Shrnutí
Sacharózová hustotní gradientová ultracentrifugace je výkonná technika pro frakcionaci makromolekul, jako jsou DNA, RNA a proteiny. Za tímto účelem se vzorek obsahující směs makromolekul různé velikosti vrství na povrch gradientu, jehož hustota se lineárně zvyšuje shora dolů. Během odstřeďování sedimentují makromolekuly různých velikostí přes gradient různou rychlostí. Rychlost sedimentace závisí kromě odstředivé síly také na velikosti, tvaru a hustotě makromolekul a na hustotě a viskozitě gradientu. Tímto způsobem se makromolekuly rozdělují podle velikosti, přičemž větší sedimentují směrem dolů a lehčí zůstávají blízko horní části gradientu. Metoda se osvědčila zejména při frakcionaci velkých molekul DNA podle velikosti a byla hojně využívána k měření indukce a opravy zlomů DNA po vystavení klastogenním faktorům. Zde popisujeme úpravu této metody, kterou lze použít při analýze nově syntetizované DNA vzniklé během replikace DNA. Pomocí analýzy velikosti vznikající DNA v alkalických sacharózových gradientech lze měřit změny v replikační aktivitě po vystavení buněk faktorům poškozujícím DNA. Metoda je obzvláště užitečná, protože umožňuje rozlišit účinky zprostředkované poškozením DNA na prodlužování řetězce oproti iniciaci replikonu, což je nezbytné pro hloubkovou analýzu kontrolního bodu v rámci fáze S. Tato schopnost činí techniku jedinečnou a ospravedlňuje její poněkud pracnou povahu.