Nové techniky izolace mikroorganismů s důrazem na laserový tisk | CDhistory

Nové izolační metody

V současné době se k odhalení nových, dosud nekultivovaných mikroorganismů používá široká škála metod. Používají se zejména nová živná média obsahující specifické látky; kultivace probíhá za různých fyzikálních a chemických podmínek prostředí, jako je složení atmosféry, teplota a pH. Dále bylo studováno použití zředěných živných půd v kombinaci s dlouhými inkubačními dobami a společná kultivace mikroorganismů různých druhů. V posledních letech byly vyvinuty některé zásadně nové kultivační metody založené na umístění mikroorganismů v přirozeném prostředí bez použití živných médií. Tyto metody využívají difuzní komory a polymerní povlaky, v nichž jsou umístěny mikrobiální buňky. V tomto případě mikroorganismy dostávají všechny potřebné živiny z přírodního prostředí a zůstávají od něj izolovány. Za významný úspěch se považuje přidělení nového producenta antibiotik (teixobaktinu) pomocí těchto metod. Jiný přístup zahrnuje současnou kultivaci a screening desítek a stovek tisíc bakteriálních mikrokolonií na porézních polymerních nebo keramických izolačních čipech. Pro kultivaci „nekultivovatelných“ mikroorganismů lze rovněž použít metody umožňující izolaci jednotlivých buněk z přirozeného prostředí. Mezi těmito metodami jsou nejoblíbenější metody založené na ředění suspenze mikroorganismů, průtokové cytometrii a třídění buněk, laserové mikrodisekci, kompartmentalizaci a použití mikromanipulátorů. Kromě kultivace dosud nekultivovaných druhů mikroorganismů je izolace jednotlivých mikrobiálních buněk nezbytná pro studium buněčné fyziologie, interakcí mezi buňkami a také pro hledání nových metabolitů, jako jsou antibiotika a enzymy.

Současný vědecký a technologický pokrok poskytuje mnoho možností, pokud jde o vývoj nových metod kultivace, izolace, manipulace a studia jednotlivých bakteriálních buněk a jejich konsorcií. Nové přístupy mohou výrazně urychlit proces práce s mikroorganismy a umožnit provádění jejich úplnějších a komplexnějších studií. Je třeba poznamenat, že dosud bylo navrženo jen velmi málo metod pro polohování soustav bakterií s mikrometrovou přesností. V práci Akselroda a spol. byly trojrozměrné (3D) sítě živých buněk v hydrogelu vytvořeny bez ztráty jejich životaschopnosti pomocí polí multiplexovaných holografických optických pastí (pinzet) s bezprecedentní přesností (<400 nm). K vytvoření optických pastí byly použity dva lasery: Ar+ laser (20 W, vlnová délka 514 nm) a kontinuální Ti: safírový laser laditelný v rozsahu λ = 850-900 nm, jakož i kombinace dvou difrakčních prvků kombinovaných s různými čočkami v inverzním optickém mikroskopu. Byly vytvořeny sítě fibroblastů 3T3 obklopené prstencem bakterií. Byla také prokázána schopnost manipulovat se stovkami bakterií Pseudomonas aeruginosa současně ve dvourozměrných (2D) a 3D polích. Metoda holografického optického zachycení je velmi přesná, ale technicky obtížně proveditelná.

Ve studii Rowana a spol. je navržena metoda heterogenní funkcionalizace povrchů, což je čtyřstupňový litografický proces založený na mikrokontaktním tisku organických monovrstev, implantaci hyperrozvětveného polymeru a jeho další funkcionalizaci. Výsledkem je získání struktur, na které se provádí řízená inokulace bakteriálních buněk. Výzkumy přežívání buněk ukázaly, že buňky zůstávají na získaných strukturovaných površích životaschopné. Byly získány velké izoláty bakterií obsahující 18 ± 5 bakterií a malé izoláty obsahující 2 ± 1 bakterii. Podle tohoto článku lze demonstrovanou metodu použít pro vysokokapacitní screening a biosenzoriku. Je však obtížné skloubit heterogenní funkcionalizaci povrchů pomocí této metody s rutinním biologickým výzkumem a podmínkami kultivace mikroorganismů (teplota, pH, živiny atd.). Nutno podotknout, že úkol najít jednoduchý způsob, jak zajistit vysoké rozlišení matic živých bakterií s možností různých biologických studií, byl v některých publikacích vyřešen. Přístupy navržené v těchto pracích jsou vlastně předzvěstí 3D tisku.

Ve studii Weibela a kol. byla navržena technika otiskování živých bakterií na agarosové destičky. Byla vytištěna pole bakterií (velikost jedné skvrny s bakteriemi >200 µm) na ploše až 50 cm2. Razítka z polydimethylsiloxanu (PDMS) byla vyrobena pomocí fotolitografické techniky. Dosažená minimální velikost tiskového výstupku byla 190 µm při výšce 140 µm, což však zdaleka nedosahuje velikosti potřebné k oddělení bakterií. Tato metoda je rychlá, reprodukovatelná a pohodlná a lze ji použít ke kontrole vzoru, rozestupů a orientace mezi koloniemi různých bakterií. Ve studii Xu a kol. byla pole živých bakterií s buněčným rozlišením vytištěna na agarosový substrát pomocí elastomerových (PDMS) razítek s vysokým poměrem stran, získaných metodou reverzní litografie in situ (RISL). Obrázek 1 ukazuje výhody metody RISL oproti standardní ultrafialové fotolitografii. Jediným omezením technologie RISL je průměr výstupku, který může být sotva <1 µm kvůli optickému difrakčnímu limitu.

Metoda mikrokontaktního tisku bakteriálních polí funguje následujícím způsobem: Kapka Escherichia coli v kultivačním médiu LB se nanese na agarosový gel (3 % hmotnosti v LB) a na agarosovém substrátu se vytvoří monovrstva bakterií (kapalina je absorbována agarosovým gelem). Poté dojde ke kontaktu razítka PDMS s monovrstvou bakterií pokrývající agarosový gel. Razítko se odstraní a část bakterií na něm zůstane. Poté se při kontaktu razítka s vrstvou agarózového gelu (4 hm. % v LB, tloušťka 200 µm) bakterie přenesou na vrstvu agarózy. Během několika sekund tak lze přímo na agarosový substrát vytisknout pole bakterií E. coli s mikronovým rozlišením až po jednotlivé bakterie na velké ploše (cm2). Bylo prokázáno, že po vytištění vzoru bakterie pokračují v růstu a dělení jako v podmínkách masové kultury, tj. bakterie si po vytištění zachovávají své normální fyziologické chování. Rovněž se ukázalo, že pro dobrý výkon tisku je rozhodující koncentrace agarózy. Příliš nízká koncentrace vede ke zkreslení tištěného vzoru, zatímco příliš vysoká koncentrace není pro kultivaci bakterií vhodná. Pro získání polí z jednotlivých bakterií byl studován vliv snížení počáteční koncentrace bakterií v kapce kultivačního média LB. Pro počáteční koncentrace 109 a 108 buněk/ml byl naměřen průměrný počet bakterií na jednu skvrnu 12,1, resp. 1,4 bakterie. Při nízké koncentraci bakterií bylo dosaženo velmi úzkého rozdělení: V 44,6 % skvrn byla pouze jedna buňka E. coli a ve 40,1 % skvrn bylo 0 nebo 2 buňky. Tyto výsledky prokázaly, že mikrokontaktní tisk umožňuje výrobu pravidelných polí jednotlivých bakterií. Navíc se ukázalo, že tento přístup k separaci bakteriálních polí umožňuje analyzovat rychlost růstu jednotlivých linií bakterií. Tato metodika poskytuje jednoduchý způsob pro libovolnou prostorovou 2D distribuci bakterií a může být použita jak pro screening, tak pro studium fenotypové variability bakterií, populační dynamiky a evoluce ekosystémů.

Rychle se rozvíjející oblast – sociomikrobiologie – identifikovala mechanismy, s jejichž pomocí se bakterie účastní kolaborativních a konkurenčních vztahů tím, že ovlivňují blízké sousedy prostřednictvím fyzického kontaktu a modifikace chemického složení jejich společného mikroprostředí. Pro zkoumání chování malých mikrobiálních agregátů byly vyvinuty různé technologie mikroprocesingu, které omezují bakterie v mikrofluidních zařízeních, mikrorezonátorech a kapkách kapaliny o velmi malém objemu. Schopnost integrovat analytické systémy s mikrofluidikou učinila tyto izolační platformy atraktivními pro vysoce výkonný screening rezistence vůči antibiotikům a analýzu enzymatické aktivity. Například v práci Eun et al. je popsána vysoce výkonná analýza a izolace bakteriálních buněk zapouzdřených v agarosových mikročásticích s využitím fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS). K vytvoření monodisperzních mikročástic o průměru ≈30 µm byly použity mikrofluidní systémy s průtokovou fokusací. Velikost těchto částic umožnila jejich kompatibilitu s průtokovou cytometrií a FACS a citlivost těchto metod zkrátila inkubační dobu pro replikaci buněk před provedením analýz. Malý objem mikročástic (≈1-50 pikolitrů ) minimalizoval počet činidel potřebných pro bakteriální studie. Tato platforma umožnila efektivně alokovat a izolovat bakterie a také využít kombinaci metod pro rychlou identifikaci cílů pro biologicky aktivní malé molekuly. Jako experimentální ukázka této metody byly buňky E. coli zapouzdřeny do agarosových mikročástic, inkubovány v přítomnosti různých koncentrací rifampicinu a analyzovány pomocí FACS. Byla stanovena minimální inhibiční koncentrace rifampicinu a pomocí FACS byly izolovány spontánní mutanty, které měly rezistenci k antibiotiku, a charakterizovány sekvenováním DNA. Při použití tohoto přístupu se čas a množství antibiotik potřebných k izolaci mutantů zkrátily 8krát, resp. 150krát ve srovnání s tradičními mikrobiologickými metodami používajícími živné agarové plotny. Tato metoda je tedy důležitá v oblasti chemické biologie, chemie přírodních produktů a také pro objevování a charakterizaci biologicky aktivních sekundárních metabolitů.

Výše uvedené přístupy byly užitečné pro omezení velikosti, tvaru a fyzikálních atributů (mikrostanoviště); žádný z nich však neposkytoval možnost libovolně určit 3D geometrii bakteriálních agregátů nebo orientaci více populací. Kromě toho proces zapouzdření buněk v dutinách s velmi malým objemem často omezuje transport hmoty, což vede k podmínkám, které jsou neslučitelné s růstem a signalizací mezi fyzicky izolovanými populacemi. Rostoucí počet důkazů poukazuje na význam mikrokolonií při rozmnožování bakterií; chybí však nástroje pro systematické hodnocení chování buněk v takových společenstvích. Nové strategie pro vytváření 3D kulturního prostředí v mikroskopickém měřítku mohou hrát zásadní roli při zjišťování, jak bakterie zvládají rezistenci vůči antibiotikům a další sociální chování v malých hustých agregátech.

V článku Connell et al. a Connell et al. je popsána metoda laserové tvorby mikroskopických 3D komor založená na multifotonové litografii (MPL). Metoda MPL má vysokou kapacitu a schopnost vytvářet libovolné vzory. Nabízí možnosti průmyslové výroby 3D mikrozařízení, jako jsou mikrooptické komponenty, scaffoldy pro tkáňové inženýrství a mikrofluidní čipy. Ve studii Connella a spol. byl k vytvoření mikroskopických 3D bakteriálních komor použit hovězí sérový albumin (BSA), vysoce rozpustný protein, který lze zesíťovat do porézních, odolných a biokompatibilních hydrogelů. Do komor s BSA o objemu 1 pl bylo uzavřeno několik samostatných bakterií, které byly následně pěstovány v klonálních populacích. Vzhledem k difuzi biologicky významných molekul a antibiotik přes stěny BSA a také k výměně signálů citlivých na kvorum bylo studováno sociální chování bakteriálních komunit v závislosti na velikosti a hustotě populace, tvaru nádoby a rychlosti proudění prostředí.

V lidském těle bakterie obvykle existují ve strukturovaných 3D komunitách složených z několika bakteriálních druhů. Pro získání podrobných informací o vlivu geometrie na patogenitu je v práci Connell et al. popsána strategie 3D tisku bakteriálních společenstev, v níž lze fyzikálně odlišné, ale chemicky interaktivní populace určité velikosti, tvaru a hustoty uspořádat v podstatě do libovolné formy (obr. 2). Pomocí tohoto přístupu bylo prokázáno, že stabilita jednoho patogenního druhu bakterií vůči antibiotiku může zvýšit odolnost druhého druhu díky jejich 3D vztahům. Pomocí laserové litografické techniky byly vytvořeny mikroskopické kontejnery o objemu až 1 pl s tloušťkou stěny kontejneru až 2 µm kolem vybraných bakterií suspendovaných v želatině zesíťováním polypeptidových molekul v ohniskové oblasti v důsledku nelineární absorpce laserového záření molekulami fotosenzibilizátoru. Výsledkem této multifotonové absorpce je tvorba singletového kyslíku, který stimuluje intramolekulární a intermolekulární kovalentní síťovací reakce mezi BSA a želatinou. Jedinečné fyzikální a chemické vlastnosti želatiny motivovaly zájem o její využití pro různé aplikace, včetně skladování, imobilizace a 3D kultivace bakterií. Po odstranění přebytečného činidla jsou bakterie lokalizovány v uzavřených dutinách vytvořených zesíťovanou želatinou, která je vysoce porézním materiálem a podporuje rychlý růst plně uzavřených buněčných populací. Je snadno propustný pro polypeptidy, antibiotika a pro fyzikální a chemické signály, s jejichž pomocí dochází k interakci mezi bakteriemi. Izolace buněk v mikrokontejnerech poskytuje možnosti pro vkládání různých typů/hustot kontejnerů do sebe a také pro dynamické změny orientace celých populací bakterií v rámci společenství.

Autoři prokázali, že prostorově lokalizované interakce grampozitivních bakterií Staphylococcus aureus a gramnegativních bakterií P. aeruginosa (dva lidské patogeny, které často tvoří přetrvávající koinfekce uvnitř ran, katétrů a plic pacientů s mukoviscidózou) mohou zvýšit přežívání stafylokoků při léčbě β-laktamovými antibiotiky.

Mikro-3D tisk buněk zásadně rozšiřuje možnosti zkoumání rezistence k antibiotikům, kdy jediná bakteriální mikroskupina může ovlivnit citlivost k antibiotikům přilehlých okolních nebo vložených populací – což má zvláštní význam pro infekce in vivo (např, rány, dutina ústní a cystická fibróza plic), kde jsou tkáně často kolonizovány několika druhy bakterií současně. Skutečná síla 3D buněčného tisku spočívá ve schopnosti uspořádat mikrobiální společenstva v neomezené škále geometrií. Mikrotisk 3D buněk může být také cenným nástrojem pro zkoumání mechanismů a dynamiky adaptačních reakcí na podmínky prostředí.