Strukturní důsledky
Výsledkem modifikace mutantního proteinu obsahujícího cystein (K41C) bromoetylaminem je enzym poměrně blízký divokému typu RNázy A. Přesto je hodnota kcat/Km pro katalýzu K41S-ethylaminocysteinovou RNázou A pouze 8% hodnoty divokého typu enzymu. Rozdíl v obou proteinech musí spočívat v rozdílech mezi thioetherovou a methylenovou skupinou. Ačkoli úhly vazeb C-S-C bývají ostřejší než úhly vazeb C-CH2-C, tento rozdíl je kompenzován větší délkou vazeb C-S.3g,14 Molekulární modelování ukazuje, že primární aminoskupiny v S-ethylaminocysteinu a lysinu lze překrýt s přesností 0,1 Å. Významnějším rozdílem mezi S-ethylaminocysteinem a lysinem je jejich relativní preference spíše gauche než anti torzních úhlů.15 Antikonformace vazeb CC-CC je v modelových sloučeninách upřednostňována přibližně o 0,8 kcal/mol.16 Ve skutečnosti je průměrný torzní úhel K41 (175 ± 3)° v komplexu RNasy A s cyklickým 2′,3′-uridinvanadátem (U>v), předpokládaným analogem přechodného stavu (obr. 2). Na rozdíl od vazeb CC-CC je gauche konformace vazeb CS-CC zvýhodněna o 0,05-0,20 kcal/mol.17 Molekulární modelování ukazuje, že vazba CS-CC S-ethylaminocysteinového zbytku v poloze 41 může být v gauche konformaci, aniž by došlo k narušení struktury nativního proteinu. Proto jsou thioetherové postranní řetězce v poloze 41 pravděpodobně méně tuhé a prodloužené než alkylové postranní řetězce. Proto předpokládáme, že katalýza enzymem S-ethylaminocysteinem není tak účinná jako katalýza RNázou A divokého typu kvůli entropickým nákladům na fixaci thioetheru v konformaci all anti.
Struktura aktivního místa RNázy A vázané na uridin 2′,3′-cyklický vanadát. Struktura byla zpřesněna na 2,0 Å z rentgenových a neutronových difrakčních dat získaných z krystalů pěstovaných při pH 5,3. Boční řetězec fenylalaninu 120 a báze uracilu nejsou zobrazeny.
Katalytická účinnost závisí na délce postranního řetězce rezidua 41. V případě, že se jedná o reziduum 41, je katalytická účinnost závislá na jeho délce. Varianty RNasy A, které představují aminoskupinu na konci postranního řetězce delšího než lysin, jsou aktivnějšími katalyzátory než je nemodifikovaná RNasa A K41C. Další délka je tedy v aktivním místě tolerována. Přesto jsou enzymy, u nichž je aminoskupina v poloze 41 oddělena od hlavního řetězce 4 atomy, aktivnější než enzymy oddělené 5 atomy. Tento výsledek by mohl vyplývat z dodatečné konformační entropie nebo nepříznivých torzních úhlů delších postranních řetězců.
Není významnou výhodou, pokud může zbytek 41 darovat druhou vodíkovou vazbu. Guanidinové a acetamidinové skupiny mají potenciál interagovat současně s více než jedním kyslíkem fosforylové skupiny. Například guanidinovou skupinu využívá k vazbě fosforylových skupin protein HIV-1 Tat18 a umělé receptory.19 Dále se zdá, že u stafylokokových nukleas a ribonukleas rodiny T1 hraje roli K41 v RNase A arginin.20 Nahradili jsme K41 argininovým zbytkem a S-acetamidinovým zbytkem, což je krátký analog argininu. Hodnoty ΔΔG‡ jsou u těchto enzymů nižší než u analogických enzymů pouze s primární aminoskupinou v postranním řetězci v poloze 41. Zdá se tedy, že k účinné katalýze stačí jedna vodíková vazba. Tento výsledek je v souladu s krystalickým komplexem RNasy A s U>v (obrázek 2). Vanadylová skupina v U>v je přibližně trigonální bipyramida se dvěma nepřemosťujícími ekvatoriálními oxygeny, O1V a O3V. Kyslík O1V přijímá vodíkovou vazbu z postranního řetězce glutaminu 11, zatímco O3V přijímá vodíkovou vazbu z hlavního řetězce fenylalaninu 120. Pouze O1V je schopen přijmout vodíkovou vazbu z K41.
Mechanické důsledky. Katalytická úloha, která se nejčastěji přisuzuje K41, spočívá ve stabilizaci přebytečného záporného náboje, který se během štěpení RNA nahromadí na nepřemosťujících fosforylových oxygenech (obr. 2). K nahromadění náboje by mohlo dojít v pentakoordinovaném přechodném stavu (nebo fosforanovém meziproduktu), když 2′ hydroxylová skupina napadá fosfor na cestě k vytěsnění 5′ nukleosidu. Předpokládalo se, že k této stabilizaci dochází coulombickými interakcemi.12c,21 Nedávno však bylo také navrženo, že ke stabilizaci dochází prostřednictvím krátké silné vodíkové vazby zahrnující částečný přenos protonu z K41.22
Významnými vlastnostmi lysinového zbytku jsou jeho kladný náboj a jeho schopnost darovat vodíkové vazby. Tyto vlastnosti mají tři z pěti polosyntetických enzymů i K41R. Není jednoduché rozlišit mezi interakcí založenou pouze na Coulombových silách a interakcí založenou na vodíkových vazbách mezi dvěma nabitými druhy. Následuje nejjednodušší vysvětlení, které je v souladu s údaji v tabulce 1.
Rozdíl mezi vodíkovými vazbami a coulombickými silami není nikde více patrný než při srovnání enzymu S-ethyltrimethylaminocysteinu, který má terminální kladný náboj, ale nemá schopnost darovat vodíkovou vazbu, a enzymu S-acetamidocysteinu, který má amid N-H pro potenciální darování vodíkové vazby, ale nemá kladný náboj. Nízká katalytická aktivita enzymu S-ethyltrimethylaminocysteinu je silným argumentem proti účinnosti coulombických sil při stabilizaci přechodného stavu. Za stejných podmínek se energie interakce náboj-náboj zmenšuje pouze jako nepřímá úměra vzdálenosti. Zvýšená vzdálenost mezi kladným nábojem na postranním řetězci a fosforyloxygeny ve srovnání se vzdáleností v enzymu S-ethylaminocysteinu je vynucena methylovými skupinami. Přesto je nepravděpodobné, že by tato vzdálenost byla dostatečně velká, aby způsobila pozorované >103násobné snížení kcat/Km, zejména proto, že tři methylové skupiny by mohly být snadno umístěny v blízkosti fosforyloxygenů (obr. 2).
Očekává se, že síla vodíkové vazby bude nepřímo úměrná pKa darovaného protonu, neboť vodíková vazba zahrnuje určitý rozsah přenosu protonu.23 Jak ukazuje tabulka 1, zvýšení pKa skutečně odpovídá snížení ΔΔG‡ u polosyntetických enzymů se srovnatelnou délkou postranních řetězců. U těch polosyntetických enzymů, u nichž je délka postranního řetězce srovnatelná s lysinem, je však korelace nelineární. Tento nedostatek linearity může být způsoben tím, že pKa každého postranního řetězce závisí na jeho konkrétním prostředí v nativním proteinu. Bylo totiž zjištěno, že pKa Lys41 je 9,0,24 a nikoliv 10,6, jak je uvedeno pro butylamoniový ion v tabulce 1. Různé postranní řetězce mohou být ovlivněny v různé míře. Dalším, možná významnějším zdrojem nelinearity je skutečnost, že nabité druhy mají tendenci účastnit se silnějších vodíkových vazeb než druhy nenabité. Tento jev byl pozorován u proteinů25 i malých molekul, včetně aminů.26 Srovnání polosyntetických enzymů s postranními řetězci, které jsou isosterické, ale liší se formálním nábojem, by mělo takovou tendenci odhalit. Například u enzymů S-acetamidinocystein a S-acetamidocystein jsou postranní řetězce v poloze 41 identické s výjimkou jednoho ze dvou heteroatomů připojených ke koncovému uhlíku. Přesto je rozdíl ve schopnosti těchto dvou isologických postranních řetězců vázat se na přechodný stav větší, než se očekává pouze z jejich kyselosti. V tomto případě je vodíková vazba darovaná nabitým acetamidinem o 4 kcal/mol silnější než vazba darovaná nenabitým amidem. Tato hodnota je v souladu s jinými údaji o relativní síle nabitých a nenabitých vodíkových vazeb v interakcích protein-ligand.21 Nakonec stojí za zmínku, že ačkoli postranní řetězec S-acetamidu postrádá formální náboj a má relativně vysoké pKa, přesto přispívá (i když skromně) ke katalýze. Tento výsledek poskytuje další důkaz o významu vodíkové vazby darované zbytkem 41 pro katalýzu
.