Rekombinantní léčiva z mikrobiálních buněk: aktualizace z roku 2015

Buněčné továrny

Od prvních dob rekombinantní DNA umožnilo stále lepší porozumění fyziologii buněk a stresu a faktorům, které se podílejí na heterologní genové expresi a produkci proteinů, používat různé živé továrny, a to prokaryotické a eukaryotické buňky, rostliny nebo zvířata. Pomocí těchto systémů rekombinantní výroba řeší problémy s dostupností zdrojů, je považována za biologicky bezpečný a ekologický proces a poskytuje možnost modifikovat sekvence aminokyselin, a tedy i funkci bílkovin, aby se produkt lépe přizpůsobil požadované funkci . Existuje široké a stále rostoucí spektrum expresních systémů, které se stávají dostupnými pro výrobu rekombinantních proteinů . Při vzniku biofarmaceutického odvětví v 80. letech 20. století byla převládající platformou Escherichia coli a po ní následovalo zavedení kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Oba systémy a související genetické metodiky vykazují neobyčejně vysokou univerzálnost, díky níž jsou přizpůsobitelné různým požadavkům na výrobu . Navzdory zkoumání hmyzích buněk jako původně úspěšného systému zejména pro proteiny zaměřené na vakcíny jsou v současné době převládajícím buněčným systémem živočišného původu savčí buněčné linie (zejména buňky CHO) díky jejich vhodnosti pro pohodlnou produkci glykosylovaných proteinů (obr. 1). Schopnost provádět posttranslační modifikace kontrastuje se složitými nutričními požadavky, pomalým růstem a křehkostí a relativně vysokou časovou náročností a náklady na výrobu. Z mnoha konvenčních i nově vznikajících buněčných systémů pro produkci proteinů jsou tedy v biofarmacii nejrozšířenější bakterie, kvasinky a savčí buněčné linie a jak prokaryotické, tak eukaryotické systémy se neustále vyvíjejí a soutěží o zlepšení svých vlastností a zintenzivnění jako platformy volby pro produkci proteinových léčiv . Ačkoli bakterie ztratily svou počáteční vedoucí úlohu v této oblasti , přibližně 30 % biofarmak uváděných na trh se stále vyrábí v tomto systému , což podporuje neobvyklá fyziologická a genetická manipulovatelnost prokaryotických buněk .

V podstatě hlavním cílem při vývoji nových platforem pro výrobu proteinů je zvýšit funkčnost léčiv prostřednictvím dosažení úspěšného skládání proteinů a posttranslačních modifikací při zachování nízké složitosti a vysoké flexibility spojené s prokaryotickou buněčnou kulturou. V této souvislosti grampozitivní bakterie, jako jsou Bacillus megaterium a Lactococcus lactis, umožňují účinnou sekreci proteinů za nepřítomnosti endotoxických složek buněčné stěny, zatímco vláknité houby (jako Trichoderma reesei, ), mechy (Physcomitrella patens, ) a prvoci (Leishmania tarentolae, ) podporují glykosylační vzorce podobné těm v savčích proteinech, ale stále jsou kultivovány pomocí metod jednodušších, než jaké vyžadují savčí buňky. Rozsáhlé popisy nově vznikajících (bakteriálních i nebakteriálních) platforem určených speciálně pro výrobu vysoce kvalitních proteinových léčiv lze nalézt jinde . Nedávný vývoj bezendotoxinového kmene E. coli a jeho použití k výrobě proteinů a proteinových materiálů otevírá cestu k nákladově efektivní a všestranné výrobě proteinů určených pro biomedicínské použití tím, že se vynechají kroky k odstranění endotoxinu, čímž se zvýší biologická bezpečnost a sníží výrobní náklady . Doufejme, že všechny tyto nové systémy brzy nabídnou zdokonalené produkty v dosud jednoduchých a plně kontrolovaných biofabrikačních přístupech.

Trendy v oblasti bílkovinných biofarmak

Blízko 400 produktů na bázi rekombinantních bílkovin bylo úspěšně vyrobeno a je schváleno jako biofarmaka , což je termín, který označuje terapeutické produkty vytvořené technologiemi, které zahrnují živé organismy . Dalších 1300 proteinových kandidátů je ve vývoji, z nichž přibližně 50 % je v předklinických studiích a dalších 33 % v klinických studiích (obr. 2). V této souvislosti lze v příštích letech očekávat nárůst počtu schválení. Humulin, rekombinantní lidský inzulin vyrobený v bakterii E. coli , vyvinutý společností Eli Lilly & Co v 70. letech, byl prvním schváleným biofarmakem (úřadem FDA) v roce 1982. Další přírodní proteiny, jako jsou hormony, cytokiny a protilátky (Orthoclone OKT3), byly mezi devíti jedinými produkty schválenými v 80. letech (tabulka 1). V současné době jsou terapeutickými oblastmi, které z rekombinantních biofarmak těží více, metabolické poruchy (např. diabetes 1. a 2. typu, obezita nebo hypoglykémie), hematologické poruchy (např. anémie ledvin, hemofilie A, poruchy krvácení nebo srážlivosti krve) a onkologie (např. melanom, rakovina prsu nebo tlustého střeva) s 24, 18 a 15 % schválených přípravků (obr. 3). V tomto ohledu je onkologie jednoznačně expandujícím trhem. V období 2010-2014 bylo 9 z 54 schválených biofarmak protinádorovými léčivy, přičemž rakovina představovala v tomto období nejčastější indikaci. Pokud se podíváme na molekulární základy biofarmak, je patrný jasný trend směrem k přípravkům na bázi protilátek. Ve stejném období (2010-2014) bylo 17 z 54 schválených proteinových léčiv monoklonálními protilátkami (31,5 %), zatímco v období 1980-1989 to bylo 11 % . Navíc mezi deseti nejprodávanějšími proteinovými biofarmaky na světě v roce 2014 (tabulka 2) je šest protilátek nebo proteinů odvozených od protilátek (Humira, Remicade, Rituxan, Enbrel, Avastin, Herceptin; http://qz.com/349929/best-selling-drugs-in-the-world/).

Dříve, biofarmaceutika byly rekombinantní verze přírodních proteinů se stejnou sekvencí aminokyselin jako příslušné nativní verze (pouze s drobnými úpravami, často vyplývajícími ze strategie klonování). Od 90. let 20. století je významná část schválení založena na vysoce modifikovaných formách rekombinantních proteinů. Tato nová alternativa založená na fúzi proteinů nebo domén a na zkrácených verzích nabízí široké spektrum možných kombinací pro získání nových biofarmak s různými spojenými aktivitami, které se v přírodě společně nevyskytují.

Bílkovinná léčiva pro léčbu rakoviny

Onkologie je jednou z terapeutických indikací, které dominují biofarmaceutickému trhu, protože rakovina je celosvětově hlavní příčinou morbidity a mortality. Chirurgie a radioterapie jsou účinné při léčbě rakoviny v časných stádiích onemocnění; nedokážou však vymýtit metastatické onemocnění. Přítomnost mikrometastáz nebo klinicky zjevných metastáz při diagnóze vyžaduje jejich použití v kombinaci s genotoxickou chemoterapií ke zvýšení míry vyléčení . Nicméně úspěchu chemoterapie brání její nedostatečná selektivita a specifičnost, takže toxicita pro normální tkáně omezuje dávky, které by mohly být pacientům podávány. Vývoj biofarmak schopných inhibovat specifické molekulární cíle pohánějící rakovinu (například monoklonální protilátky anti-Her2-Trastuzumab- nebo anti-VEGF-Bevacizumab-) jde tímto směrem .

Mezi proteinovými biofarmaky uváděnými na trh se téměř 24 % (94 produktů) používá v protinádorové terapii. Většina těchto přípravků se používá pro podpůrné účely určené k minimalizaci vedlejších účinků chemoterapie, obvykle neutropenie nebo anémie (některé reprezentativní příklady jsou uvedeny v tabulce 3). Devatenáct z těchto 94 produktů jsou skutečná protinádorová léčiva, z nichž 69 % se vyrábí v E. coli (obr. 4) a jsou založena na upravených aminokyselinových sekvencích, proteinových fúzích a jednotlivých proteinových doménách (tab. 4).

Jasně, modifikované verze proteinů jsou v protinádorové terapii nejrozšířenější oproti přirozeným polypeptidům. Jako relevantní příklady lze uvést aflibercept Ziv, což je rekombinantní fúzní protein vyráběný v buňkách CHO, který se používá proti kolorektálnímu karcinomu. Skládá se z částí jednotlivých receptorů vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGFR1 a VEGFR2) fúzovaných s konstantní frakcí (Fc) lidského imunoglobulinu IgG1 (obr. 5). Tento konstrukt funguje jako návnada tím, že se váže na VEGF-A, VEGF-B a placentární růstový faktor (PlGF), které aktivují VEGFR. Tato past brání interakci mezi růstovými faktory a receptory, čímž inhibuje dráhu VEGF, která se podílí na angiogenním procesu . Denileukin diftitox je rekombinantní protein složený ze dvou fragmentů difterického toxinu (A a B) a lidského interleukinu-2 (obr. 5). Difteriový toxin je silný exotoxin vylučovaný bakterií Corynebacterium diphteriae. Díky své zvláštní struktuře je celý komplex produkovaný v E. coli schopen dopravit cytotoxickou látku přímo na specifický cíl. Existují dva hlavní aktivní bloky, jejichž funkcí je jednak selektivně doručit biofarmakum (IL-2) a jednak způsobit cytotoxicitu (toxin A a B). Fúzní protein se váže na receptor IL-2, který je exprimován v nádorových buňkách (kožní T-buněčný lymfom). Jakmile je toxinová část internalizována, katalytická doména podporuje buněčnou smrt prostřednictvím inhibice syntézy proteinů .

Jelikož je cílené podávání léčiv pro rakovinu nejnovější a stále se rozšiřující oblastí výzkumu, jsou silně zastoupena i další nerekombinantní biofarmaka na bázi proteinů. Ty zahrnují především konjugáty protilátka-lék (ADC), jako je brentuximab vedotin, trastuzumab emtansin, nebo konjugáty nanočástice-lék, jako je nab-paklitaxel . V těchto případech funguje proteinový protějšek jako cílený nosič konvenčních chemických léčiv. Tento přístup opět sleduje selektivní doručení léčiva do specifických cílových buněk, jehož cílem je zvýšit protinádorovou aktivitu a zároveň snížit toxicitu na normální buňky a s tím spojené vedlejší účinky.

Produkty proti rakovině, které v roce 2013 zajistily nejvyšší příjmy, jsou znázorněny na obr. 6. Šedesát procent těchto produktů tvoří rekombinantní proteiny, což podporuje myšlenku, že výroba rekombinantních proteinů je stále rostoucí a slibnou platformou, která nabízí prostor pro významný pokrok v biofarmaceutickém sektoru.

.