3D tištěné bionické uši | CDhistory

Návrh a realizace bionických orgánů a zařízení, které rozšiřují lidské schopnosti, známé jako kybernetika, jsou oblastí rostoucího vědeckého zájmu.1,2 Tato oblast má potenciál vytvářet náhradní části lidského těla na míru, nebo dokonce vytvářet orgány se schopnostmi přesahujícími běžné možnosti lidské biologie. Zejména vývoj přístupů pro přímou vícerozměrnou integraci funkčních elektronických komponent s biologickou tkání a orgány by mohl mít obrovský dopad na regenerativní medicínu, protetiku a rozhraní člověk-stroj.3,4 V poslední době bylo popsáno několik zpráv o propojení elektroniky a tkání pomocí flexibilních a/nebo roztažitelných planárních zařízení a senzorů, které se přizpůsobují povrchu tkání, což umožňuje aplikace, jako je biochemické snímání a sondování elektrických aktivit na povrchu srdce,5 plic,6 mozku,7 kůže8 a zubů.9 Dosažení bezproblémového trojrozměrného propojení elektronických komponent s biologickými tkáněmi a orgány je však podstatně náročnější.4

Tkáňové inženýrství se řídí zásadou, že různé typy buněk lze přimět k syntéze nové tkáně, pokud jsou vysety na vhodný trojrozměrný hydrogelový scaffold v odpovídajícím růstovém prostředí.10-15 Po kultivaci in vivo nebo in vitro se vytvoří tkáňové struktury, které mají morfologii původního scaffoldu.16 Velkou výzvou v tradičních přístupech tkáňového inženýrství je však vytvoření implantátů s buňkami, jejichž struktura napodobuje nativní tkáň, a to jak anatomickou geometrií, tak rozložením buněk uvnitř tkáně.17 K výrobě trojrozměrných tkáňových konstruktů s komplexní 3D geometrií byly použity techniky, jako je nasazení buněk do neadhezivních forem nebo samoskládacích scaffoldů.18,19 Přesto stávající techniky stále nedokážou snadno vytvořit části orgánů nebo tkání s požadovanou prostorovou heterogenitou a přesnou anatomickou geometrií, aby se vyhovělo nedostatku dárcovských orgánů pro transplantace.20-22 Například celková rekonstrukce zevního ucha pomocí autogenní chrupavky – s cílem znovu vytvořit ucho, které je svým vzhledem podobné kontralaterálnímu ušnímu boltci – zůstává jedním z nejobtížnějších problémů v oblasti plastické a rekonstrukční chirurgie.23

Potenciální řešení nabízejí aditivní výrobní techniky, jako je 3D tisk, a to prostřednictvím možnosti rychlého vytváření počítačem podporovaných modelů (CAD) jejich rozřezáním do vrstev a vytvářením vrstev směrem nahoru pomocí biologických buněk jako inkoustů, a to v přesné anatomické geometrii lidských orgánů.24-27 Varianty 3D tisku byly použity jako metody výroby pevných volných forem, ačkoli jejich použití bylo omezeno hlavně na vytváření pasivních mechanických součástí.24,28 3D tisk založený na vytlačování byl použit pro konstrukci scaffoldů z tvrdých tkání, jako jsou kolenní menisky a meziobratlové ploténky doplněné zapouzdřenými buňkami.29-31 Tato technika nabízí možnost vytvářet prostorově heterogenní vícemateriálové struktury s využitím depozičních nástrojů, které mohou vytlačovat širokou škálu materiálů.32 Funkční stavební bloky v nanorozměrech dále umožňují všestranné sestavování makrorozměrných součástí zdola nahoru, které mají laditelné funkce. To by mohlo umožnit současný tisk nanoelektronických materiálů a biologických buněk a získat tak trojrozměrně integrované kyborgské tkáně a orgány vykazující jedinečné schopnosti.33,34

Představujeme zde koncepčně nový přístup, který řeší výše uvedené výzvy tím, že plně propojuje funkční elektronické komponenty s biologickou tkání prostřednictvím 3D tisku nanoelektronických materiálů a životaschopných hydrogelů osázených buňkami v přesné anatomické geometrii lidských orgánů. Vzhledem k tomu, že elektronické obvody jsou jádrem smyslových zařízení a zařízení pro zpracování informací,35 umožňuje kultivace vytištěné hybridní architektury in vitro růst „kyborgských orgánů“, které vykazují rozšířené funkce oproti lidské biologii. Náš přístup nabízí možnost definovat a vytvářet prostorově heterogenní konstrukce vytlačováním široké škály materiálů postupem po vrstvách, dokud není dokončena konečná stereolitografická geometrie. Tento koncept 3D tisku živých buněk spolu s elektronickými součástmi a jejich pěstování do funkčních orgánů představuje nový směr ve spojování elektroniky s biologickými systémy. Takové kyborgské orgány se totiž liší od umělé tkáně nebo konformní planární/pružné elektroniky a nabízejí jedinečný způsob, jak dosáhnout trojrozměrného spojení elektroniky s tkání.

Jako důkaz konceptu tohoto přístupu jsme vyhodnotili schopnost 3D tisku vytvořit životaschopný ušní boltec, který obsahuje také elektroniku umožňující alternativní schopnosti k lidskému sluchu. Lidské orgány tvořené převážně chrupavčitou tkání, jako je ušní boltec, představují vhodné prototypové kandidáty pro zkoumání proveditelnosti našeho přístupu. Důvodem je 1) přirozená složitost anatomické geometrie ucha, která ztěžuje jeho bioinženýrství pomocí tradičních přístupů tkáňového inženýrství, a také 2) jednoduchost jeho struktury na úrovni chrupavčité tkáně kvůli absenci cév.23,36 Sestavování nanoelektronických matric zdola nahoru navíc poskytuje možnost hierarchicky generovat funkční elektronické komponenty v makroměřítku. Konkrétně demonstrujeme 3D tisk alginátové hydrogelové matrice osázené chondrocyty s elektricky vodivou anténou s indukční cívkou napuštěnou nanočásticemi stříbra (AgNP), která se připojuje k elektrodám ve tvaru hlemýždě uloženým na silikonu. Dohromady je výsledkem trojrozměrná integrace funkčních elektronických komponent do složité a přesné anatomické geometrie lidského ucha (obr. 1).

Následující kroky jsou součástí procesu. Nejprve se použije výkres CAD bionického ucha (obr. 1A), který předepisuje anatomickou geometrii a prostorovou heterogenitu různých funkčních materiálů. Jak bylo popsáno výše, tři materiály tvoří tři funkční složky (strukturální, biologickou a elektronickou) bionického ucha. Tyto materiály se vkládají do 3D tiskárny Fab@Home založené na vytlačování stříkačkou (The NextFab Store, Albuquerque, NM) (obr. 1B). Vytištěný bioelektronický hybridní ušní konstrukt je poté kultivován in vitro, aby umožnil růst chrupavčité tkáně a vytvořil kyborgské ucho se schopností snímat elektromagnetické signály v radiofrekvenčním (RF) rozsahu pomocí indukční cívky fungující jako přijímací anténa (obr. 1C).

Pro demonstraci našeho přístupu jsme vytiskli konstrukt bionického ucha následujícím způsobem. Jako lešení jsme alginátovou hydrogelovou matrici předem osadili životaschopnými chondrocyty v hustotě ~ 60 milionů buněk/ml (viz podpůrné informace). Alginátová matrice je trojrozměrně stabilní v kultuře, netoxická, kompatibilní s předvýsevem a vytlačováním a je vhodným nosičem buněk, protože síťování může být zahájeno před uložením.37 Chondrocyty použité pro tisk byly izolovány z kloubní chrupavky měsíčních telat (Astarte Biologics, Redmond, WA). K definování tiskových drah byl použit výkres CAD lidského ušního boltce ve formátu stereolitografie (STL) s integrovanou anténou s kruhovou cívkou připojenou k elektrodám ve tvaru hlemýždě, a to rozřezáním modelu na vrstvy obrysových a rastrových výplňových drah. Síťování bylo zahájeno v alginátové hydrogelové matrici předem osázené životaschopnými chondrocyty, která byla poté vytištěna 3D tiskem spolu s vodivými (napuštěnými AgNP) a nevodivými silikonovými roztoky (film 1). Touto metodou byly společně vytvořeny biologické, elektronické a strukturální komponenty bionického orgánu v jediném procesu.

Obrázek 2A ukazuje 3D vytištěné bionické ucho bezprostředně po vytištění. Pozoruhodné je zjištění, že věrně kopíruje výkres CAD, a to v přesné prostorovosti pro každý materiál, jak to diktoval návrh. Vytištěná konstrukce ucha byla ponořena do kultivačního média pro chondrocyty obsahujícího 10% nebo 20% fetální hovězí sérum (FBS), které bylo obnovováno každé 1-2 dny (viz podpůrné informace). Hybridní ucho vykazovalo v kultivaci dobrou strukturální integritu a zachování tvaru (obr. 2B). V průběhu času se konstrukt postupně stával více neprůhledným; to bylo nejvíce patrné po čtyřech týdnech kultivace a hrubě to odpovídá vývoji extracelulární matrix (ECM). Hrubá morfologie bionického ucha po 10 týdnech kultivace in vitro je uvedena v podpůrných informacích.

Životnost byla testována bezprostředně před a během různých fází procesu tisku. Počáteční životaschopnost buněk byla stanovena po kultivaci pomocí testu vyloučení buněk Trypanovou modří (Corning Cellgrow, Mediatech, VA) a bylo zjištěno, že je 96,4 ± 1,7 % (obr. 2C) (viz podpůrné informace). Vytištěné ucho osázené alginátovými buňkami bylo také testováno pomocí LIVE/DEAD® Viability Assay (Molecular Probes, Eugene, OR) a vykazovalo životaschopnost buněk 91,3 ± 3,9 % s homogenním rozložením chondrocytů. Tento výsledek naznačuje, že proces tisku, včetně zapouzdření a usazení buněk, nemá znatelný vliv na životaschopnost chondrocytů.

Nejenže tento přístup tisku předem nasazené hydrogelové matrice eliminuje hlavní problémy spojené s omezením hloubky nasazení a nerovnoměrným nasazením u tradičních metod nasazování předlisovaných 3D scaffoldů. Výsev chondrocytů do bioabsorbovatelné alginátové matrice a její tvarování pomocí 3D tisku lokalizuje buňky do požadované geometrie, což umožňuje produkci nové ECM v definovaných místech při kultivaci ve výživném médiu. Jak se tkáň vyvíjí, polymerní scaffold se znovu vstřebává (obr. 2D), takže nová tkáň si zachovává tvar polymeru, do kterého byly buňky nasazeny. Biologicky rozložitelné lešení poskytuje každé buňce lepší přístup k živinám a účinnější odstraňování odpadu.

Další histologické hodnocení bylo použito k porovnání morfologie chondrocytů v neochrupavce bionického ucha s morfologií nativní chrupavčité tkáně. Barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) odhalilo rovnoměrné rozložení chondrocytů v konstrukcích (obr. 2E) (viz podpůrné informace). Histologické vyšetření ušní tkáně barvením Safraninem O ukázalo relativně rovnoměrné nahromadění proteoglykanů v kultivované ušní tkáni (obr. 2F). Tyto biochemické údaje odpovídají vývoji nové chrupavky.38 Nakonec byla použita fluorescenční měření ke zjištění životaschopnosti 3D tištěné bionické ušní tkáně po 10 týdnech kultivace in vitro pomocí barvení fluorescein diacetátem (FDA) a propidium jodidem (PI). Na obrázcích 2G a 2H je zobrazena tkáň pokrývající anténu cívky a vnitřní tkáň, která je v kontaktu s elektrodou probíhající kolmo skrz tkáň. V obou případech pěstovaná chrupavka vykazovala vynikající morfologii a životaschopnost na úrovni tkáně. Je pozoruhodné, že tento přístup kultivace tkáně v přítomnosti abiotických elektronických materiálů by mohl minimalizovat imunitní reakci pěstované tkáně.

Poté jsme charakterizovali mechanické vlastnosti chrupavky v různých fázích růstu, protože vývoj ECM silně koreluje s mechanickými vlastnostmi vyvíjející se tkáně.39 Nejprve byly provedeny rozsáhlé biochemické a histologické charakteristiky. Vzorky byly odebrány z kultur obsahujících 10 % a 20 % FBS ve 2., 4., 6., 8. a 10. týdnu a zmrazeny pro měření obsahu DNA v neochrupavce a pro biochemické hodnocení ECM (viz podpůrné informace). Akumulace ECM v konstrukcích byla hodnocena kvantifikací množství dvou důležitých složek ECM: 1) hydroxyprolinu (HYP) jako markeru obsahu kolagenu a 2) sulfátovaného glykosaminoglykanu (GAG) jako markeru proteoglykanů. Do 10. týdne se obsah HYP zvýšil na 1,2 ± 0,1 μg/mg a 1,4 ± 0,2 μg/mg u kultur obsahujících 10 % a 20 % FBS (obr. 3A). Odpovídající hodnoty obsahu GAG v 10. týdnu byly 10,6 ± 0,6 μg/mg a 12,2 ± 1,0 μg/mg (obr. 3B). Toto zvýšení obsahu GAG a HYP naznačuje, že chondrocyty jsou v kultuře živé a metabolicky aktivní.

Dále byly analyzovány tahové vlastnosti testováním 3D tištěných vzorků psích kostí z chondrocytů a alginátu v různých fázích kultivace, kdy psí kosti obsahovaly stejnou hustotu buněk a identické podmínky kultivace jako ucho (viz podpůrné informace). Hodnocení mechanických vlastností ukázalo, že Youngův modul psích kostí se s časem zvýšil z 14,16 kPa na 111,46 kPa v 10. týdnu (obr. 3C). Za podobných podmínek byly testovány také psí kosti s nižší hustotou chondrocytů 20 milionů buněk/ml, aby byl pochopen vliv počáteční hustoty chondrocytů na mechanické vlastnosti pěstované tkáně. Bylo zjištěno, že v 10. týdnu měly nižší Youngův modul 73,26 kPa. Dále byla charakterizována tvrdost vypěstované chrupavčité tkáně 3D tištěného ušního boltce pomocí nanoindentačních měření. Intenze byly prováděny na různých anatomických místech ušního boltce (obr. 3D). Jak ukazuje tabulka 1, bylo zjištěno, že tyto hodnoty tvrdosti jsou poměrně rovnoměrné a pohybují se v rozmezí od 38,50 kPa do 46,80 kPa, což potvrzuje strukturální integritu vytištěného ucha40.

Pro prokázání rozšířených funkcí 3D tištěného bionického ucha jsme provedli řadu elektrických charakterizací. Nejprve byl změřen odpor antény cívky pomocí měření čtyřbodovou sondou a bylo zjištěno, že závisí na objemovém průtoku použitém pro tisk vodivého silikonu napuštěného AgNP (viz podpůrné informace). Při optimální průtokové rychlosti byl zjištěn odpor vytištěné cívky 1,31 × 10-6 Ω-m, což je pouze o dva řády více než u čistého stříbra (1,59 × 10-8 Ω-m). Dále jsme provedli experimenty s bezdrátovým příjmem rádiových frekvencí. Abychom prokázali schopnost bionického ucha přijímat signály mimo běžné slyšitelné frekvence (u člověka 20 Hz až 20 kHz), vytvořili jsme vnější připojení k elektrodám ve tvaru hlemýždě vycházejícím z indukční cívky bionického ucha (obr. 4A). Ucho bylo poté vystaveno sinusovým vlnám o frekvencích od 1 MHz do 5 GHz. Parametr S21 (dopředný přenosový koeficient) antény cívky byl analyzován pomocí síťového analyzátoru a bylo zjištěno, že přenáší signály v celém tomto rozšířeném frekvenčním spektru (obr. 4B).

Nejdůležitější je, že jako demonstrativní příklad univerzálnosti při úpravě finálního orgánu modifikací návrhu CAD jsme vytiskli doplňkové levé ucho prostým odrazem od původního modelu (viz podpůrné informace). Levý a pravý kanál stereofonního zvuku byly vystaveny levému a pravému bionickému uchu prostřednictvím vysílacích magnetických smyčkových antén s feritovými jádry (obr. 4C). Signály přijímané bionickýma ušima byly shromažďovány ze signálového výstupu dvojitých elektrod ve tvaru hlemýždě a vedeny do digitálního osciloskopu a přehrávány hlasitým reproduktorem pro sluchové a vizuální monitorování. Úryvky vysílaných a přijímaných signálů o trvání 1 ms pro pravé i levé bionické ucho jsou uvedeny na obrázku 4D a je zjištěno, že vykazují vynikající reprodukci zvukového signálu. Significantly, the played back music (Beethoven’s „Für Elise“) from the signal received by the bionic ears possessed good sound quality (Movie 2).

In summary, designer „cyborg ears“ were fabricated which are capable of receiving electromagnetic signals over an expansive frequency range from Hz to GHz. Naše strategie představuje důkaz principu propojení všestrannosti aditivních výrobních technik s koncepty montáže nanočástic a tkáňového inženýrství. Výsledkem je generování bona fide bionických orgánů, a to jak z hlediska tvaru, tak z hlediska funkce, což bylo potvrzeno referenčními hodnotami tkáňového inženýrství a elektrickými měřeními. Takové hybridy se liší buď od konstruované tkáně, nebo od planární/pružné elektroniky a nabízejí jedinečný způsob, jak dosáhnout bezproblémové integrace elektroniky s tkáněmi a vytvořit „hotové“ kyborgské orgány. A konečně, použití 3D tisku s dalšími třídami funkčních stavebních bloků v nanorozměrech, včetně polovodičových, magnetických, plazmonických a feroelektrických nanočástic, by mohlo rozšířit možnosti inženýrství bionických tkání a orgánů

.