravitační koloně Ni-NTA (5 ml).
Použitá pufry jsou podrobně popsány níže;
Vazný pufr: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 20 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Proplachovací pufr: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 % glycerol, 40 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Elution Buffer: Glycerol: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 % glycerol, 250 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Vyčištěný buněčný extrakt byl přidán k 5 ml Ni-NTA pryskyřice předem ekvilibrované lyzačním pufrem a propasírován přes skleněnou kolonu. Kolona byla poté promyta vazebným pufrem (2 x 50 ml) a promývacím pufrem (2 x 50 ml). Protein byl eluován pomocí Elution Buffer v 5 x 5 ml frakcích. Eluované frakce z kolony 1 byly sloučeny a zahuštěny na 5 ml pomocí spinového koncentrátoru s MWCO 30 kDa a vstříknuty do kolony S200 16/60 (předem ekvilibrované v GF pufru (50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5 % glycerol)) rychlostí 1,0 ml/min. Bylo shromážděno 1,5 ml frakcí. Eluovaný protein byl štěpen přes noc při 4 °C pomocí TEV proteázy (1/20 (w/w)). Následující den byl vzorek proteinu naložen na 0,5ml Ni-sefarosovou kolonu předem ekvilibrovanou GF pufrem, aby se odstranil nerozštěpený protein. Sloučené proteinové frakce byly zahuštěny na 13 mg/ml pomocí 30 kDa mwco koncentrátoru.
Test aktivity a screening
Aktivita SDH hAASS byla měřena sledováním redukce NAD+ na NADH s využitím toho, že redukovaná forma NADH je fluorescenční při excitaci světlem o vlnové délce 340 nm. Test jsme převzali do formátu 384 jamek s detekcí pomocí fluorescenční čtečky PheraStar (BMG Labtech) (excitace/emise = 340/480 nm). Tento test poskytl lineární odezvu při koncentraci proteinu až do 150 nM. Typická reakce se skládá ze 100 nM purifikovaného enzymu, 0,2 mM NAD+, 1,3 mM sacharopinu. Reakční pufr se skládá z 25 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1 % BSA, 0,05 % CHAPS. Knihovny sloučenin (LOPAC (Sigma) a NIH Clinical Collections I&II) byly prověřeny ve vlastní laboratoři při koncentraci sloučeniny 20 μM.
Diferenciální skenovací fluorimetrie
DSF byla provedena v 96jamkové destičce pomocí přístroje Mx3005p RT-PCR (Stratagene) s excitačním a emisním filtrem 492 a 610 nm. Každá jamka obsahovala 2 µl proteinu ve 2 µM pufru DSF (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µl SYPRO ORANGE 1000krát zředěného v pufru DSF ze zásob výrobce (Invitrogen) a (případně) 2 µl ligandu v různých koncentracích. Intenzita fluorescence byla měřena od 25 do 96 °C s rychlostí náběhu 3 °C/min.
Krystalizace
Apo krystaly byly připraveny smícháním 50 nL proteinu hAASS-SDH (80 mg/ml) se 100 nL zásobního roztoku obsahujícího 20% PEG3350, 0,1M Tris pH 7,5 a 0,2-0,33 M malonanu sodného. Krystaly vázané na NAD+ byly připraveny smícháním 100 nL proteinu hAASS-SDH (18 mg/ml, v molárním přebytku NAD+) s 50 nL zásobního roztoku obsahujícího 25 % PEG3350, 0,2M NaCl a 0,1M tris pH 8,5. Krystaly byly před zmrazením v kapalném dusíku kryochráněny v 9% butandiolu. Pro kampaň screeningu fragmentů byly krystaly namáčeny sloučeninami (10/50/500 mM) v krystalizačním roztoku doplněném 8% butandiolem po dobu 5-30 min a zmrazeny v kapalném dusíku.
Postupy určování struktury
Krystaly s apo a NAD+ vazbou hAASS-SDH patří do různých prostorových skupin (P43212 vs P212121). Struktura hAASS-SDH byla vyřešena molekulární náhradou pomocí programu PHASER s použitím houbové sacharopinreduktázy ze S.cerevisiae (kód PDB 2AXQ) jako vyhledávacího modelu (38% sekvenční identita). V asymetrické jednotce (a.u.) byly nalezeny dvě molekuly. Původní model byl přestavěn pomocí nástroje phenix.autobuild. Vázaná molekula NAD+ v aktivním místě byla identifikována diferenční Fourierovou metodou a ručně umístěna do elektronové hustoty pomocí programu Coot. Pro dokončení modelu byly provedeny iterační cykly phenix.refine včetně TLS zjemnění a následně ruční sestavení modelu pro chybějící zbytky pomocí Coot. Nebyly použity žádné NCS restrikce kvůli konformačním rozdílům v doméně III (res 278-376) dvou kopií v a.u. Atomy rozpouštědel byly umístěny během posledních čtyř kol zpřesňování pomocí phenix.refine. Pro kampaň screeningu fragmentů byly ligandy identifikovány pomocí DIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) s využitím rozdílových map hustoty. Slabší vazby s nízkou obsazeností byly vyhodnoceny pomocí PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/), založené na statistických modelech pro nalezení hustoty ligandů přítomných v daném souboru dat, které se nevyskytují ve většině souborů dat. Souřadnice a strukturní faktory všech datových souborů jsou uloženy v databázi RCSB Protein Data Bank. Statistiky sběru dat a upřesnění jsou k dispozici na stránkách PDB.
Komerčně dostupná činidla
CRISPR/Cas9 knockout plasmidy
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Cat # 10157
.