Regulace acetátu a acetyl-CoA během růstu na acetátu a/nebo glukóze u halofilního archeonu Haloarcula marismortui

Abstract

Haloarcula marismortui tvořila acetát během aerobního růstu na glukóze a využívala acetát jako růstový substrát. Na směsích glukózy a acetátu byl pozorován diauxický růst s glukózou jako preferovaným substrátem. Byla analyzována regulace enzymových aktivit souvisejících s metabolismem glukózy a acetátu. Bylo zjištěno, že jak glukózová dehydrogenáza (GDH), tak ADP-tvořící acetyl-CoA-syntáza (ACD) byly v období spotřeby glukózy a tvorby acetátu regulovány nahoru, zatímco AMP-tvořící acetyl-CoA-syntáza (ACS) a malát-syntáza (MS) byly regulovány dolů. Naopak v období spotřeby acetátu byla pozorována zvýšená regulace ACS a MS a snížená regulace ACD a GDH. MS byla rovněž upregulována během růstu na peptidech v nepřítomnosti acetátu. Z těchto údajů vyplývá, že tvorbu acetátu katalyzuje ACD indukovaná glukózou, zatímco aktivaci acetátu katalyzuje ACS indukovaná acetátem; ACS i MS jsou zřejmě indukovány acetátem a potlačovány glukózou.

1 Úvod

Různé halofilní archea, včetně Haloarcula marismortui, rostou na glukóze, která je degradována modifikovanou, semifosforylovanou Entner-Doudorovou (ED) cestou . Bylo prokázáno, že během exponenciálního růstu na glukóze vzniká značné množství acetátu . Nedávné studie naznačují, že tvorba acetátu z acetyl-CoA u halofilních archeí je katalyzována ADP-formující acetyl-CoA syntetázou (ACD) (acetyl-CoA + ADP + Pi⇆ acetát + ATP + CoA). Tato neobvyklá syntetáza byla nalezena u všech acetátotvorných archeí, včetně anaerobních hypertermofilů, a představuje u prokaryot nový mechanismus tvorby acetátu a syntézy ATP. U anaerobních hypertermofilních archeí, např. u Pyrococcus furiosus, představuje ACD hlavní energeticky úspornou reakci při metabolismu cukrů, pyruvátu a peptidů . Na rozdíl od jednoenzymového mechanismu u archeí používají všechny bakterie pro přeměnu acetyl-CoA na acetát „klasický“ dvouenzymový mechanismus zahrnující fosfátacetyltransferázu (PTA) a acetátkinázu (AK) .

Několik haloarchaea, včetně H. marismortui, Haloferax volcanii a Halorubrum saccharovorum, rostou na acetátu jako substrátu. Metabolismus acetátu je zahájen jeho aktivací na acetyl-CoA. Nedávno jsme poskytli první důkaz, že aktivace acetátu na acetyl-CoA u haloarchaea je katalyzována acetyl-CoA syntetázou tvořící AMP (ACS) (acetát + ATP + CoA → acetyl-CoA + AMP + PPi) . ACS je hlavním enzymem aktivace acetátu u většiny organismů využívajících acetát ze všech tří oblastí života . Pouze několik bakterií, např. Corynebacterium glutamicum, a také acetoklastický methanogenní archeon Methanosarcina ssp. aktivují acetát na acetyl-CoA prostřednictvím páru AK/PTA . Dráha AK/PTA tedy může in vivo fungovat reverzibilně, tj. jak ve směru tvorby acetátu, tak i ve směru aktivace acetátu. Naproti tomu první analýzy naznačují, že u haloarchaea ACD, archeální protějšek páru AK/PTA, funguje in vivo ve směru tvorby acetátu, ačkoli enzym katalyzuje reverzibilní reakci in vitro.

Pro další objasnění fyziologické role a získání prvních poznatků o substrátově závislé regulaci enzymů konvertujících acetát a acetyl-CoA u haloarchaea jsme provedli experimenty s posunem substrátu u H. marismortui a analyzovali růst na glukóze, acetátu, směsi glukózy a acetátu a peptidech. Během růstu byly analyzovány profily aktivity enzymů konvertujících acetát a acetyl-CoA, ACD a ACS, a také glukózo-dehydrogenázy, prvního enzymu při degradaci glukózy modifikovanou cestou ED. Kromě toho byly stanoveny aktivity malát syntázy, jednoho z klíčových enzymů glyoxylátového cyklu, u kterého se předpokládá, že působí u haloarchaea.

2 Materiál a metody

2.1 Růst H. marismortui na glukóze, acetátu, směsi glukózy a acetátu a na peptidech

Haloarcula marismortui byla pěstována aerobně při 37 °C na komplexním médiu obsahujícím kvasničný extrakt, kasaminokyseliny a navíc glukózu a/nebo acetát, jak bylo popsáno dříve . Pro růst na směsi glukózy a acetátu bylo toto médium doplněno 12,5 mM glukózy a 30 mM acetátu. Růst peptidů byl prováděn na komplexním médiu za nepřítomnosti acetátu a glukózy. Růstové experimenty byly prováděny ve 2l fermentorech (fairmen tec, Německo) s rychlostí míchání 500 otáček za minutu a průtokem stlačeného vzduchu 600 ml za minutu. Růst byl sledován měřením optické hustoty při 578 nm (ΔOD578). ΔOD578 o hodnotě 1 odpovídala obsahu bílkovin 0,5-0,6 mg/ml. Glukosa a acetát byly stanoveny enzymaticky podle popisu v .

2.2 Příprava buněčných extraktů

V různých růstových fázích byly buňky H. marismortui (100-200 ml kultury) odebrány a buněčné extrakty byly připraveny podle popisu v . Protein byl stanoven Bradfordovou metodou s použitím hovězího sérového albuminu jako standardu.

2.3 Stanovení enzymových aktivit

Všechny enzymové testy byly prováděny za aerobních podmínek při 37 °C v kyvetách naplněných 1 ml testovací směsi. Pomocné enzymy byly zpravidla přidány krátce před zahájením reakce a bylo zajištěno, aby tyto enzymy nebyly limitující pro rychlost. Jedna jednotka (1 U) enzymové aktivity je definována jako 1 μmol spotřebovaného substrátu nebo vytvořeného produktu za minutu.

• Acetyl-CoA syntetáza (tvořící ADP) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) byla měřena podle popisu v kapitole .

• Acetyl-CoA syntetáza (tvořící AMP) (ACS) (E.C. 6.2.1.13).C. 6.2.1.1.) byla sledována jako PPi a AMP dependentní uvolňování HSCoA z acetyl-CoA podle Srere et al. s Ellmanovým thiolovým činidlem, 5′5-dithiobis (2-nitrobenzoovou kyselinou) (DTNB), měřením tvorby thiofenolového aniontu při 412 nm (ε412= 13,6 mM-1 cm-1). Testovací směs obsahovala 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1 mM acetyl-CoA, 2 mM AMP, 2 mM PPi a extrakt.

• Malát syntáza (E.C. 4.1.3.2.) byla sledována v modifikovaném testu podle Serrana a kol. s DTNB. Testovací směs obsahovala 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 0,2 mM acetyl-CoA, 0,5 mM glyoxylát a extrakt.

• Glukóza dehydrogenáza (E.C. 1.1.1.47) byla měřena podle Johnsena et al. .

• Acetátkináza (E.C. 2.7.2.1.) byla měřena podle popisu v .

• Fosfotransacetyláza (E.C. 2.3.1.8.) byla sledována jako Pi závislé uvolňování HSCoA z acetyl-CoA pomocí DTNB . Testovací směs obsahovala 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM acetyl-CoA, 5 mM KH2PO4 a extrakt.

3 Výsledky

Pro zkoumání fyziologické funkce a regulace enzymů souvisejících s metabolismem acetátu a acetyl-CoA byly buňky H. marismortui předpěstované na různých substrátech byly přesunuty na médium obsahující acetát a/nebo glukózu, resp. peptidy, a byly analyzovány profily aktivity ACD, ACS, GDH a MS.

3.1 Růst buněk adaptovaných na acetát na glukóze

Po lag fázi rostly buňky exponenciálně a glukóza byla zcela spotřebována. Souběžně se spotřebou glukózy se tvořilo značné množství acetátu. V tomto období se zvýšily aktivity GDH i ACD, zatímco aktivity ACS a MS, které byly aktivní v buňkách adaptovaných na acetát, se zcela snížily. Ve stacionární fázi byl vyloučený acetát zcela znovu spotřebován a aktivity ACS i MS se zvýšily, zatímco aktivity GDH a ACD se snížily (obr. 1).

3.2 Růst buněk adaptovaných na glukózu na acetátu

Buňky adaptované na glukózu rostly zpočátku (asi 30 h) na médiu obsahujícím acetát s dobou zdvojení 10 h až do optické hustoty (ΔOD578) 1. V této růstové fázi nebyla pozorována spotřeba acetátu a buňky rostly na peptidech přítomných v médiu. Po tomto období rostly buňky se sníženou rychlostí růstu až do ΔOD578 1,8 a acetát byl zcela spotřebován. Během konzumace acetátu se snížily aktivity ACD a GDH, zatímco aktivity ACS a MS, které nebylo možné zjistit u buněk adaptovaných na glukózu, se zvýšily. Zvýšení aktivity MS začalo během růstu na peptidech, zatímco zvýšení aktivity ACS bylo paralelní se spotřebou acetátu (obr. 2).

3.3 Růst na směsi glukózy a acetátu

Buňky H. marismortui adaptované na kvasničný extrakt a kasaminokyseliny byly přeneseny na médium obsahující glukózu i acetát. Buňky vykazovaly diauxický růst s postupným využíváním první glukózy a druhé acetátu. V první růstové fázi buňky rostly až do ΔOD578 4,0 a spotřebovávaly glukózu. Po spotřebování glukózy a krátké lag fázi přešly buňky do druhé růstové fáze, ve které byl metabolizován acetát a buňky rostly na konečnou hodnotu ΔOD578 5,2. V první růstové fázi souběžně s konzumací glukózy se zvýšily aktivity ACD a GDH, zatímco aktivitu ACS nebylo možné zjistit a aktivita MS byla zcela snížena. Ve druhé růstové fázi souběžné s využitím acetátu se zvýšily aktivity ACS a MS a snížily se aktivity ACD a GDH (obr. 3).

3.4 Buňky adaptované na glukózu na peptidech

Buňky adaptované na glukózu byly přesunuty na médium obsahující 0,25 % kvasničného extraktu a 0,5 % kasaminokyselin v nepřítomnosti glukózy i acetátu. Buňky rostly s dobou zdvojení 13 h až do hodnoty ΔOD578 2,5. Tvorbu acetátu se nepodařilo zjistit. Během exponenciálního růstu se ACD (z 60 na 20 mU/mg) a GDH (z 80 na 40 mU/mg) snížily a aktivita MS, kterou zpočátku nebylo možné detekovat, se zvýšila až na 20 mU/mg. Aktivitu ACS nebylo možné detekovat během exponenciální fáze růstu, ale zvýšila se během stacionární fáze (13 mU/mg).

4 Diskuse

V této práci jsme analyzovali fyziologickou úlohu enzymů konvertujících acetát a acetyl-CoA (ACD, ACS) u H. marismortui a podáváme první důkazy o substrátově specifické regulaci těchto enzymů, stejně jako GDH a MS. Údaje jsou diskutovány ve srovnání se známými bakteriálními systémy.

4.1 Tvorba acetátu u H. marismortui je katalyzována ACD jako součást „přetokového“ metabolismu

Během růstu na glukóze a na směsi glukózy a acetátu se aktivita ACD i GDH zvyšovala souběžně s fázemi spotřeby glukózy a tvorby acetátu (obr. 1 a 3). Naopak během růstu na acetátu nebo peptidech obě aktivity klesaly. Tyto údaje a nepřítomnost AK/PTA naznačují, že tvorba acetátu v Haloarcule je katalyzována ACD. Fyziologická úloha tvorby acetátu u H. marismortui a její regulace během aerobního růstu na glukóze není objasněna; tvorba acetátu by mohla být součástí „přelévacího“ metabolismu, který byl podrobně studován u různých bakterií, např. u Escherichia coli a Bacillus subtilis. Stejně jako u H. marismortui obě bakterie vylučují acetát během aerobního růstu na přebytečné glukóze a znovu jej využívají ve stacionární fázi . Předpokládá se, že k vylučování acetátu dochází za podmínek, kdy rychlost glykolýzy převyšuje rychlost následných drah, např. cyklu kyseliny citronové a respirace potřebné k úplné oxidaci glukózy . Za těchto podmínek se acetyl-CoA přeměňuje na acetát a vylučuje se. V souladu s tímto názorem ukazují transkripční analýzy s E. coli i B. subtilis na glukózově specifickou indukci glykolytických genů a represi genů cyklu kyseliny citronové a respirace . Podobná transkripční regulace specifická pro glukózu, tj. upregulace glykolytických genů modifikované Entnerovy-Doudorovy dráhy a downregulace některých genů cyklu kyseliny citronové a dýchání, byla nedávno popsána u halofilního archeonu H. volcanii. U haloarchaea je tedy pravděpodobný metabolismus specifický pro přelévání glukózy, jehož výsledkem je tvorba acetátu. Tvorba acetátu u E. coli a B. subtilis zahrnuje bakteriální dvouenzymový mechanismus prostřednictvím PTA a AK, zatímco u haloarkul je tvorba acetátu katalyzována ACD, tedy archeálním jednoenzymovým mechanismem. U E. coli i B. subtilis bylo zjištěno, že glukóza indukuje geny kódující pta a ack, což ukazuje na koordinovanou regulaci glykolýzy a tvorby acetátu. Transkripční regulace ACD pro tvorbu acetátu u archeonu H. marismortui dosud nebyla analyzována. Koordinovaná regulace aktivity GDH a ACD však naznačuje podobnou transkripční regulaci specifickou pro glukózu jak glykolýzy modifikovanou Entner-Doudorovou cestou, tak tvorby acetátu pomocí ACD.

Při aerobním růstu na peptidech H. marismortui netvořil acetát a aktivita ACD byla snížena. V tomto ohledu se Haloarcula liší od bakterie E. coli, která během aerobního růstu na peptidech vytváří značné množství acetátu v průběhu „přelévacího“ metabolismu . H. marismortui se také liší od anaerobního hypertermofilního archeonu P. furiosus a dalších anaerobních hypertermofilních archeí, které tvoří vysoké množství acetátu pomocí ACD během anaerobního růstu na cukrech i peptidech. Během anaerobní fermentace peptidů a cukrů u P. furiosus představuje tvorba acetátu pomocí ACD hlavní místo tvorby ATP fosforylací na úrovni substrátu ; naproti tomu během aerobní degradace cukrů a peptidů u H. marismortui je většina energie konzervována fosforylací při transportu elektronů v dýchacím řetězci, a proto je tvorba acetátu pomocí ACD méně důležitá nebo postradatelná. Zdá se tedy, že tvorba acetátu ACD u Haloarcula je omezena na metabolismus cukrů v průběhu „přetékajícího“ metabolismu.

4.2 Aktivace acetátu na acetyl-CoA u H. marismortui je katalyzována ACS

To bylo vyvozeno ze zvýšení aktivity ACS souběžně se spotřebou acetátu (obr. 1, 2, 3). Úlohu ACD při aktivaci acetátu bylo možné vyloučit, protože ACD byla v období spotřeby acetátu downregulována. ACD u Haloarcula tedy funguje in vivo pouze ve směru tvorby acetátu. ACD je také nejběžnějším mechanismem aktivace acetátu u bakterií, kde je přísně regulován; např. u E. coli a B. subtilis je gen acs indukován acetátem a potlačován glukózou . U Haloarcula upregulace aktivity ACS acetátem a downregulace glukózou naznačuje podobnou regulaci na transkripční úrovni, jaká byla popsána u bakterií. Je třeba poznamenat, že na rozdíl od E. coli a B. subtilis bakterie C. glutamicum aktivuje acetát acetátem indukovanou cestou AK/PTA .

Aktivita MS, klíčového enzymu glyoxylátového cyklu, byla v období spotřeby acetátu u H. marismortui zvýšena společně s ACS, což naznačuje acetátově specifickou koordinační regulaci ACS a anaplerotického glyoxylátového cyklu. Aktivita MS i ACS byla redukována glukózou. Koordinovaná acetátově specifická indukce genů enzymů aktivace acetátu (viz výše) a glyoxylátové dráhy byla zaznamenána u několika bakterií, včetně E. coli a C. glutamicum. Nedávno byly podány první důkazy o indukci genů pro malát syntázu i isocitrát lyázu acetátem u halofilního archeonu H. volcanii.

Však také aktivita MS spíše než ACS byla regulována během exponenciálního růstu na peptidech v nepřítomnosti acetátu, což naznačuje, že regulace MS je komplexnější a není omezena na acetát. Úlohu MS (a glyoxylátového cyklu) v metabolismu peptidů lze vysvětlit tím, že mnoho aminokyselin je degradováno na acetyl-CoA, což by pro anabolismus vyžadovalo funkční glyoxylátovou dráhu. Zvýšení aktivity ACS, pozorované ve stacionární fázi během růstu na peptidech, nelze zatím vysvětlit, mohlo by být způsobeno obecnou stresovou reakcí buněk ve stacionární fázi .

4.3 Glukózově specifická katabolická represe u H. marismortui

Haloarcula marismortui vykazovala diauxický růst na směsích glukózy a acetátu s glukózou jako preferovaným substrátem, což naznačuje určitý druh katabolické represe využití acetátu glukózou. Katabolitická represe specifická pro glukózu nebyla dosud u archeí analyzována. U bakterií byl molekulární základ katabolitové represe glukózy podrobně studován, např. u E. coli a B. subtilis. Při růstu C. glutamicum na směsi glukózy a acetátu byl popsán monofázický růst se současnou spotřebou acetátu a glukózy, zatímco u Azotobacter vinelandii je preferovaným substrátem acetát. V současné době se zkoumají regulační principy, které stojí za těmito vlastnostmi .

Je třeba provést další studie, aby se na transkripční úrovni doložila navrhovaná substrátově specifická regulace enzymů tvořících acetát a aktivujících acetát, ACD a ACS, ve vztahu k metabolismu acetátu a glukózy. Tyto studie, které vyžadují purifikaci a identifikaci kódujících genů ACD a ACS z H. marismortui, probíhají.

Poznámky autora