Cell survival after irradiation
Investigation of radiation-induced cell growth and death, definované jako doba potřebná pro úplnou ztrátu proliferační schopnosti nebo exaltaci proliferační schopnosti, je jednou z nejčastěji a nejspolehlivěji používaných metod studia účinků záření na buňky. Při ozařovacích experimentech naše laboratoř ověřila, že hodnoty 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidu (MTT) jsou úměrné počtu buněk in vitro, přinejmenším ve fázi exponenciálního růstu (údaje nejsou uvedeny). Ozáření 12C6+ ionty s vysokou energií obvykle vede k zániku naprosté většiny buněk. Podíl buněčné smrti v lag fázi po ozáření a změny v době zdvojení lze měřit testováním v různých časových bodech po ozáření. Protože náš test nebyl pouze jednobodovým stanovením přežití, bylo možné snadno získat také informace o růstové výkonnosti. Křivka přežití byla vykreslena na přirozené logaritmické stupnici podílu přežití v závislosti na různých fyzikálních parametrech.
Buňky C. tyrobutyricum 25755 byly ozářeny 20 h po výsevu. Kmeny s nejnižší metabolickou aktivitou a nejpomalejší proliferací nebo buňky, které přestaly proliferovat, byly z testu vyloučeny promytím a trypsinizací, když bylo po ozáření provedeno nasazení. Frakce přežití získaná z rovnice (1) byla porovnána s reprezentativním souborem experimentálních údajů. Obrázek 1 ukazuje srovnání křivek přežití po ozáření 12C6+ ionty při různých energiích svazku pro různé kmeny C. tyrobutyricum ATCC 25755. Výsledky MTT testu jsou vyneseny do grafu v závislosti na dávce ozáření (10 až 50 Gy) při energii 68 AMeV a hladinách 106 až 108 iontů – puls-1, které byly e0 → e-4,5 pro obrázek 1A, e0 → e-5,8 pro obrázek 1B a e0 → 0 pro obrázek 1C. Obrázky 1D-F ukazují údaje o přežití buněk z výsledků MTT testu v závislosti na dávce ozáření (10 až 50 Gy) při energii 114 AMeV a 106 až 108 úrovních iontů – puls-1, které byly e0 → 0. Obecně bylo dosaženo dostatečné shody mezi výpočty a experimentálními údaji. U kmenů ošetřených při 68 AMeV rovnice podhodnotila účinnost dávky, zatímco u buněk ozářených při vysokých energiích (114 AMeV) byl výsledek nadhodnocen. Maximální odchylka, odvozená z poměru vypočtených a naměřených dávek pro danou úroveň účinku, byla 15 %. Podíl přežívajících kmenů silně závisel na konkrétních fyzikálních vlastnostech svazku 12C6+ iontů, které byly určeny energií, dávkou a úrovní iontů – puls-1 uvažovaných částic (obrázek 1). Je zřejmé, že se zvyšující se energií uhlíkových iontů podíl přežívajících kmenů klesal. Podle očekávání vykazovaly logaritmy přežití testů stejné charakteristiky: přežití záviselo na energii, iontovém pulzu-1 a dávce ozáření 12C6+-ionty. Zvýšení jednoho fyzikálního parametru po druhém vedlo ke snížení míry přežití. Velmi omezeného přežití (e-3,5 → e-6,5) bylo dosaženo při ozařování 12C6+-ionty s použitím energie 114 AMeV, dávky 20 až 40 Gy a 106 až 108 iontů-puls-1 .
Vliv ozáření 12C6+-ionty na přežívání Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755. Buňky byly ozářeny 20 h po nasazení a míra přežití byla stanovena pomocí MTT testu. Údaje o přežití jsou vyneseny do grafu v závislosti na úrovni ozáření. (A-C) 12C6+ ionty byly urychleny až na 68 AMeV a jejich ionty/puls se pohybovaly v rozmezí 106 až 108 při dávkovém příkonu 10 až 50 Gy. (D-F) ionty 12C6+ byly urychlovány až do 114 AMeV a jejich ionty/impuls se pohybovaly od 106 do 108 při dávkovém příkonu 10 až 50 Gy. Buňky s nízkou metabolickou aktivitou a pomalou proliferací nebo buňky, které se přestaly množit, byly z testu vyloučeny promytím a trypsinizací, když bylo po ozáření provedeno plátování.
Mnoho typů buněk se vyznačuje pravidelným buněčným dělením každých 12 až 24 h. Vzhledem k síle exponenciálního růstu může jediná buňka vytvořit tisíce dceřiných buněk během přibližně 9 až 12 běžných cyklů dělení, tj. několika dní. Po ozáření pak mohou být přeživší buňky složeny z některých mutantů. Velmi malé procento přeživších C. tyrobutyricum ATCC 25755 může vykazovat zvýšenou schopnost produkovat butyrát.
Vliv kyseliny máselné na růst buněk po ozáření
C. tyrobutyricum ATCC 25755 používá jako zdroj uhlíku a energie glukosu nebo xylosu. Monosacharid je do buňky transportován prostřednictvím fosfoenolpyruvát-dependentního fosfotransferázového systému vychytávání. Poté je glukóza nebo xylóza metabolizována prostřednictvím glykolýzy, která vykazuje nevýznamnou závislost na pH v rozmezí pH 7 až pH 5,5. Fermentace však byla zastavena, když buňky již glukózu nebo xylózu nespotřebovávaly z důvodu inhibice butyrátem. Za účelem dalšího zkoumání specifického vlivu ozáření na růstové profily buněk (na základě měření optické hustoty (OD) buněčné suspenze při vlnové délce 600 nm) byly jednotlivé vsádkové kultury prováděny v chemicky definovaném médiu P2 (prováděno v lahvích se sérem) obsahujícím 42 g-L-1 glukózy a doplněném 3,6, 7,2 a 10,8 g-L-1 kyseliny máselné. pH kultury C. tyrobutyricum ATCC 25755 (obr. 2A, kontrola) kleslo na přibližně 4,8 (ΔpH 1,4, z pH 6,2) v porovnání s tím, když byla doplněna 3,6 g-L-1 kyseliny máselné (obr. 2A1), 7. Obr. 2A, kontrola).2 g-L-1 kyseliny máselné (obrázek 2A2) a 10,8 g-L-1 kyseliny máselné (obrázek 2A3), byly odpovídající hodnoty pH přibližně 6,0 (ΔpH 0,5 od 6,5), 6,1 (ΔpH 0,3 od 6,4) a 5,9 (ΔpH 0,5 od 6,4). Při ozáření kultury 68 AMeV dávkou 40 Gy (obr. 2D, kontrola) však pH kleslo na přibližně 4,8 (ΔpH 1,7 počínaje hodnotou 6,5), zatímco při dávce 40 Gy (doplněné o 3,6 g-L-1 kyseliny máselné) (obr. 2D1), dávce 40 Gy (doplněné o 7,5 g-L-1 kyseliny máselné) a dávce 40 Gy (doplněné o 7,5 g-L-1 kyseliny máselné) (obr. 2D2) se pH snížilo na přibližně 4,8 (ΔpH 1,7 počínaje hodnotou 6,5).2 g-L-1 kyseliny máselné) (obrázek 2D2) a dávce 40 Gy (doplněné 10,8 g-L-1 kyseliny máselné) (obrázek 2D3) byly hodnoty pH přibližně 4,6 (ΔpH 1,6 od 6,2), 4,8 (ΔpH 1,4 od 6,2) a 5,9 (ΔpH 0,3 od 6,2). Při ozáření kultury při 114 AMeV a dávce 40 Gy (obr. 2G, kontrola) kleslo pH na přibližně 5,7 (ΔpH 0,6 počínaje hodnotou 6,3), zatímco při dávce 40 Gy (doplněné o 3,6 g-L-1 kyseliny máselné) (obr. 2G1), dávce 40 Gy (doplněné o 7,5 g-L-1 kyseliny máselné) a dávce 40 Gy (doplněné o 7,5 g-L-1 kyseliny máselné) (obr. 2G2) kleslo pH na přibližně 5,7 (ΔpH 0,6 počínaje hodnotou 6,3).2 g-L-1 kyseliny máselné) (obrázek 2G2) a dávce 40 Gy (doplněné 10,8 g-L-1 kyseliny máselné) (obrázek 2G3) byly hodnoty pH přibližně 5,7 (ΔpH 0,6 od 6,3), 5,4 (ΔpH 0,9 od 6,3) a 5,6 (ΔpH 0,7 od 6,3). Při ozáření kultury při 68 AMeV a dávce 20 Gy (doplněné o 7,2 g-L-1 kyseliny máselné) (obr. 2B2) kleslo pH na přibližně 4,4 (ΔpH 0,9 počínaje 6,3), zatímco při dávce 30 Gy (doplněné o 7,2 g-L-1 kyseliny máselné) kleslo pH na přibližně 4,4 (ΔpH 0,9 počínaje 6,3).2 g-L-1 kyseliny máselné) (obrázek 2C2) a dávce 40 Gy (doplněné 7,2 g-L-1 kyseliny máselné) (obrázek 2D2) byly hodnoty pH přibližně 4,6 (ΔpH 1,7 od 6,3), resp. 4,8 (ΔpH 1,5 od 6,3). Při ozáření kultury při 114 AMeV a dávce 40 Gy (doplněné 10,8 g-L-1 kyseliny máselné) (obrázek 2E3) se pH snížilo na 5,9 (ΔpH 0,4 počínaje 6,3), zatímco při dávce 30 Gy (doplněné 10,8 g-L-1 kyseliny máselné) (obrázek 2F3) a dávce 40 Gy (doplněné 10,8 g-L-1 kyseliny máselné) (obrázek 2G3) se hodnoty pH pohybovaly kolem 6.0 (ΔpH 0,3 od 6,3) a 5,8 (ΔpH 0,5 od 6,3).
Časový průběh aktivit divokého typu a ozářených buněk v závislosti na koncentraci přidané kyseliny máselné během prvních 54 h fermentace. (A) Růst buněk kmenů divokého typu, neovlivněný přídavkem butyrátu (kontrolní kultury). (B-D) Růst buněk ozářených kmenů (energie 68 AMeV a dávky 20, 30 a 40 Gy), neovlivněný přídavkem butyrátu (kontrolní kultury). (E,F) Růst buněk ozářených kmenů (energie 114 AMeV a dávky 20, 30 a 40 Gy), neovlivněný přídavkem butyrátu (kontrolní kultury). ( A1-A3) Účinky přidaného butyrátu na růst buněk divokého typu. Jednotlivé dávkové kultury byly prováděny v chemicky definovaném médiu P2 (prováděno v sérových lahvích) obsahujícím glukózu (přibližně 42 g-L-1) a doplněném o 3,6 (A1), 7,2 (A2) a 10,8 g-L-1 (A3) kyseliny máselné. (B1-B3, C1-C3, D1-D3) Vliv přidaného butyrátu na růst ozářených buněk (energie 114 AMeV a dávky 20, 30 a 40 Gy). Jednotlivé dávkové kultury byly prováděny v chemicky definovaném médiu P2 (prováděno v sérových lahvích) obsahujícím glukózu (přibližně 42 g-L-1) a doplněném 3,6 (X1), 7,2 (X2) a 10,8 g-L-1 (X3) kyseliny máselné. (E1-E3, F1-F3, G1-G3) Účinky přidaného butyrátu na růst ozářených buněk (energie 114 AMeV a dávky 20, 30 a 40 Gy). Jednotlivé dávkové kultury byly prováděny v chemicky definovaném médiu P2 (prováděno v sérových lahvích) obsahujícím glukózu (přibližně 42 g-L-1) a doplněném o 3,6 (X1), 7,2 (X2) a 10,8 g-L-1 (X3) kyseliny máselné.
Tyto rozdíly v pH regulují časový přepínač spojený s tvorbou rozpouštědel pro každý ozářený kmen. To naznačuje, že divoký typ a ozářené kmeny vykazovaly dvoufázový metabolický vzorec silně ovlivněný pH média. Obecným trendem je, že buňky zpočátku spotřebovávaly glukózu na podporu růstu a produkovaly a vylučovaly organické kyseliny (butyrát a acetát) jako primární metabolity (acidogeneze), které způsobily pokles pH média, když se nahromadily na určitou úroveň. Toto zvýšení kyselosti bujónu posunulo tvorbu kyselin směrem k produkci rozpouštědel, když kultura dosáhla stacionární fáze růstu buněk (solventogeneze). Při vysokém pH se tvoří především organické kyseliny, zatímco při nízkém pH je stimulována produkce rozpouštědel. Podle očekávání byly povaha metabolického posunu a kinetický vzorec tvorby rozpouštědel závislé na kmeni, vzhledem k tomu, že ozářené kmeny vykazovaly vlastní genetické a metabolické charakteristiky. Již dříve bylo zjištěno, že kyselina máselná inhibuje růst buněk . Výsledky ukázaly, že u kmenů divokého typu docházelo k postupné inhibici buněčného růstu, přičemž při koncentracích kyseliny máselné nad 3,6 g-L-1 nebyl pozorován žádný reálný růst. U ozářených kmenů však k postupné inhibici růstu buněk nedocházelo a při koncentracích kyseliny máselné nad 10,8 g-L-1 nebyl pozorován žádný reálný růst.
Pro podrobnější zkoumání účinku přidaného butyrátu byly porovnány profily růstu buněk (na základě měření OD) u kmenů divokého typu a ozářených kmenů (obr. 2A1-G3) během prvních 54 h fermentace. Je zajímavé, že tolerance kmenů vůči kyselině máselné se výrazně zvýšila, když se zvýšila energie a dávka ozáření 12C6+ ionty. Metabolické dráhy metabolismu glukózy u C. tyrobutyricum ATCC 25755 jsou znázorněny na obrázku 3. Acetyl-CoA, acetoacetyl-CoA a butyryl-CoA jsou tři klíčové meziprodukty, které jsou pro fermentaci zvláště zajímavé s ohledem na možnost tvorby různých produktů během acidogeneze nebo solventogeneze. Tyto meziprodukty jsou důležitými odbočkami, které směřují metabolický tok buď k tvorbě kyselin, nebo k tvorbě rozpouštědel. Posledním klíčovým meziproduktem je butyryl-CoA, který iniciuje tvorbu kyseliny máselné/máselné. Butyrát vzniká postupnou činností PTB a BK . Oba enzymy jsou nejaktivnější během acidogeneze a jejich specifické aktivity klesají během solventogeneze, dvojnásobně u PTB a šestinásobně u Buk . K indukci solventogeneze je obvykle nutná silná závislost aktivity na pH s optimem in vitro při acidogenním pH 5,5 (optimum kolem pH 4,7) a in vivo (endogenním) pH vyšším než 5,5 . Přesto srovnávací analýza těchto grafů jasně odhalila jeden hlavní shluk tvořený kmeny ozářenými při 68 AMeV a 40 Gy a kmeny ozářenými při 114 AMeV a dávkách 30 a 40 Gy. Obě skupiny vykazovaly velmi podobnou celkovou toleranci ke zvyšujícím se koncentracím butyrátu ve srovnání s bakteriemi divokého typu.
Metabolické dráhy metabolismu glukózy u Clostridium tyrobutyricum . Enzymy jsou označeny následujícími písmeny: laktátdehydrogenáza; pyruvát-ferredoxin oxidoreduktáza; NADH-ferredoxin oxidoreduktáza; NADPH-ferredoxin oxidoreduktáza; hydrogenáza; fosfátacetyltransferáza (fosfotransacetyláza); acetátkináza; acetaldehyddehydhydrogenáza; etanoldehydrogenáza; thioláza (acetyl-CoA acetyltransferáza); acetoacetyl-CoA; acetát/butyrát:CoA transferasa; acetoacetát dekarboxylasa; 3-hydroxylbutyryl-CoA dehydrogenasa; krotonasa; butyryl-CoA dehydrogenasa; fosfát butyltransferasa (fosfobutyrylasa); butyrátkinasa.
Vliv ozáření ionty 12C6+ na produkci kyseliny máselné
Produkce kyseliny máselné u ozářených kmenů se výrazně zlepšila jak z hlediska koncentrace konečného produktu, tak z hlediska výtěžku ve srovnání s kmenem divokého typu, jak je uvedeno na obrázku 4B,E. Neozářená (kmen divokého typu, kontrola) kultura C. tyrobutyricum inokulovaná do média s minimem glukózy začala spotřebovávat cukr téměř okamžitě, přičemž produkce kyseliny máselné začala o 12 až 18 hodin později (obr. 4A,B). Stejná kontrolní kultura inokulovaná do klostridiového růstového média (CGM) obsahujícího 60 g-L-1 glukózy potřebovala k aklimatizaci více než 96 h, přestože fermentace ozářených kmenů a kmenů divokého typu byly testovány za stejných podmínek. Prodloužená doba minimálního metabolismu a produktivity je způsobena tím, že záření (různé parametry) způsobilo zpoždění logaritmické fáze buněčného růstu (obr. 4C,F). Tolerance kyseliny máselné u ozářených kmenů byla výrazně zvýšena, což jim umožnilo produkovat více kyseliny máselné, což vedlo k úplnému využití glukózy a produkci více než 32 g-L-1 kyseliny máselné a podobné úrovni buněčné biomasy. Kromě toho se poměr kyseliny máselné ke kontrole zvýšil z 1,0 u kmene divokého typu na 1.52 pro kmeny ozářené při 114 AMeV a 40 Gy, 1,37 pro kmeny ozářené při 114 AMeV a 30 Gy, 1,41 pro kmeny ozářené při 68 AMeV a 40 Gy a 1,31 pro kmeny ozářené při 68 AMeV a 30 Gy. Tento trend naznačuje, že tok uhlíku a energie byl v metabolických drahách ozářených kmenů přerozdělen, což vedlo také k významným změnám v produkci různých fermentačních produktů. Je třeba poznamenat, že produkce kyseliny octové (údaje nejsou uvedeny) se v průběhu fermentace vyrovnala mnohem dříve než produkce butyrátu/másla. Fermentace se zastavily, když buňky již nespotřebovávaly glukózu, protože v bujónu docházelo k hromadění organických kyselin a odpadních produktů, což způsobovalo inhibici růstu buněk a dalších aktivit. Ozářené kmeny však byly vůči kyselině máselné tolerantnější, jak ukazuje mnohem vyšší konečná koncentrace butyrátu dosažená při fermentaci s těmito ozářenými kmeny ve srovnání s divokým typem. To není zcela překvapivé; jak ukazuje obrázek 3, zvýšenou toleranci kyseliny máselné u ozářených kmenů lze také přičíst sníženému toku přes butyrátovou dráhu PTA/AK. Protože ozářené kmeny již nebyly závislé na dráze PTA/AK z hlediska produkce energie a přežití, staly se méně citlivé na inhibici kyseliny máselné .
Srovnání produkce kyselin a sušiny biomasy divokého typu a ozářené C. tyrobutyricum pěstované na glukóze (obsahující 60 g-L-1) v klostridiovém růstovém médiu při 37 °C a pH 5,5 a 6,0 . (A-C) Vliv ozáření ionty 12C6+ (energie 68 AMeV a dávky 20, 30 a 40 Gy) na koncentraci glukózy, produkci kyseliny máselné a hmotnost sušiny biomasy. (D-F) Vliv ozáření ionty 12C6+ (energie 114 AMeV a dávky 20, 30 a 40 Gy) na koncentraci glukózy, produkci kyseliny máselné a hmotnost sušiny biomasy. (G) SDS-PAGE buněčných proteinů z C. tyrobutyricum. Pruh WT: divoký typ; pruh 1: buňky ozářené 68 AMeV a dávkou 30 Gy; pruh 2: buňky ozářené 68 AMeV a dávkou 40 Gy; pruh 3: buňky ozářené 114 AMeV a dávkou 30 Gy; pruh 4: divoký typ a buňky ozářené 114 AMeV a dávkou 40 Gy; pruh MW: markery molekulové hmotnosti proteinů.
Indukce genů ack a pta, které kódují enzymy spojené s cestou tvorby acetátu, výrazně zlepšuje produkci kyseliny máselné . Pro lepší pochopení kinetiky fermentace metabolismu glukózy po vystavení C. tyrobutyricum ozáření 12C6+ ionty a následnému poškození genů ack a pta byla studována a porovnávána exprese proteinů divokého typu a ozářených kmenů. Obrázek 4G ukazuje výsledky z SDS-PAGE. Analýza potvrdila expresi proteinu (molekulová hmotnost přibližně 85 kDa) u čtyř ozářených kmenů, s nejvyšší úrovní exprese proteinu v pruhu 4. Množství přibližně 106 kDa proteinu bylo mnohem vyšší u kmene ozářeného energií 114 AMeV a 40 Gy než u kmene divokého typu. AK a PTA z několika mikroorganismů byly charakterizovány, ale výsledky ukázaly velké rozdíly v jejich molekulové hmotnosti . Proto byly provedeny testy enzymové aktivity za účelem dalšího studia úlohy AK, PTA a PTB v cestách tvorby kyselin (obr. 3). Metabolická selektivita u C. tyrobutyricum je ovlivněna fází růstu, přičemž exponenciálně rostoucí kultury produkují jak kyselinu máselnou, tak octovou, zatímco pomalejší stacionární kultury produkují spíše kyselinu máselnou . Proto byly během růstu v logaritmické fázi každé dávky odebrány vzorky kultury a analyzovány na aktivity PTA, PTB a AK u ozářených a divokých kmenů. Byly stanoveny specifické aktivity enzymů PTA, PTB a AK u ozářených kmenů (různé fyzikální parametry) a jejich relativní aktivity byly porovnány s aktivitami kmene divokého typu. Aktivita AK byla snížena přibližně o 47 % u kmenů ozářených 114 AMeV a 40 Gy, o 31 % u kmenů ozářených 114 AMeV a 30 Gy a o 26 % u kmenů ozářených 68 AMeV a 40 Gy. V porovnání s kmeny divokého typu měly kmeny ozářené při 114 AMeV a 40 Gy nižší aktivitu AK (47 %), ale neočekávaně vyšší aktivitu PTA (129 %), i když podobnou aktivitu PTB. Protože kmeny ozářené při 114 AMeV měly mnohem nižší aktivitu AK, cesta PTA-AK by byla narušena, a proto produkovaly více butyrátu (60 g-L-1) z glukózy než kmeny divokého typu. Jak již bylo zmíněno, tato vylepšení a zlepšení lze přičíst zvýšené toleranci k inhibici butyrátu a do jisté míry sníženému toku uhlíku cestou PTA-AK, o čemž svědčí zvýšený poměr butyrát/acetát u ozářených kmenů.
Vliv ozáření 12C6+ na výtěžek kyselin a růst C. tyrobutyricum
Byl proveden experiment v režimu fermentace s použitím glukosy jako primárního zdroje uhlíku s cílem stanovit schopnost produkce butyrátu u C. tyrobutyricum ATCC 25755 po ozáření. Jak je vidět na obrázku 5A,B, výtěžek kyseliny máselné z glukózy se výrazně zvýšil, a to z 0,43 g-g-1 u kmenů divokého typu na 0,56 g-g-1 u kmene ozářeného při 68 AMeV a dávce 30 Gy, 0.59 g-g-1 pro kmen ozářený při 68 AMeV a dávce 40 Gy, 0,63 g-g-1 pro kmen ozářený při 114 AMeV a dávce 30 Gy a 0,66 g-g-1 pro kmen ozářený při 114 AMeV a dávce 40 Gy. Je třeba poznamenat, že výtěžek butyrátu pro kmen ozářený při 114 AMeV a dávce 40 Gy by byl vyšší (>0,66 g-g-1), pokud by se zanedbala spotřeba glukosy během lag fáze. Kyselina octová produkovaná kmenem ozářeným při 68 AMeV a dávkách 30 a 40 Gy byla podobná jako u divokého typu. Kyselina octová produkovaná kmenem ozářeným při 114 AMeV a dávkách 30 a 40 Gy se však ve srovnání s divokým typem snížila. Jak ukazuje obrázek 5B, výtěžek kyseliny octové z glukózy se také výrazně snížil, a to z přibližně 0,11 g-g-1 u kmene divokého typu na přibližně 0,08 g-g-1 u kmene ozářeného 114 AMeV a 30 Gy a přibližně 0,07 g-g-1 u kmene ozářeného 114 AMeV a 40 Gy. Nicméně poměr butyrát/acetát (g/g) se zvýšil z 3,99 u kmene divokého typu na 5,82 u ozářených kmenů, což je jasný důkaz toho, že metabolické dráhy u ozářených kmenů byly posunuty ve prospěch produkce kyseliny máselné před produkcí kyseliny octové. Jak ukazuje obrázek 3, jelikož aktivity AK a PTA byly u ozářených kmenů výrazně sníženy, muselo být více pyruvátu katabolizováno cestou produkce butyrátu, což vedlo k vyšším výtěžkům butyrátu z glukózy. Kromě toho mohla kyselina máselná také podpořit dřívější přechod na dráhu produkující kyseliny, což se mohlo projevit pomalejší rychlostí růstu. Ze stejného důvodu trpěly ozářené vzorky pomalejší rychlostí růstu, protože bylo produkováno méně ATP z dráhy produkující acetát (PTA-AK), která normálně může generovat více ATP na mol metabolizované glukózy než dráha produkující butyrát (PTB-BK) .
Srovnání produkce kyselin u divokého typu a ozářených buněk C. tyrobutyricum. (A) Produkce kyseliny máselné a kyseliny octové byla odhadnuta ze sklonů lineárních grafů pro buňky divokého typu a buňky ozářené při 68 AMeV a dávkách 30 a 40 Gy. (B) Produkce kyseliny máselné a kyseliny octové byla odhadnuta ze sklonů lineárních grafů pro buňky divokého typu a buňky ozářené při 114 AMeV a dávkách 30 a 40 Gy. (C) Linearizace (integrace) kinetických růstových profilů sušiny biomasy v čase pomocí transformace přirozeného logaritmu. Maximální specifické rychlosti růstu pro buňky divokého typu a ozářené buňky byly vypočteny podle příkladu uvedeného pro buňky ozářené při 114 AMeV a dávce 40 Gy pěstované v růstovém médiu Clostridium obsahujícím 60 g-L-1 glukózy. BDW, hmotnost sušiny biomasy.
Při vysokých počátečních koncentracích glukózy (40, 60, 80 a 120 g-L-1) byl poté určen graf μ max přizpůsobením fermentačních dat předpovědím z modelové simulace. Linearizace (integrace) kinetických profilů růstu sušiny biomasy (BDW) v čase bylo dosaženo pomocí transformace přirozeného logaritmu:
Kde x(t) = koncentrace BDW v každém čase x 0 ; t = počáteční koncentrace BDW; μ max = maximální specifická rychlost růstu (h-1); a specifická rychlost růstu je μ = (1/x(t)). – (dx/dt). Pro účely zjednodušení se předpokládalo, že všechny bakterie se řídí exponenciálním zákonem růstu buněk ve vsádkové kultuře podle kinetického modelu prvního řádu . Specifická rychlost růstu buněk neboli nárůst hmotnosti buněk v čase představuje posun v selektivitě při různých rychlostech růstu, což má významný vliv na proces fermentace . Rychlý růst buněk má vyšší energetické nároky a přednostně produkuje kyselinu octovou. Při nízkých rychlostech růstu se upřednostňuje produkce kyseliny máselné před kyselinou octovou . Při kontinuální fermentaci je produkce butyrátu/kyseliny máselné vyšší, když je μ nižší. Když μ směřuje k nule, dochází k oscilaci produktivity . Tyto rovnice umožňují porovnat rychlost růstu dávkových a kontinuálních systémů v rámci divokého typu a ozářených kmenů.
Model není nezávislý na médiu: použité médium, jak je popsáno výše, ovlivňuje jak rychlost růstu buněk, tak množství produkovaného butyrátu/kyseliny máselné, a rozdílné profily spotřeby glukózy by vedly k různým výsledkům. Pro lepší kvantifikaci optimální koncentrace glukózy pro růst buněk byly pro divoký typ a ozářené kmeny stanoveny maximální specifické rychlosti růstu z kinetických dat získaných z exponenciální fáze růstu a vyneseny do grafu v závislosti na koncentraci přidané glukózy. Jak je vidět na obrázku 5C, maximální specifické rychlosti růstu pro kmeny ozářené při 114 AMeV a dávce 40 Gy byly vypočteny podle příkladu, kdy byl kmen pěstován v médiu CGM obsahujícím 60 g-L-1 glukózy. Byl vybrán nejlepší lineární rozsah datových bodů, který odpovídal exponenciální fázi růstu kmene. V některých případech, kdy nebyl splněn minimální požadavek tří experimentálních datových bodů, bylo použito alternativní vyjádření, které zohledňovalo pouze dva krajní body (na začátku a na konci exponenciální fáze). Sklon přímky (m = μmax) udává maximální specifickou rychlost růstu (0,213 h-1). Model unární lineární regrese (y = 0,2129x – 2,6457) měl upravený koeficient determinace R2 = 0,9765, což znamená, že všechny datové body byly zahrnuty na přímce nejlepší shody a žádný datový bod se od této přímky neodchyloval. Kromě toho byla každá specifická rychlost růstu odhadnuta ze sklonu příslušného semilogaritmického grafu závislosti BDW na čase. Chybové úsečky jsou vyjádřeny jako směrodatná odchylka (SD) získaná z výpočtů každé nezávislé fermentační repliky pro ozářené kmeny a divoký typ (původní údaje nejsou uvedeny). Výsledky ukazují, že tyto ozářené kmeny měly výrazně nižší specifickou rychlost růstu (μ = 0,38 ±0,03 až 0,21 ±0,02 h-1) ve srovnání s divokým typem (μ = 0,38 až 0,42 h-1). Použití ozařování 12C6+ ionty o energii 68 AMeV, 20 až 40 Gy a 106 až 108 iontů-puls-1 vedlo k obzvláště dlouhým fázím zpoždění, které činily 10, 12 a 16 h. Pro srovnání, při použití ozařování ionty 12C6+ při 114 AMeV, 20 až 40 Gy a 106 až 108 iontů-puls-1 byly zpožděné fáze 12, 18 a 24 hodin. Tyto delší lag fáze lze částečně přičíst rozdílným parametrům záření a nízké hustotě inokulace použité při fermentaci. Nižší specifická rychlost růstu u ozářených buněk může být důsledkem metabolického zatížení buněk v důsledku nižšího množství energie generované metabolismem glukózy z důvodu poškození vyvolaného vyšší energií a dávkami. V porovnání s kmeny divokého typu měly kmeny ozářené 20 a 30 Gy při 68 AMeV podobné profily růstu a spotřeby glukózy, s téměř identickou specifickou rychlostí růstu μ = 0,42 ±0.03 h-1, zatímco kmeny ozářené 30 a 40 Gy při 114 AMeV vykazovaly výrazně delší lag fázi, pomalejší spotřebu glukózy a mnohem nižší specifickou rychlost růstu μ = 0,26 ±0,03 h-1 (30 Gy) a μ = 0,21 ±0,02 h-1 (40 Gy).
Jak již bylo uvedeno, acetát je syntetizován prostřednictvím reakcí PTA a AK, přičemž druhá z těchto reakcí poskytuje ATP (obr. 3). Při biosyntéze butyrátu dochází ke kondenzaci dvou molekul acetyl-CoA na acetoacetyl-CoA, po níž následuje redukce na butyryl-CoA, který je poté přeměněn na butyrát prostřednictvím reakcí PTB a BK za vzniku ATP. Nižší specifickou rychlost růstu u ozářených kmenů (energie 114 AMeV a dávky 30 a 40 Gy) lze přičíst metabolické zátěži buněk způsobené menší tvorbou energie (ATP) během metabolismu glukózy v důsledku poškození ack a pta ozářením. BDW z glukózy se u ozářených kmenů rovněž lišila od kmenů divokého typu. Graf závislosti BDW na čase a specifické rychlosti růstu ozářených kmenů naznačil, že tok uhlíku a energie byl u těchto kmenů přerozdělen v rámci všech metabolických drah, což mělo za následek také významné změny v produkci kyselých produktů fermentace.
.