Profily mastných kyselin a jejich distribuční vzorce v mikrořasách: komplexní analýza více než 2000 kmenů ze sbírky kultur SAG

Báze profilů FA z různých mikrořas

Charakterizace profilů FA kmenů mikrořas SAG byla provedena screeningem dlouhých řetězců FA (C-14 – C-24) esterifikovaných v lipidech. Celkem bylo prověřeno 2076 kmenů kultur ze SAG (což odpovídá 91 % hospodářství SAG). Byla vytvořena databáze, která obsahovala všechny identifikované FA a některé další hydrofobní metabolity. Přehled všech látek identifikovaných ve screeningových kmenech řas je uveden v tabulce 1. Hmotnostní spektrometrií bylo identifikováno celkem 86 různých látek, z nichž 76 představuje metylestery FA. Ze 76 mastných kyselin bylo 36 látek identifikováno podle jejich hmotnostního spektra a retenčního času podle standardní látky a dalších 40 mastných kyselin bylo identifikováno pouze podle jejich hmotnostního spektra. Zbývajících 10 látek bylo identifikováno rovněž pouze podle jejich hmotnostních spekter. Při porovnání se standardní látkou byla sloučenina identifikována porovnáním s hmotnostními spektry s největší podobností s navrhovanou látkou v MS-knihovně (Nist02 nebo Wiley98). Tímto způsobem byly zjištěny některé methylestery rozvětvených FA, například 12-methyl-14:0 nebo 3, 7, 11, 15-tetramethyl-16:0. Zatímco pro většinu FAME byly k dispozici autentické standardy nebo MS reference, u některých dalších látek byla možná pouze identifikace „best hit“. Deriváty DMOX umožnily identifikaci zbývajících 12 FAME. Neidentifikované látky je třeba ještě ověřit pomocí autentických standardů, které v tuto chvíli nejsou k dispozici. Kompletní databáze je uvedena jako doplňkový soubor 1.

Bakterie v kulturách řas (jako kontaminace nebo někdy i prostřednictvím symbiózy) jsou dobře známy a lze je nalézt v kmenech kultur téměř každé sbírky řas. Pouze malá část (asi 20 %) studovaných kmenů SAG může být v axenickém stavu. Proto se na získaném profilu FA mohl podílet i obsah FA kontaminujících bakterií. Abychom to ověřili, měřili jsme methyl-15:0 a methyl 17:0, které jsou považovány za markery bakteriální kontaminace. Pouze 34 kmenů z 2076 analyzovaných kmenů obsahovalo malé množství methyl-15:0. Tuto zjištěnou nízkou míru kontaminace bakteriemi podpořily mikroskopické kontroly, které jsou rutinní při věčném udržování kmenů řas (údaje nejsou uvedeny). Souhrnně jsme dospěli k závěru, že pouze 1-2 % kmenů mohlo být kontaminováno a že existuje pouze malý vliv bakteriální kontaminace na pozorované profily FA řasových kultur.

Dále jsme porovnali naměřené profily hlavních FA 10 náhodně vybraných kmenů z různých tříd s publikovanými údaji (tabulka 2), přičemž je třeba poznamenat, že pouze jeden z 10 kmenů, které byly vybrány z publikovaných údajů, pochází ze sbírky SAG. U 6 kmenů byly profily FA velmi podobné. U zbývajících 4 kmenů byly pozorovány velké rozdíly ve stupni desaturace FA s různou délkou řetězce, což lze vysvětlit rozdílnými kultivačními podmínkami použitými v různých studiích.

Složení mastných kyselin

Profily FA se mezi kmeny poměrně lišily. Jako příklad jsou na obrázku 1 uvedeny profily FAME čtyř různých rodů, a to Chroococcus (Cyanobacteria), Closteriopsis (Chlorophyta, Trebouxiophyceae), Pseudochantransia (Rhodophyta) a Prymnesium (Chromalveolates, Haptophyta). Proto se předpokládalo, že budou zjištěny určité odlišné vzorce distribuce FA mezi jednotlivými fylami, třídami a rody mikrořas. Kromě toho bylo testováno, zda lze rozdíly ve vzorcích FA nalézt také u skupin na nižším taxonomickém stupni, tj. mezi druhy téhož rodu nebo dokonce mezi vícenásobnými izoláty téhož druhu.

2.1 Distribuce čtyř důležitých PUFA u kmenů ze sbírky kultur řas SAG

Pro čtyři PUFA, které jsou z hlediska výživy velmi zajímavé, byly podrobněji zkoumány vzorce distribuce FA mezi 17 skupinami (fyliemi nebo třídami) mikrořas a sinicemi, které zkoumané kmeny zahrnují (tabulka 3). Četnost výskytu těchto čtyř PUFA v určité skupině mikrořas je v tabulce 3 uvedena jako procento kmenů s určitým FA ze všech zkoumaných kmenů.

Protože se sbírka kultur SAG zaměřuje na mikroskopické řasy ze suchozemských biotopů, byly Haptophyta, Dinophyta a Phaeophyceae zastoupeny jen slabě. Proto získané vzorce rozšíření v těchto a dalších málo zastoupených skupinách nemusí být reprezentativní pro celou skupinu. Například pro Phaeophyceae byly k dispozici především mikroskopické formy (např. Ectocarpus a sladkovodní rod Bodanella) a zkoumané kmeny Rhodophyta zahrnovaly většinou sladkovodní formy nebo formy ze suchozemských stanovišť (např. Porphyridium). Přestože jsou diatomy v terestrických biotopech velmi rozmanité, zkoumaný malý vzorek dostupných kmenů diatomů (18) zdaleka dostatečně nereprezentuje tuto skupinu, která je pravděpodobně druhově nejbohatší skupinou řas. Také pro každou ze dvou tříd Stramenopiles (heterokontní řasy), Phaeothamniophyceae a Raphidophyceae, jsou v SAG udržovány pouze dva kmeny, a proto zde nejsou dále diskutovány. Podobně je v SAG pouze jediný kmen Chlorarachniophyta (nadskupina Rhizaria).

Kyselina dokosahexaenová s velmi dlouhým řetězcem PUFA (DHA, 22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) byla třetí nejčastější FA, přítomná v 15 z 20 zkoumaných skupin (tab. 3). V kmenech Dinophyta, Haptophyta a Euglenoida byly DHA obsahující kmeny obzvláště časté a DHA se zde vyskytovala v poměrně vysokých procentech celkového obsahu FA, tj. u 60 % a více těchto kmenů byl podíl DHA vyšší než 5 %. U jediného studovaného dinofytního kmene Ceratium horridum činil podíl DHA dokonce 29,3 %. V ostatních skupinách se DHA vyskytovala spíše v nízkých četnostech a také většinou v poměrně malých podílech, tj. méně než 1 % z celkového obsahu FA. Přestože DHA byla nalezena v Cryptophyta a Bacillariophyceae přibližně v každém pátém kmeni, její podíl na celkovém obsahu FA zde byl menší než 5 %, s výjimkou Cryptomonas baltica SAG 18.80 (Cryptophyta), kde činí 13,7 %. Přestože se DHA u zelených řas (Chlorophyta) vyskytovala spíše v nízkých četnostech, druhý nejvyšší obsah DHA ze všech kmenů SAG, 18,9 % z celkového množství FA, byl zjištěn u chlorofyta Chlorococcum novae-angliae SAG 5.85, následovaného trebuxiofytem Prototheca zopfii SAG 263-8 s 14,2 %. Dohromady jsou tato zjištění v souladu s dříve popsaným množstvím DHA u konkrétních skupin řas .

Kyselina eikosapentaenová (EPA, 20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)) byla jednou z nejčastěji se vyskytujících PUFA, nalezená ve všech 17 skupinách zahrnutých do naší studie (tabulka 3). Kmeny obsahující EPA se vyskytovaly zejména ve skupinách Eustigmatophyceae, Glaucophyta, Xanthophyceae a Rhodophyta. Nejvyšší podíl EPA na celkovém obsahu FA byl u Rhodophyta, kde přibližně 81 % kmenů vykazovalo více než 10 % EPA. Nejvyšší hodnoty byly 52,4 % u Compsopogonopsis leptoclados SAG 106.79 a 44,9 % u Acrochaetium virgatulum SAG 1.81. Také kmeny tří druhů rodu Porphyridium obsahovaly vysoké množství EPA (31,2 % u P. sordidum SAG O 500, 27,5 % u P. aerugineum SAG 110.79, 26,7 % u P. purpureum SAG 1380-1a). To je v souladu se zprávou o P. cruentum, která naznačuje, že červené řasy jsou bohatým zdrojem EPA . Přestože se EPA v Glaucophyta vyskytovala poměrně často, jen asi polovina všech kmenů měla podíl EPA vyšší než 10 % (maximum 31,1 % u Glaucocystis nostochinearum SAG 28.80). To je v souladu s jinou studií, která prokázala vysoké množství EPA (kromě ARA) u glaukofytu Cyanophora paradoxa . Nejvyšší procento (87 %) kmenů s podílem EPA vyšším než 10 % bylo u Dinophyta, ale s maximem pouhých 24,3 % u Pyrocystis lunula SAG 2014. V Euglenoidech, Xanthophyceae a Eustigmatophyceae mělo přibližně 67 % všech kmenů podíl EPA větší než 10 % s maximálními hodnotami kolem 31 % (31,4 % u Heterococcus fuornensis SAG 835-5, 31,6 % u Euglena proxima SAG 1224-11a) a 34,6 % u Goniochloris sculpta SAG 29.96 . EPA se ve většině zelených řas vyskytovaly zřídka a většinou v nevýznamném množství (< 5 %), ale tři kmeny měly výjimečně vyšší obsah kolem 20 % celkových FA (24,2 %, Chlorella sp. SAG 242.80; 24,0 %, Chlamydomonas allensworthii SAG 28.98; 22,3 %, Cylindrocapsa involuta SAG 314-1). EPA byla jedinou FA získanou z Chlorarachnion repens SAG 26.97 (Chlorarachniophyta). To, že Xanthophyceae a Eustigmatophyceae obsahují EPA v relativně vysokém podílu, zatímco zelené řasy EPA akumulují jen zřídka, podporuje předchozí studie .

Kyselina arachidonová (ARA, 20:4(5Z, 8Z, 11Z, 14Z)) se nejčastěji vyskytovala u Phaeophyceae, kde byla přítomna u všech kmenů s výjimkou jednoho zkoumaného kmene (tab. 3); u přibližně 54 % všech kmenů Phaeophyceae byl podíl ARA vyšší než 10 %, ale s maximem pouhých 17,7 % u Halopteris filicina SAG 10.96. V případě Phaeophyceae byl podíl ARA vyšší než 10 %. Nejvyšší podíl ARA na celkovém množství FA byl u Rhodophyta; tam dokonce asi 77 % všech kmenů mělo obsah ARA vyšší než 10 % s maximem 68,3 % u Pseudochantransia sp. SAG 19.96. Zajímavé je, že obsah ARA byl poměrně vysoký, ale variabilní u osmi zkoumaných vícenásobných izolátů rhodofytu Porphyridium purpureum. Zatímco u šesti kmenů činil průměrný podíl ARA asi 31 %, u SAG 1380-1d to bylo jen 3,8 %, ale u SAG 1380-1e 44,5 %. Pro tento rozdíl zatím nemáme vysvětlení; oba kmeny byly izolovány z mořských biotopů a jsou chovány za stejných kultivačních podmínek. Vysoké podíly ARA (stejně jako EPA) již byly zjištěny charakteristické pro jiný druh Porphyridium cruentum . ARA byla přítomna asi u poloviny všech zkoumaných eugenoidních kmenů a s poměrně vysokým podílem celkového obsahu FA, tj. asi třetina kmenů vykazovala více než 5 % ARA s mimořádně vysokými hodnotami 41,3 % a 34,3 % u kmenů Rhabdomonas incurva SAG 1271-8 a Khawkinea quartana SAG 1204-9 . Zajímavé je, že další kmen téhož druhu K. quartana SAG 1204-9 měl méně než poloviční obsah ARA (13,3 %) a u pěti dalších druhů Rhabdomonas nebyl zjištěn žádný obsah ARA. To ukazuje, že obsah FA může být poměrně variabilní mezi druhy téhož rodu a dokonce i mezi více izoláty téhož druhu. Přestože přibližně polovina všech zkoumaných kmenů u Xanthophyceae a Eustigmatophyceae obsahovala ARA (tab. 3), měly tuto FA v poměrně nízkém zastoupení. Pouze čtvrtina kmenů Xanthophyceae obsahujících ARA vykazovala více než 5 % a u Eustigmatophyceae dokonce žádný kmen nedosáhl 5 %. U zelených řas se ARA vyskytovala zřídka, tj. s průměrnou četností kolem 14 % u fyla Chlorophyta a Streptophyta, s výjimkou prasinofytních zelených řas, kde byla ARA přítomna u 42,9 % všech kmenů (tab. 3). Vyskytlo se však několik jednotlivých příkladů zelených řas s mimořádně vysokým obsahem ARA, tj. 73,8 % (což odpovídá 102 μg/mg sušiny, což je nejvyšší obsah ARA zjištěný u všech zkoumaných kmenů SAG) u chlorofyta Palmodictyon varium SAG 3.92, dále 52,9 % u chlorofyta Trochisciopsis tetraspora SAG 19.95 a 51,8 % u trebouxiophyta Myrmecia bisecta SAG 2043. To, že u posledně jmenovaného kmene byl zjištěn vysoký obsah ARA, je v souladu s tím, že byl zjištěn blízký příbuzný s Parietochloris incisa (syn. Lobosphaeropsis incisa, Myrmecia incisa) . P. incisa byla zařazena mezi „olejnaté mikrořasy“ a nejbohatší dosud známý rostlinný zdroj ARA díky své schopnosti akumulovat vysoké množství ARA (až 59 % celkového obsahu FA) . Zajímavé je, že SAG kmen P. incisa (Lobosphaera incisa SAG 2007) měl s 13,2 % mnohem nižší obsah ARA (tab. 2).

γ-Linolenová kyselina (GLA, 18:3(6Z, 9Z, 12Z)) byla třetí nejčastější FA ve studovaném vzorku SAG kmenů mikrořas, chyběla pouze u Haptophyta, Dinophyta a Euglenoidů (tab. 3). Nejčastěji byl zjištěn u dvou linií zelených řas, prasinofytů a streptofytů. U prasinofytů však byla GLA přítomna pouze u jednoho z pěti dostupných rodů této skupiny, Tetraselmis, a tam u 12 ze 17 dostupných kmenů a v různém poměru, tj. 0,5 – 7,3 % celkového obsahu FA. U Streptophyta byla GLA rozšířenější, tj. byla zjištěna u 17 ze 41 zkoumaných rodů. Distribuce GLA byla poměrně variabilní v rámci kmenů a druhů určitého rodu Streptophyte, podobně jako nálezy ARA u jiných rodů. Relativně vysoké procento GLA bylo zjištěno u druhů/kmenů rodu Closterium (16,5 % u C. baillyanum SAG 50.89, 8 % u C. lunula SAG 7.84), ale u ostatních 12 kmenů tohoto rodu nebyl GLA zjištěn. Podobně v mnoha dostupných kmenech Cosmarium (25) a Micrasterias (16) byla GLA nalezena pouze u 11, resp. 2 kmenů. Nejvyšší procento GLA bylo zjištěno u zelených řas třídy Chlorophyceae (29,9 % u Deasonia multinucleata SAG 25,95, 28,5 % u Desmodesmus multiformis SAG 26,91) a u sinic (24,8 % u Spirulina maxima SAG 84,79). Přibližně u třetiny (32 %) všech kmenů chlorofytů GLA dosahoval podíl této FA 5 % a více. Distribuce GLA u sinic byla spíše nerovnoměrná, tj. 27 kmenů sinic s GLA bylo omezeno především na tři rody: Calothrix (8 kmenů), Microcystis (7 kmenů) a Spirulina (6 kmenů). Také v rámci každého z těchto rodů byl podíl GLA značně variabilní, např. u Spiruliny se pohyboval od 4,6 % do 24,8 % a tři kmeny byly bez GLA. Složení FA bylo již dříve použito k rozlišení sinic v izolátech a přírodních vzorcích na rodové úrovni . K rozlišení druhů sinic bylo v dřívější studii jako další marker použito složení uhlovodíků, ale v naší studii se nepodařilo detekovat žádnou látku z této skupiny . Zajímavé je, že GLA byla jedinou FA, která byla zjištěna u více než tří z 223 zkoumaných kmenů. Kmeny sinic SAG lze tedy zhruba rozdělit na ty s přítomností GLA (několik rodů) a ty, kde nebyly přítomny téměř žádné PUFA. To odpovídá dřívějším zjištěním, která popisovala dvojí rozdělení sinic, nezávisle na jejich taxonomickém postavení, na rody produkující C-18 PUFA a ty, které je neprodukují .

Prasinofytní rod Tetraselmis představoval zajímavý příklad pro testování variability FA mezi blízce příbuznými izoláty. Devět kmenů přiřazených k tomuto rodu bylo izolováno ze stejné (mořské) lokality a izolátor je považoval za stejný druh (U.G. Schlösser, pers. comm.). Pouze u dvou kmenů byla přítomna DHA, ale ve velmi malých stopách (0,3 % a 0,4 %). Naproti tomu ARA a GLA byly nalezeny u všech izolátů s procentuálním zastoupením pohybujícím se od 0,8 % do 2,7 %, resp. od 0,5 % do 7,3 %.

2.2 Analýza vzorců distribuce FA

Zjištěné složení mastných kyselin (FA) u 2076 zkoumaných kmenů bylo statisticky analyzováno s cílem ověřit, zda mezi jednotlivými zkoumanými skupinami řas existují určité vzorce distribuce FA, které mohou odpovídat jejich fylogenetickým vztahům. V první sadě tří analýz (vyšší taxonomické úrovně) bylo testováno, 1) zda vzorce distribuce FA mohou odrážet rozdíly mezi fylami řas odvozenými z primární (nadskupina Plantae) nebo sekundární endocytobiózy (Chromalveolates, Euglenoidy) ve srovnání se sinicemi reprezentujícími plastidový původ, 2) rozlišení fylů v rámci nadskupiny Plantae (Chlorophyta, Streptophyta, Rhodophyta/Glaucophyta) a 3) hlavní evoluční linie (třídy) v rámci Chlorophyta. Druhá sada analýz byla zaměřena na rodovou úroveň, tj. bylo testováno, zda se oddělení rodů, jak bylo na základě předchozích analýz sekvence 18S rDNA navrženo pro Chlamydomonas s.l., Chlorella s.l. a Scenedesmus s.l., odráží v modelech distribuce FA. Pro první sadu analýz muselo být mnoho druhů (266), které byly zastoupeny jako více kmenů (např. Chlamydomonas moewusii, 28), redukováno pouze na jeden kmen pro každý druh, aby se zabránilo zkreslení. To se týkalo i vícenásobných kmenů neidentifikovaných na druhové úrovni, tj. označených „sp.“ místo druhového jména (např. Chlorogonium sp., 26). Na takové vícenásobné kmeny byly zvláště bohaté kmeny SAG Chlorophyta. Vyloučeny byly také ty kmeny, u nichž byl zjištěn pouze jeden FA. Tím se celkový počet kmenů uvažovaných v našich výpočtech snížil na 1193. Kmeny byly poté rozděleny do jedenácti skupin zhruba odpovídajících fylům nebo třídám (doplňkový soubor 2). Kmeny patřící do Chlorophyta (61 % všech zkoumaných kmenů) byly dále rozděleny do tří tříd: Chlorophyceae, Trebouxiophyceae a Ulvophyceae, zatímco kmeny prasinofytních zelených řas SAG (1,7 % všech uvažovaných kmenů Chlorophyta) byly z analýz vyloučeny, protože zahrnovaly jen velmi málo druhů (10). Kmeny Glaucophyta (15) a Rhodophyta (81) byly společně považovány za jednu složenou jednotku. Kmen Rhizaria – Chlorarachniophyta, byl zastoupen pouze jediným kmenem, a proto byl ze statistických analýz vynechán.

Analýzy vyšších taxonomických úrovní

Bylo testováno, zda distribuční vzorce složení FA na zkoumaných kmenech od sebe odlišují tři „nadskupiny“ eukaryotických řas, Plantae, Chromalveolates a Excavates (Euglenoids), a sinice. Superskupina Plantae zahrnuje výhradně eukaryota s plastidy pocházejícími z primární endocytobiózy, tj. sinice byla přeměněna na organelu prostřednictvím absorpce a retence hostitelskou buňkou, po níž následovala ztráta velké části jejího genomu . Chromalveolární řasy i Euglenoidy (jediná linie řas Excavates) získaly své plastidy sekundární endocytobiózou z rodofytu, respektive zelené řasy . Aby bylo možné uvažovat téměř stejný počet kmenů pro všechny čtyři skupiny, bylo náhodně vybráno 100 kmenů Plantae, Chromalveolates a Cyanobacteria, což přesně odpovídá celkovému počtu uvažovaných kmenů euglenoidů (73). Ordinace, která byla výsledkem CVA (Canonical Variates Analysis, víceskupinová diskriminační analýza), poukázala na výrazný rozdíl mezi sinicemi/primární endocytobiózou (Plantae) a dvěma skupinami reprezentujícími sekundární endocytobiózu (Chromalveolates/Euglenoidy) (obr. 2). Pozorovaný rozdíl byl bez výjimky podpořen neparametrickými testy významnosti pro vícerozměrná data (NP-MANOVA a ANOSIM). Podle metody SIMPER byla nejnižší pozorovaná rozdílnost (63,55 %) mezi Cyanobacteria a Plantae, zatímco nejvyšší (77,29 %) byla mezi Plantae a Chromalveolates. První kanonická varianta (CV1) zahrnovala 99,99 % všech možných rozdílů mezi čtyřmi skupinami, proto jsme zkoumali možné korelace mezi touto osou a FA. Čtyři FA byly významně a výhradně korelovány s prvním kanonickým variátorem (CV1), tj. 16:0 (ρCV1 = -0,61/p < 0.001), 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,46/p < 0,001), 9-oktadekanamid (ρCV1 = 0,41/p < 0,001) a 18:1(9Z) (ρCV1 = -0,17/p = 0,001). Ve druhé analýze bylo testováno, zda vzorce distribuce FA rozlišují fyly nadskupiny Plantae, tj. dvě linie zelených řas, Chlorophyta a Streptophyta , a složenou skupinu Rhodophyta/Glaucophyta. Protože ta byla s 54 kmeny nejmenší skupinou, byla porovnávána se stejně velkými náhodnými vzorky z každé skupiny Chlorophyta a Streptophyta (tab. 3). Ordinační diagram z CVA celkem 162 zkoumaných kmenů jasně oddělil skupinu Rhodophyta/Glaucophyta od obou fyl zelených řas (obr. 3). CV1 zahrnoval 79 % všech možných rozdílů a ani CV2 nebyl s 21 % zanedbatelný. Testy významnosti, NP-MANOVA a ANOSIM, podpořily rozlišení všech tří skupin. SIMPER ukázal, že složená skupina Rhodophyta/Glaucophyta se spíše liší od obou zelených řasových fyl, tj. s Chlorophyta se liší o 70,55 % a se Streptophyta o 71,53 %. Nejmenší nepodobnost (55,41 %) mezi třemi testovanými skupinami byla mezi Chlorophyta a Streptophyta. S CV1 významně a výlučně korelovalo pět FA, tj. 18:3(9Z, 12Z, 15Z) (ρCV1 = 0,77/p < 0,001), 20:4 (ρCV1 = -0.49/p < 0,001), 20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z) (ρCV1 = -0,59/p < 0,001), 18:1(9Z) (ρCV1 = 0,30/p = 0,001) a 16:0 (ρCV1 = -0,56/p = 0, 001). Dvě FA korelovaly výhradně s CV2, tj. rozlišovaly Chlorophyta a Streptophyta, 18:1(9Z) (ρCV2 = -0,4477/p < 0,001) a 9-oktadekanamid (ρCV2 = 0,34/p < 0,001). Zdaleka největší část všech uvažovaných kmenů (60,3 %) pocházela z Chlorophyta, díky čemuž bylo zajímavé otestovat, zda vzorce distribuce FA mohou rozlišovat mezi třemi třídami Chlorophyta, Chlorophyceae, Trebouxiophyceae a Ulvophyceae. Ulvophyceae byla nejmenší z těchto tří tříd s pouhými 49 kmeny, a proto byly pro statistické analýzy použity náhodné vzorky téměř stejné velikosti (54) z každé z ostatních dvou tříd. CVA neodhalila žádné výrazné skupiny, tj. analyzované kmeny měly tendenci tvořit tři skupiny odpovídající třem třídám zelených řas, ale se značným překryvem mezi nimi (obr. 4). V použitých testech významnosti i v testu SIMPER však byly zjištěny významné rozdíly mezi těmito třemi třídami. Ta a korelační analýza umožnily považovat 9-oktadekanamid (ρCV1 = -0,58/p < 0,001; ρCV2 = -0,22/p < 0,010) a FA 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,44/p < 0.001; ρCV2 = -0,53/p < 0,001) jako jediné proměnné dobře rozlišovaly Ulvophyceae od Chlorophyceae/Trebouxiophyceae a Trebouxiophyceae od Ulvophyceae/Chlorophyceae.

Analýzy na úrovni rodů

Tři předchozí analýzy ukázaly, že fylogenetické vztahy na úrovni fylů a tříd mezi skupinami řas se odrážejí ve vzorcích distribuce FA při použití velkého vzorku kmenů. Proto jsme v druhé skupině analýz testovali, zda rozdíly ve vzorcích distribuce FA mohou řešit stejné rozlišení rodů jako v analýzách sekvencí genů rRNA. K tomuto testu jsme vybrali tři rody, které jsou široce využívány v biotechnologických aplikacích a jsou dobře zastoupeny kmeny SAG, tj. rody Chlorella s.l., Scenedesmus s.l. a Chlamydomonas s.l.. Nedávné analýzy sekvencí genů18S rRNA odhalily, že každá z těchto tří skupin je para- nebo polyfyletickou skupinou zahrnující několik různých rodů. Pro Chlamydomonas jsme vybrali 17 druhů (53 kmenů), z nichž 9 bylo zastoupeno více kmeny (např. C. reinhardtii, 16), které byly ve fylogenezi 18S rDNA rozděleny na pět nezávislých linií/kladů (= rodů) . Pro lepší zastoupení kladu „Oogamochlamys“ byly zahrnuty také dva kmeny ze sbírky UTEX (2213, 1753). Ordinace NMDS jasně oddělila členy kladu „Reinhardtii“ (na obrázku 5 vpravo nahoře), s výjimkou tří kmenů, od členů kladu „Chloromonas“ (na obrázku 5 vlevo dole). Skupina „Chloromonas“, jak ukázaly vzorce FA, však zahrnovala také tři zkoumané kmeny z kladů „Moewusii“ a čtyři z kladů „Oogamochlamys“, což bylo v rozporu s fylogenezí 18S rDNA . Také na rozdíl od fylogeneze rDNA rozdělily analýzy FA rod Lobochlamys, tj. kmen L. culleus byl součástí skupiny „Chloromonas“, zatímco kmen L. segnis patřil do skupiny „Reinhardtii“. Kmeny rodu Oogamochlamys byly rovněž rozděleny na obě skupiny FA, na rozdíl od jejich druhového zařazení na základě analýz 18S rDNA.

Analýzami sekvencí genů rRNA bylo prokázáno, že druhy a kmeny dříve řazené do jediného rodu Scenedesmus se ve skutečnosti vyskytují v několika rodech. Například rod Acutodesmus byl vyčleněn z rodu Scenedesmus . Ordinační graf NMDS vzorců distribuce FA odhalil tendenci mezi studovanými kmeny být rozděleny na dva shluky, tj. jeden shluk 8 kmenů rodu Acutodesmus (zahrnující především více kmenů rodu A. obliquus) byl jasně oddělen od jiného shluku obsahujícího především kmeny rodu Scenedesmus s.str. (obrázek 6). Vícenásobné kmeny S. vacuolatus byly seskupeny společně s dalšími čtyřmi kmeny tohoto rodu, s výjimkou kmene SAG 211-11n, který byl blízko shluku Acutodesmus. Mnohonásobné kmeny A. obliquus však byly rozmístěny v obou shlucích (obrázek 6). Sedm kmenů A. obliquus tvořilo převážně shluk Acutodesmus, zatímco pět dalších kmenů A. obliquus se seskupilo s kmeny Scenedesmus s.str. To znamená, že v rámci jednoho druhu zelené řasy A. obliquus existují dva odlišné vzorce FA. AFLP fingerprinty již ukázaly rozsáhlou genetickou variabilitu mezi více kmeny A. obliquus, zatímco porovnání sekvence ITS2 rDNA prokázalo konspecifičnost více kmenů, s výjimkou kmene SAG 276-20 (T. Friedl, nepubl. pozorování). Zjištění, že kmeny A. obliquus jsou rozděleny do dvou skupin podle vzoru FA, tedy podporuje názor, že genetické rozdíly rozlišené pomocí AFLP mohou odpovídat různým fenotypovým vlastnostem. V důsledku toho může být zásadní pečlivě zaznamenávat, který kmen byl použit při jakékoli aplikaci . Ačkoli bylo zjištěno, že kmen SAG 276-20 nepatří ke stejnému druhu A. obliquus, jeho vzor FA naznačuje, že může být stále členem rodu Acutodesmus, protože byl zařazen do skupiny Acutodesmus (obrázek 6).

Chlorella vulgaris tvoří další příklad, kdy byla analýzami AFLP zjištěna rozsáhlá genetická variabilita mezi více kmeny téhož druhu . Patnáct vícenásobných SAG kmenů C. vulgaris bylo porovnáno s 19 dalšími kmeny Chlorella a Chlorella-like, tj. jejich nejbližšími příbuznými, jak je patrné z fylogeneze 18S rDNA, C. sorokiniana a C. lobophora, členy kladu Parachlorella sensu i vzdáleněji příbuznými kmeny, tj. z kladu Watanabea a Prasiola sensu . Ordinace NMDS na základě vzorce distribuce FA neprokázala téměř žádné rozdíly v rámci více kmenů C. vulgaris a shlukovala je dohromady, s výjimkou kmene SAG 211-1e (obr. 7). Další shluk vzdálený od C. vulgaris tvořili členové kladu Watanabea, zatímco řasy podobné Chlorelle z kladu Prasiola nebyly shlukovány dohromady.

.