Pyrosekvenování je metoda sekvenování DNA (určování pořadí nukleotidů v DNA) založená na principu „sekvenování syntézou“, kdy se sekvenování provádí detekcí nukleotidu inkorporovaného DNA polymerázou. Pyrosekvenování spočívá v detekci světla na základě řetězové reakce při uvolnění pyrofosfátu. Odtud název pyrosekvenování.
Princip pyrosekvenování poprvé popsali v roce 1993 Bertil Pettersson, Mathias Uhlen a Pål Nyren kombinací metody sekvenování na pevné fázi pomocí magnetických kuliček potažených streptavidinem s rekombinantní DNA polymerázou postrádající 3´ až 5´exonukleázovou aktivitu (proof-reading) a detekcí luminiscence pomocí enzymu světlušky luciferázy. Směs tří enzymů (DNA polymerázy, ATP sulfurylázy a světluščí luciferázy) a nukleotidu (dNTP) se přidá k jednovláknové DNA, která má být sekvenována, a inkorporace nukleotidu se sleduje měřením emitovaného světla. Intenzita světla určuje, zda bylo začleněno 0, 1 nebo více nukleotidů, a ukazuje tak, kolik komplementárních nukleotidů je přítomno na templátovém vlákně. Před přidáním další směsi nukleotidů se směs nukleotidů odstraní. Tento postup se opakuje s každým ze čtyř nukleotidů, dokud není určena sekvence DNA jednovláknového templátu.
Druhou metodu pyrosekvenování založenou na roztoku popsali v roce 1998 Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen a Pål Nyren. Při této alternativní metodě je zaveden další enzym apiráza, který odstraňuje nukleotidy, jež nejsou inkorporovány DNA polymerázou. To umožnilo přidat směs enzymů zahrnující DNA polymerázu, luciferázu a apyrázu na začátku a udržovat ji po celou dobu postupu, čímž se dosáhlo jednoduchého uspořádání vhodného pro automatizaci. Automatizovaný přístroj založený na tomto principu uvedla v následujícím roce na trh společnost Pyrosequencing.
Třetí mikrofluidní variantu metody Pyrosequencing popsal v roce 2005 Jonathan Rothberg a jeho spolupracovníci ze společnosti 454 Life Sciences. Tento alternativní přístup k Pyrosekvenování vycházel z původního principu připevnění sekvenované DNA k pevnému nosiči a ukázali, že sekvenování lze provádět vysoce paralelním způsobem pomocí mikrofabrikovaného mikročipu. To umožnilo vysoce výkonné sekvenování DNA a na trh byl uveden automatizovaný přístroj. Ten se stal prvním přístrojem pro sekvenování nové generace, který zahájil novou éru genomického výzkumu, přičemž rychle klesající ceny sekvenování DNA umožnily sekvenování celého genomu za dostupné ceny.