Koronavirové onemocnění 2019 (COVID-19) je infekční onemocnění, které způsobilo celosvětovou pandemii s více než 36 miliony nakažených lidí z přibližně 200 zemí nebo území, s více než 1 milionem úmrtí k dnešnímu dni (Světová zdravotnická organizace (WHO), 2020). Předpokládá se, že původce COVID-19, koronavirus těžkého akutního respiračního syndromu 2 (SARS-CoV-2), pochází od netopýrů, protože dosud nejbližším geneticky příbuzným je netopýří koronavirus RaTG13 (Andersen et al., 2020; Zhou et al., 2020). Několik druhů bylo studováno s cílem určit jejich potenciální roli jako mezihostitelů (Shi et al., 2020). Zvířecí modely, které by rekapitulovaly onemocnění podobné COVID-19, jsou navíc považovány za hlavní směr výzkumu a jsou potřebné pro vývoj terapeutických léčiv a profylaktických látek.
Kromě několika modelových studií navrhujících potenciální druhy zvířat vnímavé k SARS-CoV-2 (Damas et al., 2020; Qiu et al., 2020; Veljkovic et al., 2020) již četné experimentální infekce prokázaly širokou škálu vnímavých zvířat. Konkrétně netopýr egyptský, fretka, zlatý syrský křeček, kočka, myši exprimující humanizovaný angiotenzin konvertující enzym 2 (ACE2), myši BALB/c (s použitím mutovaného SARS-CoV-2 několika pasážemi buněčné kultury) a některé druhy primátů, které nejsou lidmi, jsou k virové infekci tolerantní a vyvíjí se u nich subklinické až mírné až středně těžké respirační onemocnění (Bao et al., 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). Z experimentálního hlediska je vnímavost psů vůči SARS-CoV-2 omezená, protože očkovaná zvířata mohou částečně sérokonvertovat (Shi et al., 2020). Naproti tomu intranazální inokulace kuřat, kachen a prasat nevedla k žádnému průkazu infekce (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020).
Vepř se běžně používá ve výzkumu kvůli existujícím podobnostem s člověkem z hlediska anatomie, genetiky, fyziologie a také imunologie. Pokusy na prasatech totiž pravděpodobně lépe předpovídají terapeutickou a preventivní léčbu u lidí než pokusy na hlodavcích (Meurens et al., 2012). Jelikož však prasata nejsou při intranazální inokulaci vnímavá k infekci virem SARS-CoV-2 (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), zaslouží si prozkoumat možnost vyvinout model infekce prasat tímto virem s využitím jiných potenciálních cest inokulace. Hlavním důvodem pro testování prasat je, že receptor ACE2 tohoto druhu je funkční buď transfekcí prasečího ACE2 do HeLa buněk (které konstitutivně neexprimují lidský ACE2) (Zhou et al., 2020), nebo že pseudočástice s proteinem S viru SARS-CoV-2 jsou schopny infikovat prasečí ledvinové buňky (Letko et al., 2020). Kromě toho je protein ACE2 exprimován ve všech hlavních tkáních prasat, jak bylo zjištěno pomocí imunohistochemie (Xiao et al., 2020). V důsledku toho jsme za účelem vytvoření předpokládaného modelu prasat COVID-19 zkoumali vliv různých přirozených a nepřirozených cest inokulace SARS-CoV-2 u prasat domácích (Sus scrofa domesticus).
Pro tento účel byly vybrány čtyři skupiny pěti 5 až 6týdenních konvenčních selat (Landrace × Large White), které byly inokulovány různými cestami: intranazálně (IN, 1,5 ml/nostril; celkový objem 3 ml), intratracheálně (IT, 3 ml), jak bylo popsáno dříve (Garcia-Morante et al..), 2016), intramuskulárně (IM, 1 ml do každé strany krčních svalů; celkový objem 2 ml) nebo intravenózně (IV, 2 ml) s konečnou dávkou 105,8 infekční dávky tkáňové kultury (TCID50) izolátu SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_510689) na každé zvíře. Skupiny IT a IV byly před inokulací anestezovány pomocí 10 mg/kg ketaminu a 0,8 mg/kg xylazinu. Pasáž 2 SARS-CoV-2 byla rozmnožována a titrována v buňkách Vero E6 (ATCC CRL-1586) podle stejného protokolu jako u jiných koronavirů (Rodon et al., 2019). Jako negativní kontroly byla použita dvě další prasata.
Všechna zvířata byla séropozitivní vůči prasečímu respiračnímu koronaviru, jak bylo stanoveno komerčním testem ELISA (INgezim Corona Diferencial 2.0 ). Vzhledem k tomu, že nebyla popsána žádná zkřížená reaktivita protilátek mezi alfa- a beta-koronaviry (Okba et al., 2020), byla zvířata ponechána ve studii. Počáteční reaktivita proti PRCV byla očekávána, protože tento virus je v evropských chovech prasat všudypřítomný (Saif et al., 2012; Vidal et al., 2019).
Pokusy na zvířatech byly schváleny institucionálním výborem pro dobré životní podmínky zvířat Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) a etickou komisí pro pokusy na zvířatech katalánské autonomní vlády a prováděli je certifikovaní pracovníci. Pokusy se SARS-CoV-2 byly prováděny v zařízeních třetí úrovně biologické bezpečnosti (BSL-3) v oddělení biologické ochrany IRTA-CReSA (Barcelona, Španělsko).
Dva a 22 dní po očkování (dpi) byla utracena dvě, resp. tři zvířata/skupinu (IT, IM a IV). Vzhledem k tomu, že již bylo prokázáno, že IN inokulace není účinná pro vyvolání infekce SARS-CoV-2 (Shi et al., 2020), byla prasata inokulovaná touto cestou utracena ve dnech 1 a 2 pi za účelem posouzení důkazů možné přechodné časné infekce v tkáních. Negativní kontrolní zvířata byla utracena před zahájením pokusu. Vzorky byly odebrány a zpracovány podle předchozího popisu (Vergara-Alert et al., 2017). Stručně řečeno, u všech zvířat byly provedeny kompletní nekropsie. Bylo odebráno několik tkání (frontální, mediální a kaudální turbináty; proximální, mediální a distální trachea; velký a malý bronchus, levá kraniální, mediodorzální a kaudální část plic; ledviny; játra; srdce a slezina), které byly fixovány ponořením do 10% neutrálně pufrovaného formalínu, zalité do parafínu a rozřezány na 3 µm pro přípravu preparátů. Histologické preparáty byly obarveny hematoxylinem a eozinem (HE) k posouzení případných mikroskopických změn. Kromě toho byly stejné tkáně plus ileum, krční lymfatická uzlina (LN), mediastinální LN, mezenterická LN, čichový bulbus, tonzily, thymus, příušní slinná žláza, nadledviny, pankreas, mozkový kmen, oční víčka a kostní dřeň odebrány také v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) ve zkumavkách s kuličkami k provedení detekce genu SARS-CoV-2 upE pomocí RT-qPCR (Corman et al., 2020). Byly také odebrány výtěry z nosu a konečníku (denně během prvního týdne a ve 14 a 22 dpi) pro jejich analýzu na přítomnost virové RNA pomocí výše zmíněné RT-qPCR. Vzorky séra odebrané ve dnech 0, 14 a 22 pi byly testovány na přítomnost protilátek proti hrotu SARS-CoV-2 S1 + S2 a nukleokapsidovým (N) proteinům pomocí interních testů ELISA (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020). Také test neutralizace viru byl proveden podle předchozího protokolu s malou modifikací (Rodon et al., 2020), sériová ředění sér a SARS-CoV-2 byla inkubována 1 h při 37 °C před provedením testu na destičce.
Všechna zvířata byla denně sledována, ale žádné z nich nevykazovalo po inokulaci SARS-CoV-2 klinické příznaky. U žádného ze studovaných zvířat ze všech inokulačních i kontrolních skupin nebyly rovněž zjištěny žádné hrubé ani mikroskopické léze, které by bylo možné připsat infekci SARS-CoV-2 (údaje nejsou uvedeny).
U žádného z prasat nedošlo k nosnímu ani rektálnímu vylučování virové RNA. Proximální trachea jednoho zvířete inokulovaného IN byla v 1 dpi pozitivní na virovou RNA (Cq = 24,36). Zbývající tkáně tohoto zvířete a ostatních prasat měly negativní výsledek RT-qPCR (limit detekce qPCR 38,6 cyklů).
Ve 14. a 22. dpi bylo možné u všech zvířat ze skupin IM a IV detekovat nízké hladiny protilátek namířených proti proteinu Spike (obrázek 1a). Navíc tato prasata vykazovala ve 22 dpi také neutralizační titry protilátek (v rozmezí od 74 do 317 titrů SNT50 vzájemného ředění) (obrázek 1b). Nízké hladiny protilátek zaměřených proti proteinu N byly zjištěny také u jednoho ze tří zvířat inokulovaných IM a u všech zvířat inokulovaných IV na konci pokusu (údaje nejsou uvedeny). Důležité je, že jedno jediné zvíře ze skupiny IT nevykazovalo protilátky proti S, ale mělo protilátky proti proteinu N a také neutralizační titry (SNT50 titr vzájemného ředění 29) v den 0 pi, což by mohlo naznačovat potenciální zkříženou reakci s jiným koronavirem infikujícím prasata. Za zmínku stojí, že tyto protilátky proti N proteinu do ukončení pokusu poklesly, což naznačuje, že byly mateřského původu. Kromě toho toto zvíře nevykazovalo seroneutralizační protilátky ve 22 dpi (obrázek 1b).
Předložené údaje naznačují, že SARS-CoV-2 nebyl schopen infikovat prasata žádnou z testovaných cest, a to IN, IT, IM a IV. Naše úsilí tedy potvrzuje dřívější experimenty naznačující nedostatečnou vnímavost prasat k infekci (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), ačkoli je lze využít k posouzení imunogenicity připravovaných kandidátů na vakcíny.
Důležité je, že současná studie přesahuje rámec ostatních studií se SARS-CoV-2 a prasaty, protože jsme testovali širší počet způsobů očkování. Žádná z nich však nevedla k produktivní infekci selat. Významným výsledkem této studie byl průkaz sérokonverze proti glykoproteinu Spike ve dnech 14 a 22 pi a přítomnost neutralizačních protilátek v den 22 pi u prasat inokulovaných parenterální cestou (IM a IV). Vzhledem ke krátkému trvání pokusu (22 dní) tato sérokonverze zdůrazňuje potenciální zájem o použití prasat ve studiích imunogenicity SARS-CoV-2. Ve skutečnosti je zájem o prase jako o vhodný zvířecí model pro imunologii, stejně jako fyziologii, farmakologii a chirurgii, použitelný v humánní medicíně, všeobecně uznáván (Rothkötter, 2009).
Závěrem lze říci, že tato studie potvrzuje, že selata nejsou vhodným zvířecím modelem pro COVID-19, ale jejich potenciální užitečnost jako modelu imunogenicity v preklinických studiích vývoje vakcín si zaslouží další zkoumání.
.