RNA produkující DNA hydrogel jako platforma pro vysoce výkonný RNA interferenční systém

Syntéza a charakterizace I-gelu

Čtyři oligonukleotidy X-DNA (X01-X04 DNA vlákna) byly komerčně syntetizovány společností Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA). Sekvence X-DNA (doplňková tabulka 5) byly navrženy, připraveny a charakterizovány podle stejných postupů, jaké jsou s drobnými úpravami popsány v literatuře10,13 . Lyofilizovaná vlákna DNA v měřítku 1 μmol byla získána centrifugací při 14 000 g po dobu 15 s při pokojové teplotě. Každé vlákno DNA bylo resuspendováno na koncentraci 1,0 mM v pufru 1x TE (pH 8,0). Každá zkumavka byla protřepána a promíchána pomocí MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, USA) při 1500 otáčkách za minutu po dobu ~3 h, aby se lyofilizované oligonukleotidy zcela rozpustily. Celkem 0,05 μmol (50 μl) každého vlákna DNA bylo spojeno do 1,5 ml zkumavky a byla přidána voda bez nukleázy s celkovým objemem směsi oligonukleotidů 500 μl. Do 0,5 ml zkumavek bylo rozděleno 100 μl směsi oligonukleotidů. Zkumavky byly umístěny do termocykléru (Bio-Rad, CA, USA). Čtyři typy oligonukleotidů (X01 ~04) byly žíhány za následujících podmínek: počáteční denaturace při 95 °C po dobu 10 min; a 65 °C po dobu 2 min, 60 °C po dobu 5,5 min, snížení o 1 °C udržování 1 min při této teplotě, 20 °C po dobu 30 s a snížení na 4 °C pro stabilizaci a skladování X-DNA. Poté se pro výměnu pufru žíhaný roztok X-DNA (500 μl) ve filtrační jednotce (mezní hodnota Mw 3 kDa) pro mikrocentrifugaci odstřeďoval 6 h při 15 000 g a 4 °C, aby se zmenšil objem rozpouštědla. Filtrační jednotka byla přenesena do čerstvé centrifugační zkumavky. Do filtrační jednotky bylo přidáno celkem 100 μl vody bez nukleázy o teplotě 4 °C. Filtrační jednotka se odstřeďovala 4 h při 15 000 g a 4 °C, aby se X-DNA opláchla od zbylých solí. Odříznutý filtrační modul se vložil do zkumavky dnem vzhůru a centrifugoval se při 2000 g po dobu 3 min při 4 °C. Přidání vody bez nukleázy a odstředění se provedlo ještě dvakrát za použití stejné odstředivky, aby se zcela odstranily zbytkové soli X-DNA. Konečný objem roztoku X-DNA bude ~300 μl. Expresní plazmid siRNA (I-plasmid) byl zakoupen a maximálně připraven společností Cosmo Genetech (Soul, Jižní Korea). Pro konstrukci I-plazmidů byly I-plazmidy linearizovány pomocí restrikčního enzymu BamHI. Velikost genu siRNA byla 66 bp se spacerem (nebo 498 bp s promotorem T7) (mapu I-plazmidu viz doplňkový obrázek 4). Množství DNA ve vzorcích bylo určeno z jejich UV/Vis absorpční hodnoty pomocí spektrometru BioSpectrometer (Eppendorf, Hamburg, Německo). X-DNA a lineární plazmidy byly nejprve smíchány v předem stanoveném molárním poměru v přítomnosti T4 DNA ligázy (Promega, Madison, WI, USA) za účelem syntézy Dgel. Pro poměr X-DNA:I-plazmid 1500:1 jsme použili 10,5 μl 75 μM X-DNA a 5,25 μl 100 nM plazmidu v reakčním objemu 30 μl. Při experimentu s Blankovým gelem bylo stejné množství materiálu X-DNA jako v I-gelu ligováno pomocí T4 DNA ligázy. 10 μl každého vzorku bylo smícháno s 2 μl gelového nakládacího pufru a elektroforetizováno na 0,7 nebo 2% agarózovém gelu při 100 V po dobu 60 minut. Všechny DNA (X-DNA, I-plazmid, Blank-gel a I-gel) byly potvrzeny elektroforézou v agarózovém gelu (doplňkové obrázky 3, 11, 18). Syntetizované Dgely byly dvakrát odsoleny pomocí mikrotubulárních odstředivých filtrů Amicon s mezní hodnotou Mw 3 kDa. Pro zobrazení skenovací elektronovou mikroskopií (SEM) byly vzorky sušeny mrazem v lyofilizátoru FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA), dokud nebyla odstraněna veškerá voda. Vysušené vzorky byly rozlomeny, aby se odhalil jejich čerstvý povrch. Po naprašování 2~3nm vrstvou Pt po dobu 100 s byla morfologie těchto hydrogelových povrchů pozorována při ~50 000× zvětšení pomocí skenovacího elektronového mikroskopu S-3500N (Hitachi, Tokio, Japonsko) při urychlovacím napětí 15 kV (doplňkový obrázek 19).

Test stability I-gelu

Pro každý z volných I-plazmidů a I-gelů bylo připraveno sedm vzorků. V každém vzorku byly 2 µl volného I-plazmidu (57 ng) nebo I-gelu (1:1500 gel obsahující 57 ng I-plazmidu) zředěny ve 12 µl destilované vody, poté byly přidány 4 µl transkripčního optimalizovaného 5× pufru a ošetřeny 3,33 × 10-5 jednotkami DNázy I (č. M6101; Promega) na 20 µl konečného objemu, následovala inkubace při 37 °C po dobu 0, 1, 4, 12, 24 a 48 hodin. Po inkubaci byly 20 µl vzorky rozděleny do dvou 10 µl alikvotů, jednoho pro elektroforézu a druhého pro následnou transkripci. V každém z alikvotů byla denaturační reakce ukončena přidáním 1 µl roztoku RQ1 DNase stop a inkubací po dobu 10 min při 65 °C. Poté bylo 10 µl každého vzorku smícháno s 2 µl gelového nakládacího pufru a elektroforetizováno na 2% agarózovém gelu při 100 V po dobu 60 min (doplňkový obrázek 13). Další alikvot každého vzorku byl použit pro transkripční reakci, aby se prokázala účinnost transkripce I-gelu po reakci štěpení. shRNA byly transkribovány z I-gelu nebo volných I-plazmidových templátů (0, 24, 48 h) pomocí transkripčního kitu (Riboprobe; Promega) podle pokynů výrobce. Získané shRNA byly kvantifikovány pomocí RT-qPCR, jak je popsáno v oddílech Příprava celkové RNA a reverzní transkripce a PCR v reálném čase a analýza dat (doplňková tabulka 4).

Expresní a inhibiční analýzy proteinů

Soupravy pro spojenou transkripci a translaci (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, katalogové číslo 88882) byly zakoupeny od společnosti Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) a reakce byly provedeny podle postupů navržených výrobcem. Stručně řečeno, lyzát HeLa buněk, akcesorní proteiny, reakční směs a plazmid pcDNA3.1( + ) IRES GFP (0,5 μg/μl; č. 51406; Addgene, Cambridge, MA, USA) byly smíchány v poměru 12,5:2. V reakční směsi byly použity bílkoviny a plazmidy.5:5:2 (v/v) a inkubovány při 30 °C po dobu 1, 2, 4 a 6 h. Po uvedených reakčních dobách byly roztoky vzorků inkubovány 24 h při 4 °C, aby se reakce zastavila a zároveň se zajistil dostatečný čas na složení proteinu. Pro vyhodnocení účinnosti interference byl k buněčnému lyzátu přidán volný I-plazmid nebo I-gel v přítomnosti 1000 ng GFP plazmidu. V kontrolních pokusech pro optimalizované podmínky I-gelu obsahujícího 57 ng I-plazmidu (17,5 nmol), zakódovanou shRNA (17,5 nmol a 1,75 μmol; 1 eq a 100 eq k množství I-plazmidu, v uvedeném pořadí) (SN-1003; Bioneer, Soul, Korea), směs zakódovaného plazmidu (17.5 nmol; směs expresních plazmidů se scrambled shRNA; Cosmo Genetech), scrambled plasmid gel (směs scrambled plasmidů enzymaticky zesíťovaná s X-DNA), složka I-gelu (pouze X-DNA, pouze I-plazmid nebo tato směs bez enzymatického zesíťování; tj. bez tvorby gelu) nebo Blank-gel (enzymatické zesíťování pouze X-DNA) byly přidány přímo do reakčního roztoku pro expresi GFP. Všechny reakce byly provedeny nejméně třikrát. Pokud není uvedeno jinak, byl objem reakce 25 μl. Fluorescenční spektra byla analyzována pomocí spektrofluorografického přístroje (FluoroMate FS-2; SCINCO Co., Ltd., Seoul, Korea) pro stanovení úrovně exprese GFP v roztoku buněčného lyzátu.

Příprava celkové RNA a reverzní transkripce

Jako spike-in kontrola byly před extrakcí RNA přidány 3 μl cel-miR-39 (33 fmol/µl; č. 59000; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Kanada) ke všem preexprimovaným buněčným lyzátům (20 μl). Poté byla celková RNA extrahována z 23 µl lyzátu pomocí činidla TRIzol (Ambion, Thermo Fisher Scientific) podle pokynů výrobce. Extrahovaná celková RNA byla rozpuštěna v 10 µl vody ošetřené DEPC (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Poté byly 2 µl celkové RNA polyadenylovány pomocí 1 mM ATP v 1× poly(A) polymerázovém pufru obsahujícím 5 U Escherichia coli poly(A) polymerázy (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) při 37 °C po dobu 30 min ve 20 µl reakční směsi. Pro reverzní transkripci byly 4 µl RNA s ocáskem smíchány s 1 pmol RT primeru a 0,5 mM směsí dNTP a poté doplněny na objem 13 µl vodou ošetřenou DEPC. Směs byla zahřívána při 65 °C po dobu 5 minut a poté rychle zchlazena na ledu. Reakční směs byla poté doplněna na konečný objem 20 µl přidáním 5 mM dithiothreitolu, 1× pufru pro první řetězec, 40 U inhibitoru RNázy a 200 U SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a inkubována při 50 °C po dobu 1 h, poté následovala inaktivace enzymu při 70 °C po dobu 15 min. Pro syntézu cDNA ze sekvence RNA byly navrženy sekvence RT primerů (viz doplňková tabulka 5). Byl použit 3′ RACE adaptér, který je součástí soupravy FirstChoice RLM-RACE (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Všechny primery byly syntetizovány společností Cosmo Genetech, s výjimkou dopředného primeru cel-miR-39 (Norgen Biotek Corp.). Míra výtěžnosti RNA v každém roztoku lyzátu byla odhadnuta z rozdílu mezi hodnotou CT získané kontroly spike-in a referenční cel-miR-39 (neproběhl proces extrakce).

Real-time PCR a analýza dat

Množství shRNA a GFP mRNA bylo kvantifikováno pomocí qPCR s použitím systému StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). qPCR každého vzorku byla provedena v celkovém objemu 20 µl s 2 µl cDNA, 10 µl 2× Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) a 10 pmol každého primeru. Amplifikace byla provedena za následujících podmínek: počáteční denaturace při 95 °C po dobu 10 min a 30 cyklů při 95 °C po dobu 15 s, 60 °C po dobu 30 s a 72 °C po dobu 30 s. qPCR byla provedena také s cel-miR-39 jako referenční RNA, aby se získala míra výtěžnosti celkové RNA v každém vzorku. Protokol qPCR byl stejný jako protokol popsaný výše v této části, s výjimkou použitých primerů, což bylo 10 pmol běžného reverzního primeru (stejného jako reverzní primer shRNA) a přímého primeru cel-miR-39. Křivka tání každého amplifikovaného produktu DNA byla získána měřením změny intenzity fluorescence barviva SYBR Green šestkrát pro každý vzorek při zvyšování teploty z 60 °C na 95 °C rychlostí + 0,3 °C/s po dokončení qPCR. Specifické primery pro qPCR byly navrženy pomocí programu Primer3 (http://primer3.ut.ee/) (doplňková tabulka 5). Relativní exprese cílů byla stanovena pomocí srovnávací metody 2-ΔΔCT. Relativní množství mRNA GFP bylo rovněž potvrzeno měřením intenzity pásů na 2% agarózovém gelu. Amplifikace cDNA byla provedena za stejných podmínek PCR a se stejným programem, jaké byly použity pro qPCR popsanou výše, s výjimkou počtu cyklů PCR (20 pro GFP mRNA).

Kalibrace a kvantifikace absolutního množství RNA

Standardní křivky pro koncentraci RNA a hodnotu CT byly získány pomocí každého standardního materiálu RNA. Pro shRNA byla standardní křivka získána použitím syntetizovaných shRNA zakoupených od společnosti Integrated DNA Technologies. Pro mRNA GFP byla křivka získána pomocí mRNA GFP extrahované z transkripční soupravy (Riboprobe; Promega) podle pokynů výrobce. O množství RNA standardní shRNA informovala společnost Integrated DNA Technologies, zatímco množství extrahované standardní GFP mRNA bylo určeno z hodnoty její UV/Vis absorpce pomocí spektrometru BioSpectrometer. Získané standardní RNA byly převedeny na cDNA reverzní transkripcí, jak je popsáno výše v části „Příprava celkové RNA a reverzní transkripce“. Poté byla cDNA naředěna 10, 100, 1000 a 10 000krát a následně byla qPCR třikrát opakována a získané hodnoty TK byly použity k získání standardní křivky. Hodnoty CT získané z RT-qPCR byly převedeny na počáteční koncentrace RNA v buněčných lyzátech pomocí kalibračního procesu (doplňkový obrázek 6). Konečné absolutní množství RNA bylo stanoveno vynásobením každé míry výtěžnosti RNA (%) a hodnoty množství RNA z kalibrační křivky (doplňkové tabulky 1, 2).

Buněčné značení pomocí Cy5-I-gelu

Buňky Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) byly získány z Korea Cell Line Bank (Soul, Korea) a udržovány v DMEM doplněném 10% fetálním hovězím sérem a 1% penicilinem-streptomycinem ve vlhkém inkubátoru s udržovanou koncentrací CO2 (5%). Buňky MDCK exprimující GFP (MDCK-GFP) byly připraveny transfekcí vektoru pEGFP-N1 do buněk pomocí činidel Lipofectamine (Thermo Fisher Scientific) podle protokolu výrobce. Poté jsme buňky emitující GFP roztřídili pomocí systému FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Po celou dobu výzkumu byly buňky negativně testovány na kontaminaci mykoplasmaty. Kultivované MDCK-GFP buňky ve 24jamkových destičkách s krycími sklíčky (50 000 buněk v každé jamce) byly koinkubovány s Cy5-I-gelem (Cy5-konjugovaný I-gel) obsahujícím Cy5-konjugované řetězce sekvence X01 DNA (odpovídající 2,625 μM X-DNA; Integrated DNA Technologies) v médiu bez séra po dobu 4 hodin. Pro přípravu Cy5-I-plazmidu byla nejprve připravena Cy5-dsDNA (Cy5-konjugovaná dsDNA) annealováním Cy5-konjugované X01 (s dodatečným 5′-p-GATC lepivým koncem) a jejího komplementárního protiřetězce (5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′). Poté byly Cy5-dsDNA a I-plasmid smíchány a ligovány v molárním poměru 5000:1. Přebytečná nenavázaná Cy5-dsDNA byla odstraněna centrifugací (12 400 g, 4 °C, 60 min) pomocí mikrotubulárních centrifugačních filtrů Amicon (mezní hodnota Mw 50 kDa) po dobu 4-5krát. Cy5-shRNA (shRNA konjugovaná s Cy5) byla komerčně syntetizována (Integrated DNA Technologies). Pro sady Cy5-I-plazmid a Cy5-shRNA byly buňky koinkubovány s 2,625 nM každého vzorku v médiu bez séra po dobu 4 h. Pro sady Lipofectamin-Cy5-I-plazmid a Lipofectamin-Cy5-shRNA byly Lipofectamin a vzorek konjugovaný s Cy5 elektrostaticky komplexovány jejich smícháním v molárním poměru 1:1 na konečnou koncentraci roztoku 2,625 μM Lipofectaminu a 2,625 μM substrátu. Poté byly buňky koinkubovány s 2,625 μM Lipofectamine-Cy5-I-plasmidem nebo Lipofectamine-Cy5-shRNA v médiu bez séra po dobu 4 hodin. V případě kontroly pouze s buňkami byly buňky koinkubovány s bezsérovým DMEM obsahujícím 1 % (v/v) penicilinu (HyClone). Po 4 h koinkubace byly všechny vzorky dvakrát promyty pufrem s fosfátovým roztokem (PBS) (0,1 M, pH 7,4) a buňky byly dále inkubovány 6 h v růstovém médiu obsahujícím 10 % (v/v) fetálního hovězího séra (FBS; HyClone) a 1 % penicilinu, aby byla zajištěna dostatečná doba obnovy a absorpce buněk. Kultivované buňky byly fixovány 4% formaldehydem po dobu 10 minut při pokojové teplotě a dále třikrát promyty pufrem PBS (0,1 M, pH 7,4). Pro zobrazování v mikroskopu byly krycí sklíčka s připojenými buňkami připevněny na skleněná sklíčka pomocí vodného montážního média s přípravkem proti vyblednutí. Fluorescenční snímky byly zaznamenány pomocí mikroskopu Zeiss Axioplan 2 a fotografie byly pořízeny pomocí kamery Zeiss Axiocam HR.

Pokus s umlčením genu GFP pomocí I-gelu

Nejprve byl I-gel obsahující 262,5 µM X-DNA a 175 nM I-plazmidu inkubován s 300 U polymerázy T7 RNA (Thermo Fisher Scientific) po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Po inkubaci byl vzorek I-gelu naředěn 100krát v bezsérovém DMEM obsahujícím 1 % penicilinu. Poté byl 1/6 objemu komplexu I-gel/polymeráza přidán do každé jamky 24jamkové destičky s krycím sklíčkem, která byla předem osazena buňkami MDCK-GFP (20 000 buněk na jamku) po dobu 24 h. Pro sady I-plazmidu, směsi zakódovaného plazmidu a zakódovaného plazmidu v gelu byly buňky MDCK-GFP společně kultivovány se stejným molárním množstvím každého plazmidu a polymerázy T7 RNA jako v případě I-gelu. Pro měření účinku RNAi nahé shRNA a Lipofectamine-shRNA bylo použito 100krát více každého vzorku RNA vzhledem k počtu templátu I-plazmidu, přičemž byla zohledněna míra exprese shRNA I-gelu vypočtená z experimentu s buněčným lyzátem. Pro sady nahé shRNA a kódované shRNA byly buňky MDCK-GFP koinkubovány se 175 nM vzorku RNA. Vzorky s lipofektaminem byly připraveny podle pokynů výrobce. Pro směsné sady Lipofectamine-I-plasmid a Lipofectamine-scrambled plasmid byly Lipofectamin a každý vzorek plasmidu elektrostaticky komplexovány jejich smícháním v molárním poměru 5:1, aby se dosáhlo konečné koncentrace roztoku 8,75 nM Lipofectaminu a 1,75 nM substrátu plasmidu. Pro sadu Lipofectamin-shRNA byly Lipofectamin a volná shRNA elektrostaticky komplexovány jejich smícháním v molárním poměru 5:1, aby se získala konečná koncentrace roztoku 875 nM Lipofectaminu a 175 nM shRNA. Buňky MDCK-GFP byly koinkubovány s takto připravenými vzorky s Lipofectaminem v médiu bez séra po dobu 4 h. V případě sady pouze pro buňky byly pouze buňky MDCK-GFP inkubovány v médiu bez séra po dobu 4 h bez jakýchkoli vzorků. Všechny vzorky byly po 4 h koinkubaci vymyty a buňky byly navíc inkubovány 48 h s růstovým médiem (DMEM obsahujícím 10 % (v/s) FBS a 1 % penicilinu) pro vyhodnocení účinku RNA-silencingu při 37 °C a 5 % CO2. Poté byly buňky fixovány 4% formaldehydem po dobu 10 min při pokojové teplotě a promyty pufrem PBS (0,1 M, pH 7,4). Pro zobrazování v mikroskopu byly buňky připevněné na krycím sklíčku připevněny na skleněná sklíčka pomocí vodného montážního média s přípravkem proti vyblednutí.

Analýza genové exprese pomocí kvantitativní PCR v živých buňkách

Všechny vzorky byly ošetřeny a inkubovány v každém buněčném médiu ve stejném množství a za stejných podmínek, jaké byly použity v dříve popsaném experimentu s oslabením genu GFP pomocí sekce I-gel. Po inkubaci bylo buněčné médium odsáto z destiček s buněčnými kulturami a buňky MDCK-GFP byly jednou promyty pufrem PBS a trypsinizovány, aby se oddělily buňky v každé jamce destičky. Oddělené buňky byly zředěny pufrem PBS, aby se deaktivoval trypsin, a poté byly shromážděny do 1,5 ml mikrozkumavky a peletovány centrifugací (180 g, 5 min). Supernatant byl odstraněn a buňky byly zředěny 20 µl PBS pufru. Roztok buněčné suspenze (20 µl) byl ošetřen 1 ml činidla TRIzol, 3 µl cel-miR-39 (33 fmol/µl) a 200 µl roztoku chloroformu. Následná extrakce RNA byla provedena podle pokynů výrobce. Pro kvantifikaci relativního množství mRNA GFP a shRNA na buněčné úrovni byly všechny qPCR preparátů vzorků provedeny stejným způsobem, jak je popsáno v oddílech „Příprava celkové RNA a reverzní transkripce“ a „PCR v reálném čase a analýza dat“.

Analýza buněčného obrazu pro kvantifikaci intenzity pixelů

Zpracování buněčného obrazu bylo provedeno pomocí programu MATLAB (The MatWorks, Inc., Beltsville, MD, USA). Surové fluorescenční snímky byly importovány do programu MATLAB a každý pixel na snímcích byl převeden na jednotlivé složky matice. Rozložení intenzit fluorescence každé složky bylo graficky znázorněno histogramem. Celý soubor dat byl rozdělen do 256 intervalů.

Analýza třídění buněk pomocí fluorescence

Buňky byly jednou promyty 1 ml PBS a následně bylo z destiček s buněčnými kulturami odsáto růstové médium. Poté byly buňky odděleny od destičky ošetřením trypsinem. Oddělené buňky byly shromážděny do 15ml zkumavky, po níž následovala centrifugace, jejímž výsledkem byl pelet (180 g, 3 min). Supernatant trypsinového roztoku byl odstraněn a buněčná peleta byla dvakrát promyta pomocí 2 ml PBS. Buňky byly resuspendovány v PBS na koncentraci 50 000 buněk/ml. Poté byly vzorky připraveny fixací buněk v 1% roztoku formaldehydu po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Vzorky byly analyzovány na intenzitu fluorescence GFP pomocí systému FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

Relativní úroveň životaschopnosti ve tmě

Buněčná suspenze MDCK-GFP (5000 buněk na jamku) byla dávkována do 96jamkové destičky (Corning Inc., Corning, NY, USA) a inkubována 1 den při 37 °C a 5 % CO2. Jakmile se buňky přichytily na destičku, byly koinkubovány s různými koncentracemi I-gelu (odpovídajícími koncentraci X-DNA) v růstovém médiu (DMEM obsahujícím 10 % (v/v) FBS a 1 % penicilinu) ve tmě. I-gel byl složen z molárního poměru X-DNA:I-plasmid 1500:1. Tyto vzorky byly inkubovány 6, 24 a 48 hodin při 37 °C a 5 % CO2. Na konci každé inkubace byl ke vzorkům přidán roztok Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japonsko) podle pokynů výrobce. Po další inkubaci po dobu 1 h byla změřena absorbance při 450 nm pomocí mikrodestičkové čtečky. Výsledky tohoto měření byly vyjádřeny jako poměr mezi absorbancí vzorku a absorbance buněk negativní kontroly bez inkubace vzorku.

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru Prism 7.05 (GraphPad Software) pro Studentův t test, jednocestnou ANOVA s Bonferroniho posttestem vícenásobného porovnání. Holmův-Bonferroniho posttest mnohonásobného porovnání byl proveden s použitím výsledků Bonferroniho posttestu mnohonásobného porovnání ze softwaru Prism 7.05 (GraphPad Software)30. Test normality byl vypočten pomocí Shapiro-Wilkova testu. Podle výsledků Shapiro-Wilkova testu byla data přibližně normálně rozdělena. Statistická významnost je označena jako *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

.