Protože přesná kvantifikace proteinů je nezbytná pro všechny experimenty týkající se studia proteinů, byly vyvinuty různé metody měření koncentrace proteinů v daném testu. Některé z tradičnějších metod kvantifikace celkových bílkovin zahrnují měření UV absorbance při 280 nm (A280), Bicinchoninovou kyselinu (BCA) a Bradfordův test a další alternativní metody, jako jsou Lowryho a další nové testy.
Protože bílkoviny absorbují světlo při specifické vlnové délce, lze měření získat pomocí spektrofotometru. Konkrétně aminokyseliny tyrosin a tryptofan mají velmi specifickou absorpci při vlnové délce 280 nm, což umožňuje přímé měření koncentrace bílkovin A280.
UV absorbance při 280 nm se běžně používá k odhadu koncentrace bílkovin v laboratořích díky své jednoduchosti, snadnému použití a cenové dostupnosti. Měření je rychlé a vysoce reprodukovatelné, protože není nutná inkubace. Kromě toho tato metoda vyžaduje také extrémně malý objem vzorku, protože moderní spektrofotometry používají při měření systém zadržování vzorku.
Je však třeba dbát na to, aby vzorek bílkovin neobsahoval žádné nebílkovinné složky (např. nukleové kyseliny) se stejným absorpčním spektrem, protože to může vést k chybným výsledkům. Kromě stanovení koncentrace bílkovin lze hodnoty absorbance použít také při zjišťování konformačních změn a vazby ligandů a pro sledování enzymových reakcí.
Vliv tryptofanu a tyrosinu při kvantifikaci bílkovin
V důsledku přítomnosti tyrosinu a tryptofanu absorbují bílkoviny a peptidy obsahující tyto aromatické aminokyseliny UV světlo o vlnové délce 280 nm. Každý z těchto zbytků má odlišnou absorpční a emisní vlnovou délku a liší se kvantovým výtěžkem. Fenylalanin a disulfidické vazby také přispívají k absorpci při této vlnové délce, ale protože je relativně nevýznamná, lze ji pozorovat pouze v nepřítomnosti tryptofanu i tyrosinu.
Mnoho enzymatických kofaktorů obsahujících aromatické kruhové struktury (např. FMN, FAD, NAD a porfyriny) také absorbuje UV světlo pro excitaci, a proto přispívá k intenzitě výsledné fluorescence. Speciální proteiny, jako je zelený fluorescenční protein, mají také vnitřní serinetyrosin-glycinovou sekvenci, která je posttranslačně modifikována a fluoreskuje ve viditelné oblasti světla.
Tryptofan
Tryptofan je výrazně fluorescenčnější než tyrosin a fenylalanin. Jeho fluorescenční vlastnosti jsou však závislé na rozpouštědle, tj. spektrum se posouvá ke kratším vlnovým délkám a zvyšuje se jeho intenzita s klesající polaritou rozpouštědla. Tryptofanové zbytky pohřbené v hydrofobních doménách složených proteinů tak vykazují spektrální posun o 10 až 20 nm.
Vzhledem k jeho větší absorptivitě, vyššímu kvantovému výtěžku a rezonančnímu přenosu energie se fluorescenční spektrum proteinu obsahujícího tyto tři aminokyseliny obvykle podobá fluorescenčnímu spektru tryptofanu.
Tyrosin
Tyrosin může být excitován na podobné vlnové délce jako tryptofan, ale bude emitovat na výrazně odlišné vlnové délce. I když může být pravda, že tyrosin je méně fluorescenční než tryptofan, může poskytovat významný signál, protože je často přítomen ve velkém množství v mnoha bílkovinách. Bylo pozorováno, že fluorescence tyrosinu je zhášena přítomností blízkých tryptofanových částí buď prostřednictvím rezonančního přenosu energie, nebo ionizací jeho aromatické hydroxylové skupiny.
Při měření peptidů metodou A280 je třeba mít na paměti několik důležitých bodů.
- Proteiny s podobnou molekulovou hmotností mohou mít různé hodnoty absorbance v důsledku rozdílného obsahu tryptofanu a tyrosinu.
- UV absorbance je také ovlivněna strukturou proteinu. Podmínky, které ovlivňují strukturu (například teplota, pH, iontová síla nebo přítomnost detergentů), tak mohou ovlivnit schopnost aromatických zbytků absorbovat světlo při vlnové délce 280 nm a změnit hodnotu extinkčního koeficientu proteinu.
- Místní prostředí aromatických aminokyselin může mít vliv na jejich spektra. To znamená, že tryptofan bude mít emisní pík při nižších vlnových délkách, pokud je pohřben v hydrofobních vnitřních oblastech proteinu, zatímco tyrosin bude často předávat svou energii sousedním tryptofanovým aminokyselinám. Ionizovaný tyrosinát, který vzniká při ztrátě protonů z tyrosinu v důsledku zvýšení pH, bude vykazovat podobné vlnové délky jako tryptofan.
.