ORIGINÁLNÍ PRÁCE
Popis rozsáhlého výskytu aseptické meningitidy způsobené echovirem 30 ve státě Rio de Janeiro, Brazílie
Vitor Laerte Pinto JuniorI; Maria Cristina RebeloII; Eliane Veiga da CostaIII; Edson Elias da SilvaIII; Márcio Neves BóiaIV
IDiretoria Regional de Brasília, Fiocruz, Brasília, DF
IILaboratório de Referência Estadual para Meningites, Instituto Estadual de Infectologia São Sebastião, Rio de Janeiro, RJ
IIILaboratório de Enterovirus, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ
IVPós-graduação em Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ; Brazílie
Adresa pro korespondenci
ABSTRACT
Echovirus 30 patří do rodu Enterovirus a je široce spojován s propuknutím aseptické meningitidy (AM). V Brazílii byly epidemie způsobené tímto sérotypem hlášeny v několika státech, ale v Rio de Janeiru se před touto studií podílel pouze na sporadických epizodách. Retrospektivně jsme shromáždili údaje z tabulek hlášení AM a databáze izolací enterovirů ze Státního zdravotního úřadu Rio de Janeiro (RJSHD) a referenční laboratoře pro enteroviry v roce 2005. V březnu, dubnu a květnu byla zjištěna epidemie AM spojená s vysokou mírou izolace buněčných kultur pro echovirus 30 (17,4 %). Více byly postiženy děti mužského pohlaví ve věku od 1 do 9 let. Z 22 pacientů s potvrzeným onemocněním echovirem 30 byly klinické informace k dispozici u osmi; nejčastějšími projevy byly horečka, bolest hlavy a zvracení. Analýza mozkomíšního moku ukázala typický obraz virové infekce s mediánem buněčnosti 100 buněk/mm3 a převahou mononukleárních buněk v 64,7 % případů. Medián hladin bílkovin a glukózy byl 49 mg/dl a 56,5 mg/dl. Úmrtnost byla nulová. Navzdory benignímu průběhu a nedostatku možností léčby má sledování aseptické meningitidy zásadní význam pro včasnou identifikaci původců epidemií, což pomáhá vyhnout se dodatečnému testování a nevhodnému použití antimikrobiálních látek.
Klíčová slova: Aseptická meningitida, enteroviry, echoviry, mozkomíšní mok.
Aseptická meningitida (AM) je syndrom charakterizovaný akutním nástupem horečky a meningismu spolu s analýzou mozkomíšního moku (CSF), který obvykle vykazuje převahu mononukleárních buněk a negativní bakteriologické vyšetření . V současné době se s rozšířeným používáním virových vakcín (zejména proti dětské obrně, příušnicím a spalničkám) staly hlavní příčinou infekční AM enteroviry jiné než proti dětské obrně, které jsou zodpovědné za sporadické i epidemické případy . Diagnostika nepoliových enterovirů je v Brazílii omezena na výzkumná centra, v nichž se klinické vzorky pro účely epidemiologického sledování vyšetřují pouze pomocí virové kultivace nebo PCR.
Echovirus 30 patří do rodu Enterovirus a je spojován především s případy AM s epidemickým průběhem. Výskyt tohoto sérotypu se zvyšuje a v posledních letech patří mezi nejčastěji detekované enteroviry . V Brazílii byl již hlášen jako původce ohnisek AM v několika státech (Rio Grande do Sul, Paraná, São Paulo, Pernambuco a Pará), přičemž častěji postihuje starší děti a dospělé a má nízký poměr úmrtnosti.
Mezi březnem a květnem 2005 se v metropolitní oblasti státu Rio de Janeiro vyskytlo ohnisko AM současně s nadstandardním počtem potvrzených izolací echoviru 30 z mozkomíšního moku a výkalů pacientů s tímto syndromem. V této studii jsou uvedeny klinické, laboratorní a epidemiologické údaje.
Materiál a metody
Předměty
V této retrospektivní studii byly přezkoumány a analyzovány epidemiologické a demografické údaje 573 oznámených případů AM v roce 2005 z databáze poradního výboru pro meningitidu Státního zdravotního úřadu v Rio de Janeiru (RJSHD). Za AM byly považovány všechny případy s následujícími kritérii : pacienti jakéhokoli věku s příznaky akutní meningitidy (horečka, bolest hlavy, zvracení, nuchální rigidita a podrážděnost nebo letargie) spolu s CSF profilem vykazujícím počet bílých krvinek > 10 buněk/mm3 a negativní bakteriologické vyšetření.
Klinické údaje pacientůasistovaných v Instituto Estadual de Infectologia São Sebastião (IEISS), Rio de Janeiro, s potvrzenou infekcí echovirem 30 byly získány z karet pacientů a z databáze referenční laboratoře pro enteroviry. Byly shromážděny údaje o věku, pohlaví, příznacích a symptomech, komorbiditách, počátečních výsledcích analýzy mozkomíšního moku a klinickém výsledku v době propuštění z nemocnice.
Analýza klinických vzorků CSF
Všichni pacienti podstoupili lumbální punkci za účelem vyhodnocení meningitidy; žádný pacient nebyl podroben tomuto zákroku pouze za účelem odběru vzorků pro studii. CSF byl analyzován na obsah buněk, hladinu bílkovin a glukózy a bakteriologické testy pomocí rutinních laboratorních metod.
Izolace a identifikace virů
Všechny vzorky (CSF a fekální extrakty od pacientů vyšetřujících AM) byly v objemech 0,2 ml naočkovány na buněčné kultury za účelem izolace virů. Kontinuální buněčné linie RD (lidský rhabdomyosarkom) a HEp2 (lidský karcinom hrtanu) byly vybrány pro svou schopnost podporovat replikaci většiny sérotypů enterovirů . Zkumavky byly udržovány při 36 ºC po dobu sedmi dnů, podrobeny slepé pasáži a udržovány při 36 ºC po dalších sedm dnů. Buněčné kultury vykazující cytopatický efekt (CPE) byly uchovávány při -20 °C až do další identifikace.
Specifikované vzorky vykazující Enterovirus charakteristický CPE byly podrobeny extrakci RNA pomocí Trizol LS ® (Life Technologies) podle protokolu výrobce. Byla provedena specifická Enterovirus group-RT-polymerázová řetězová reakce s použitím páru primerů (R – 222 a F – 292), který amplifikuje 357 bp fragment uvnitř genu kódujícího hlavní kapsidový protein VP1, jak popsali Oberste et al.. Po 30 cyklech denaturace při 95 ºC / 2“, žíhání při 42 ºC / 4“ a extenze při 60 ºC / 3“ v termocykleru GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) byly produkty analyzovány elektroforézou v 1% agarózovém gelu obsahujícím ethidium bromid (0,5 mg/ml) s použitím 50 bp žebříku (Invitrogen) jako markeru molekulové hmotnosti a vizualizovány v transiluminátoru (UV světlo). Specifické produkty byly přečištěny na gelu pomocí soupravy QIAquick® Gel Extraction“ (Qiagen) a poté kvantifikovány porovnáním, v 1% agarózovém gelu, se značkou molekulové hmotnosti Low DNA Mass Ladder (Invitrogen).
Reakce sekvenování cyklů byly provedeny pomocí reakce ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied-Biosystems) v termocykleru GeneAmp® s cykly 1“ při 95ºC, 3“ při 42ºC a 3“ při 60ºC. Sekvenční produkty získané pomocí obou primerů (222 a 292) v jednotlivých reakcích byly přečištěny srážením izopropylalkoholem a analyzovány pomocí genetického analyzátoru ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Sérotypy enterovirů byly získány porovnáním sekvencí se sekvencemi umístěnými v GenBank pomocí programu Blast .
Konstrukce endemického diagramu a statistická analýza
Všechna data z karet pacientů a z RJSHD byla vložena a analyzována pomocí statistického softwaru SPSS, verze 13.0 pro Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Byly provedeny nástroje popisné statistiky (průměr, medián a směrodatná odchylka). Roční incidence aseptické meningitidy byla hodnocena s použitím jmenovatele populačních údajů převzatých z odhadu Brazilského institutu pro geografii a statistiku (IBGE) z roku 2007.
Pro sestavení endemického diagramu AM v Rio de Janeiru byly analyzovány oznámené případy AM v letech 2000 až 2004. Byl získán průměr a směrodatná odchylka rozdělení četnosti případů pro každý měsíc roku a poté byl ke každému měsíčnímu průměru přičten jeho SD vynásobený koeficientem 1,96 (z normálního rozdělení s 95% citlivostí) za účelem sestrojení horní hranice diagramu, která představovala epidemický práh.
Etika
Tato studie byla projektována podle brazilských zákonů o výzkumu zahrnujícím lidské bytosti a byla schválena etickou komisí Evandro Chagas Clinical Research Institute, FIOCRUZ, Rio de Janeiro.
Výsledky
Demografické a epidemiologické údaje
V průběhu roku 2005 bylo ve státě Rio de Janeiro nahlášeno celkem 573 případů aseptické meningitidy; incidence činila 3,71 případů/100 000 obyvatel. Údaje o rozložení podle věku a pohlaví jsou uvedeny v tabulce 1. Většina případů se vyskytla u dětí ve věku od jednoho do devíti let; v této věkové skupině tvořili muži 60,7 % případů, zatímco ženy 39,3 %. Nad touto věkovou skupinou nebyla převaha pohlaví pozorována.
Případy AM se vyskytovaly po celé sledované období se zaměřením na metropolitní oblast Rio de Janeira. Rozložení četnosti případů AM ukazuje epidemické období mezi měsíci březnem a květnem (obrázek 1). Počáteční období epidemie začalo v březnu s 99 případy (očekávaných 36 případů), vrchol nastal v dubnu se 122 případy (očekávaných 38) a ukončení v květnu s 58 případy (očekávaných 39). V Brazílii toto období odpovídá konci léta a začátku podzimu.
Izolace a identifikace enterovirů
V průběhu roku 2005 bylo na přítomnost enterovirů analyzováno 171 vzorků mozkomíšního moku a stolice od případů AM, počet vzorků zaslaných k izolaci viru se v tomto období pohyboval od žádného do 85 za měsíc; ze 48 (28.0 % z celkového počtu zaslaných vzorků) izolovaných nepoliových enterovirů byl echovirus 30 identifikován v 17 CSF a 5 výkalech (45,8 % pozitivních vzorků). K identifikaci tohoto původce došlo výhradně v období epidemie a jeho průměrná míra izolace činila 17,4 % (22/ 126). V ostatních 26 (54,2 %) vzorcích mozkomíšního moku byl mimo období epidemie zjištěn nesekvenovaný nepoliový enterovirus (obrázek 2).
Klinické aspekty
Z 22 pacientů s potvrzeným onemocněním echovirem 30 byly klinické údaje k dispozici u osmi a výsledky analýzy mozkomíšního moku byly u všech sedmnácti vzorků mozkomíšního moku. Převažovali muži (54,5 %), jejichž věk se pohyboval od 2 do 36 let (medián 4,5 roku). Nejčastějšími projevy byly bolest hlavy, 100,0 % (8/8); horečka, 87,5 % (7/8); zvracení, 62,5 % (5/ 8); a nuchální rigidita, 52,5 % (5/8). Analýza mozkomíšního moku prokázala pleocytózu s mediánem 100 leukocytů/mm3 (32 až 325 leukocytů/mm3) s převahou mononukleárních buněk v 64,7 % (11/17). Hladina bílkovin byla mírně zvýšená s mediánem 49 mg/dl (28 až 84 mg/dl) a mediánem hladiny glukózy 56,5 mg/dl (43 až 92 mg/dl). Míra fatality případů byla nulová.
Diskuse
Naše studie informuje o první epidemii související s echovirem 30 ve státě Rio de Janeiro, ke které došlo v roce 2005, a ukazuje její klinické, laboratorní a epidemiologické aspekty. Tato epidemie začala v březnu s progresí do konce dubna a návratem na endemickou úroveň v červnu.
Aseptická meningitida je syndrom s širokým seznamem možných etiologických agens a v Brazílii je značně podhodnocená; v našich podmínkách spočívají obtíže při provádění etiologické diagnostiky v klinické praxi ve vysokých nákladech na testování a v potřebných technických znalostech. Nicméně několik studií, které se v posledních 30 letech zabývaly etiologií AM v různých oblastech světa, zjistilo, že za většinu případů, jejichž četnost se pohybuje od 52 % do 92 %, nejsou zodpovědné enteroviry.
V naší studii vykazovalo rozložení případů AM podle pohlaví a věku podobný vzorec popsaný v jiných studiích o onemocnění centrálního nervového systému způsobeném enteroviry, s převahou mužů a postižením dětí od 1 do 9 let. Důvod převahy mužů není znám, ale předpokládá se, že toto pohlaví je ve větší míře vystaveno rizikovým faktorům podílejícím se na přenosu .
Uvádí se, že případy AM v oblastech s mírným podnebím mají sezónní distribuci s vrcholem výskytu v létě, což pravděpodobně souvisí s obdobím školních prázdnin a rekreačních aktivit . V tropických a subtropických oblastech mají případy AM rovnoměrné rozložení v průběhu roku, jak ukazuje endemický diagram sestrojený v naší studii. V předchozí studii dos Santos et al. ukázali podobný vzorec, ale byla zde tendence k výskytu případů v obdobích vyšších teplot.
Echovirus 30 má epidemický charakter výskytu a AM je jeho nejčastěji hlášeným syndromem . Tento sérotyp byl v předchozích letech zodpovědný za propuknutí AM v několika brazilských státech (Paraná, Rio Grande do Sul, Pernambuco e Pará), vždy s benigním klinickým průběhem a výsledkem . V jiných oblastech světa je echovirus 30 již nejčastěji izolovaným sérotypem z mozkomíšního moku pacientů s AM a údaje ze sledování ve Spojených státech naznačují, že echovirus 30 způsobil rozsáhlé epidemie, které byly přerušovány obdobími klidu . Molekulárně epidemiologické studie provedené během epidemií prokázaly pět různých genotypů echoviru 30, což je navrhované vysvětlení tohoto epidemiologického chování .
Ve státě Rio de Janeiro je cirkulace echoviru 30 ve spojení se sporadickými případy AM hlášena od roku 2001 . V roce 2005 byl mezi měsíci březnem a květnem pozorován nárůst oznámených případů AM nad úroveň epidemie pro toto období. Současně byl echovirus 30 izolován z klinických vzorků zaslaných do laboratoře pro enteroviry v podílu daleko přesahujícím (17,4 %) podíl považovaný za normální pro sporadické případy, což je méně než 10 %. Tato vysoká míra izolace byla podobná té, která byla popsána u epidemie spojené s echovirem 30 na Tchaj-wanu v roce 2001 . Tyto skutečnosti potvrzují výskyt ohniska způsobeného echovirem 30 poprvé ve státě.
Klinicky jsme pozorovali typický syndrom meningitidy s náhlým nástupem horečky a bolestí hlavy jako nejčastějšími projevy. Úmrtnost u pacientů s potvrzeným onemocněním echovirem 30 byla nulová, což svědčí o benigním průběhu onemocnění. Přesto by bylo nutné provést prospektivní neurologické vyšetření těchto případů, aby se vyloučily dlouhodobé neurologické následky.
Údaje o sledování uvedené v této studii představují všechny oznámené případy, včetně těch, které pravděpodobně nebyly způsobeny enterovirem, protože jiní původci nejsou v naší zemi neobvyklí, jako například Leptospira sp., virus dengue, Bartonella sp. a Herpes simplex virus . Epidemiologické údaje o etiologických původcích AM v Rio de Janeiru jsou z velké části neznámé, takže skutečné rozšíření účasti enterovirů na případech AM v našich podmínkách je nevyřešenou otázkou. Dalším důležitým aspektem, který se nám v tomto ohnisku nepodařilo popsat, byl způsob přenosu onemocnění; enteroviry se v naprosté většině případů získávají fekálně-orální kontaminací, která by mohla souviset s kontaktem se společným zdrojem, jako jsou potraviny a voda, nebo kontaktem mezi osobami . Oba mechanismy mohly být zodpovědné za šíření případů v naší studii, nicméně metodická omezení daná retrospektivním designem tuto analýzu neumožnila.
Echovirus 30 je spojován s epidemiemi aseptické meningitidy s benigním průběhem; očekává se zvýšení frekvence tohoto sérotypu v Brazílii projevující se velkými epidemiemi AM mezi obdobími klidu. Zintenzivnění a zlepšení dohledu nad AM má zásadní význam pro včasnou identifikaci původců epidemií, což pomáhá vyhnout se dodatečnému testování a zbytečnému používání antimikrobiálních látek. Ke zjištění dalších původců AM v Brazílii a k objasnění mechanismů jejich přenosu je třeba provést další studie.
Poděkování
Marii de Fátima Calderaro z RJSDH za poskytnutí údajů z epidemiologického sledování.
1. Connolly KJ, Hammer SM. Syndrom akutní aseptické meningitidy. Infect Dis Clin North Am 1990;4(4):599-622.
2. Lee BE, Davies HD. Aseptická meningitida. Curr Opin Infect Dis 2007;20(3):272-7.
3. Khetsuriani N, Lamonte-Fowlkes A, Oberst S, Pallansch MA. Enterovirus surveillance-United States, 1970-2005. MMWR Surveill Summ 2006;55(8):1-20.
4. Dos Santos GP, Skraba I, Oliveira D, Lima AA, de Melo MM, Kmetzsch CI, et al. Enterovirus meningitis in Brazil, 1998-2003. J Med Virol 2006;78(1):98-104.
5. Gomes Mde L, Ferreira LL, Gomes RH, Lamarao LM, da Silveira E, Rodrigues Lda S, et al. RT-PCR for confirmation of echovirus 30 isolated in Belem, Brazil. Braz J Infect Dis 2007;11(4):403-6.
6. Brasil, Ministério da Saúde. Meningitidy. In: Vnitřní lékařství: Guia de vigilância epidemiológica. Brasília; 2005. s. 541-569.
7. Dagan R, Jenista JA, Prather SL, Powell KR, Menegus MA. Viremie u hospitalizovaných dětí s enterovirovými infekcemi. J Pediatr 1985;106(3):397-401.
8. Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR, Flemister MR, Brown BA, Pallansch MA. Typizace lidských enterovirů pomocí částečného sekvenování VP1. J Clin Microbiol 1999;37(5):1288-93.
9. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Základní nástroj pro lokální vyhledávání zarovnání. J Mol Biol 1990;215(3):403-10.
10. Berlin LE, Rorabaugh ML, Heldrich F, Roberts K, Doran T, Modlin JF. Aseptická meningitida u kojenců <ve věku 2 let: diagnostika a etiologie. J Infect Dis 1993;168(4):888-92.
11. Mendoza LP, Bronzoni RV, Takayanagui OM, Aquino VH, Figueiredo LT. Virové infekce centrálního nervového systému v Brazílii. J Infect 2007;54(6):589-96.
12. Nery-Guimaraes R, Bittencourt LC, Pastor MV. . Rev Saude Publica 1981;15(4):379-94 .
13. Rotbart HA. Virová meningitida. Semin Neurol 2000;20(3):277-92. (14).
14. Centrum pro kontrolu a prevenci nemocí. Outbreaks of aseptic meningitis associated with echovirus 9 and 30 and preliminary surveillance reports on enterovirus activity-United States, 2003. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2003;52(32):761-4.
15. Centrum pro kontrolu a prevenci nemocí. Enterovirus surveillance-United States, 1997-1999. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2000;49(40):913-6.
16. Antona D, Leveque N, Chomel JJ, Dubrou S, Levy-Bruhl D, Lina B. Surveillance enterovirů ve Francii, 2000-2004. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007;26(6):403-412.
17. Oberste MS, Maher K, Kennett ML, Campbell JJ, Carpenter MS, Schnurr D, et al. Molecular epidemiology and genetic diversity of echovirus type 30 (E30): genotypes correlate with temporal dynamics of E30 isolation. J Clin Microbiol 1999;37(12):3928-33.
18. Wang JR, Tsai HP, Huang SW, Kuo PH, Kiang D, Liu CC. Laboratorní diagnostika a genetická analýza epidemie aseptické meningitidy spojené s echovirem 30 na Tchaj-wanu v roce 2001. J Clin Microbiol 2002;40(12):4439-44.
19. Silva HR, Tavares-Neto J, Bina JC, Meyer R. . Rev Soc Bras Med Trop 2003;36(2):227-33 .
20. Rotbart HA. Enterovirové infekce centrálního nervového systému. Clin Infect Dis 1995;20(4):971-81.