Oční odpověď na intrakomorovou injekci
Předpokládá se, že monocytární buňky F4/80+, které jsou ústředním faktorem indukce ACAID, jsou rezidentní buňky duhovky a řasnatého tělesa, které emigrují z duhovky přes Schlemmův kanál1,6,10 do oběhu. Vzhledem k tomu, že antigen je v oku přítomen nejméně 24 hodin, mohl by mít antigen „depotní“ účinek, ačkoli část antigenu je v cirkulaci rychle po intrakamerální injekci antigenu8. Protože intrakamerální injekce antigenu vyvolává výskyt PBMC indukujících ACAID, je pravděpodobné, že tyto monocytární buňky, spíše než samotný cirkulující antigen, vyvolávají ACAID.
Intraveitreální injekce antigenu vyvolává infiltraci monocytárních buněk do sítnice jako časné stadium uveitidy.11,12 Navíc oční infekce vyvolává silný zánětlivý infiltrát v zadní nebo přední komoře.12-14 V souladu s takovým zánětem dochází k vzestupu zánětlivých cytokinů v očních tekutinách, jako je vodní humor. V souladu s tím intrakomorová injekce částicového antigenu vyvolává vzestup mRNA pro TNF-α, což naznačuje časnou zánětlivou reakci v přední komoře.14,15 Navíc u myší, které dostaly intrakomorovou injekci protilátek proti TNF-α spolu s antigenem, nedochází k systémovému potlačení hypersenzitivity opožděného typu, což naznačuje, že TNF-α je při indukci ACAID nutný. Navíc indukce ACAID v těchto studiích závisela na rozměru jehly použité pro intrakamerální injekci rozpustných proteinů a na tom, zda byl antigen v částicové nebo rozpustné formě.15 Tito autoři naznačili, že intrakamerální injekce částicových antigenů a/nebo velikost jehly použité pro intrakamerální injekce vyvolává trauma potřebné k indukci ACAID. Makrofágy a dendriformní buňky exprimující marker dendritických buněk CD11c sídlí v duhovce, řasnatém tělese a cévnatce v předním segmentu.8,10,16,17 Antigen vstříknutý do přední komory je těmito buňkami rychle vychytáván. Kromě toho se v blízkosti Schlemmova kanálu nacházejí makrofágy a dendriformní buňky17,18 , o nichž se předpokládá, že jsou místem výletu F4/80+ buněk z přední komory do cirkulace.1 Výlet rezidentních buněk duhovky, které pohlcují antigen, do cirkulace je však zpochybňován.16 Rozpustný antigen rychle opouští přední komoru cirkulací a distribuuje se podobně jako intravenózní antigen.8 Část antigenu, který opouští oko, může být v tolerogenní formě.19 Je však pravděpodobné, že intrakomorový antigen je prezentován v brzlíku a slezině takzvanými „tolerogenními antigen prezentujícími buňkami“, které s antigenem opustily oko. TGF-β ve vodném moku nebo produkovaný F4/80+ buňkami duhovky navíc indukuje supresivní fenotyp u periferních F4/80+ buněk10,20,21, což naznačuje, že k indukci supresivního fenotypu u F4/80+ buněk dochází v přední komoře.
Podobně jako působení na periferní F4/80+ buňky s vodním mokem a antigenem, inkubace buněk F4/80+ peritoneálního exsudátu s antigenem a TGF-β in vitro vnucuje buňkám supresivní fenotyp. Když jsou tyto buňky injikovány iv naivním myším, indukují antigen-specifické slezinné regulační T buňky podobně jako při intrakomorové injekci antigenu.21 ACAID je indukován velmi malým počtem takto ošetřených F4/80+ buněk1 , což naznačuje, že (nezjistitelné) buňky emigrující z duhovky a řasnatého tělesa mohou indukovat ACAID. Navíc F4/80+ buňky duhovky získané z myší, které dostaly intrakamerální injekci antigenu, indukují ACAID nebo propůjčují F4/80+ PBMC supresivní fenotyp podobný těm cirkulujícím buňkám získaným z myší, které dostaly intrakamerální injekci antigenu.9,21 Je pravděpodobné, že antigen vychytaný a zpracovaný antigen prezentujícími buňkami duhovky by mohl být přenesen na PBMC, které infiltrují přední komoru, podobně jako je antigen přenesen na B-buňky indukující ACAID ve slezině buňkami peritoneálního exsudátu ošetřenými TGF-β, které nesou antigen.22 Souhrnně tato pozorování naznačují, že události probíhající v přední komoře by mohly vyvolat supresivní fenotyp u nerezidentních zánětlivých buněk, které infiltrují přední komoru.
Na základě výše uvedených úvah jsme zkoumali možnost, že intrakamerální injekce antigenu vyvolává příliv cirkulujících PBMC do přední komory v důsledku traumatu injekce. Tyto infiltrované buňky by byly vystaveny imunosupresivnímu TGF-β ve vodném moku a rezidentním dendriformním buňkám duhovky/ciliárního tělesa, které by mohly infiltrované PBMC prezentovat injikovaný antigen. V souladu s touto hypotézou buňky, které byly rekrutovány do přední komory v důsledku poškození způsobeného injekcí, pak recirkulují a vracejí se domů do brzlíku a sleziny, kde indukují regulační T-buňky.
Za 3 hodiny po intrakomorové injekci ovalbuminu (OVA) jsme také zjistili vzestup TNF-α ve vodní komoře, jak popsali Ferguson a spol.15 . Kromě toho jsme 6 h po intrakamerální injekci pozorovali vzestup chemokinu MCP-1 ve vodném moku (obr. 1). Píchnutí jehlou bez injekce PBS vyvolalo výskyt TNF-α ve vodném moku a injekce PBS zvýšila množství TNF-α pouze pětinásobně oproti množství získanému píchnutím jehlou. TNF-α ve vodném moku rychle klesá a 12 hodin po intrakamerální injekci ovalbuminu (OVA) není detekován (údaje nejsou uvedeny). MCP-1 se ve vodném moku udržuje po delší dobu. Na rozdíl od TNF-α však vrcholové hladiny MCP-1 dosahují ve vodném moku do 12 h a zůstávají až do 16 h po intrakamerální injekci OVA (údaje nejsou uvedeny). Tento vzestup hladin TNF-α a MCP-1 ve vodní komoře po intrakamerální injekci antigenu naznačuje zahájení zánětlivé reakce v přední komoře. Navíc nedochází ke zvýšení TNF-α ve vodním moku ani k vyvolání ACAID, pokud je jehla použitá pro intrakomorovou injekci příliš malá a/nebo antigen není zánětlivý.15
Intrakomorová injekce antigenu zvyšuje TNF-a a MCP-1 ve vodním moku. Tři až šest hodin poté, co 6-8 týdnů staré naivní myší samice BALB/c dostaly iv 5 × 106 – 1 × 107 PBMC značených CFSE, byly myši anestetizovány ip injekcí ketaminu/xylazinu7 a dostaly intrakamerální injekci PBS, PBS + 50 μg OVA nebo pouze vpich 24 g jehlou. Šest hodin po podání intrakamerální injekce naivním myším byl z eutanazovaných myší odebrán vodní humor a 10 μl bylo analyzováno metodou ELISA na přítomnost TNF-α a MCP-1. Údaje představují průměr +/- S.E.M. pg zjištěných ze 4-6 opakování/skupiny ve 2-3 pokusech.
Pro zjištění, zda po intrakomorové injekci antigenu dochází k současnému přílivu zánětlivých buněk do přední komory, dostaly myši injikované iv s PBMC značenými fluorescenčním barvivem CFSE také intrakomorovou injekci. Pomocí tohoto přístupu jsme pozorovali významný příliv monocytárních buněk označených CFSE a neoznačených (hostitelských) buněk F4/80+, které exprimují chemokinové receptory CCR2 a CCR5, což se projevilo obnovením těchto buněk z duhovek myší 24 hodin poté, co myši dostaly intrakamerální injekci antigenu. U kontrol, které dostaly iv PBMC značené CFSE, ale nedostaly intrakamerální injekci antigenu, nedošlo ke zvýšení počtu těchto buněk.23 Přibližně 48 h po intrakamerální injekci antigenu se počet infiltrovaných buněk v duhovce snižuje a zvyšuje se v brzlíku a slezině (obr. 2). Toto zvýšení počtu cirkulujících monocytárních buněk v duhovce je pravděpodobně způsobeno infiltrací cirkulujících monocytů v reakci na trauma intrakamerální injekce +/- dráždivého PBS a/nebo antigenu/PBS, protože počet infiltrovaných monocytárních buněk se zvýšil, když myši dostaly intrakamerálně antigen: infiltrace PBMC značených CFSE vyvolaná pouze injekcí byla <injekce PBS < injekce TNP-BSA/PBS. Monocytární buňky rekrutované do duhovky po intrakamerální injekci antigenu exprimují jak CCR2, tak CCR5.23 Migrace buněk do duhovky vyžaduje expresi CCR2, ale ne CCR5, protože CCR2 -/- PBMC se do duhovky nevracejí, ale CCR5 -/- PBMC se do duhovky vracejí po intrakamerální injekci antigenu. Kromě toho intrakamerální injekce OVA CCR2 -/- myším neindukuje cirkulující monocytární buňky, které přenášejí potlačení hypersenzitivity opožděného typu (DTH) na OVA při iv injekci příjemcům divokého typu.23
Migrace PBMC po intrakamerální injekci. Anestezované7 myši BALB/c dostaly intrakamerální injekci trinitrofenylovaného hovězího albuminu šest hodin poté, co myši dostaly iv 5 × 106 -1 × 107 PBMC značených CFSE. Dvacet čtyři hodin po intrakamerální injekci byly myši eutanazovány inhalací CO2 a byly jim odstraněny duhovky, slezina a thymi, shromážděny a připraveny suspenze jednotlivých buněk. Buňky byly poté označeny fykocyaninem-anti-F4/80 a analyzovány průtokovou cytometrií. Procentuální nárůst CFSE, F480+ buněk byl vypočten podle vzorce:
.