Syntéza a inhibiční aktivita některých derivátů 4-hydroxykumarinu na HIV-1 proteázu

Abstrakt

Šest nových derivátů 4-hydroxykumarinu bylo racionálně syntetizováno, ověřeno a charakterizováno pomocí molekulárního dokování s využitím krystalové HIV-1 proteázy. Molekulární dokovací studie předpověděly antiproteázovou aktivitu (7) a (10). Nejvýznamnějšími funkčními skupinami, které jsou zodpovědné za interakci s HIV-1 proteázou za vzniku vodíkových vazeb, jsou pyranový kyslík, atom, laktonový karbonylový kyslík a jedna z hydroxylových skupin. Nově syntetizované sloučeniny byly biologicky testovány na buňkách MT-4 pro inhibici replikace HIV-1, přičemž byla zkoumána ochrana buněk před cytopatickým účinkem HIV měřená přežíváním buněk v MTT testu. Jeden z derivátů -7 vykazoval 76-78% inhibici infekčnosti viru s IC50 = 0,01 nM, což je mnohem méně než maximální netoxická koncentrace (1 mM). Antiproteázová aktivita 7 ve dvou různých koncentracích byla zjištěna na úrovni 25 %. Nicméně výsledky studia (7) vybízejí k jeho použití jako farmakoforu pro další syntézu a hodnocení anti-HIV aktivity.

1. Úvod

Retrovirální proteáza (PR) viru lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1) je jedním z klíčových enzymů pro replikaci viru. Štěpí prekurzory proteinů a glykoproteinů za vzniku aktivních virových enzymů a strukturních proteinů. Neaktivní PR HIV-1 vede ke vzniku neinfekčních virionů. Tato skutečnost podnítila hledání účinných látek s antiproteázovou aktivitou inhibujících replikaci HIV-1. Během posledních 12 let byla klinicky zavedena řada peptidomimetických analogů – inhibitorů HIV-1 PR (PI), ale největší část z nich vykazuje špatné farmakologické vlastnosti, jako je špatná perorální biologická dostupnost, rychlá clearance a problémy s tolerancí – často spojené s lypodystrofií a dyslipidemií . Také proto, že se jedná o peptidomimetika, vykazují virové izoláty rychle vysoký stupeň rezistence a zkřížené rezistence i při použití členů skupiny před uvedením PI na trh .

Vývoj nových nepeptidických PI, jako je tipranavir a darunavir, prokázal působivou účinnost proti mutantám rezistentním na PI, takže zůstávají důležitou možností pro pacienty, kteří takovou rezistenci skrývají . To je důvodem k hledání nových nepeptidických látek-inhibitorů HIV-1 proteázy. Experimentální údaje o některých nepeptidických látkách – 4-hydroxykumarinech (obr. 1) a derivátech 4-hydroxypyranu inhibujících HIV-1 PR tuto myšlenku podporují .

Obrázek 1

Struktura 4-hydroxykumarinu.

Protože se již dlouhá léta zajímáme o syntézu a hodnocení řady nepeptidických látek, jako jsou deriváty 4-hydroxykumarinu , byli jsme podníceni k rozšíření těchto experimentů. Zde je prezentována řada nových syntéz doplněných o experimenty molekulárního dokování s využitím krystalového enzymu a hodnocení biologické aktivity nových a slibných derivátů 4-hydroxykumarinu.

2. Výsledky a diskuse

2.1. Syntéza derivátů 4-hydroxykumarinu

2.1.1. Syntéza derivátů 4-hydroxykumarinu

. Syntéza arylmethylen-β-ketoesterů

Různě substituované aromatické aldehydy se používají pro syntézu arylmethylen-β-ketoesterů pomocí Knoevenagelovy reakce s ethylacetátem v přítomnosti piperidinu jako základního činidla a ledové kyseliny octové. Tyto arylmethylen-β-ketoestery lze znázornit na obrázku 2.

Obrázek 2

Obecná chemická struktura a syntéza arylmethylen-β-ketoesterů.

Reakce 4-hydroxybenzaldehydu a 2,4-pentanedionu byla rovněž provedena za stejných podmínek jako výše uvedené. Izolovaným produktem byl 3-(4-hydroxy)fenylmethylen-2,4-pentanedion (6) , viz obrázek 3.

Obrázek 3

Syntéza 3-(4-hydroxy)fenylmethylen-2,4-pentanedionu (6).

2.1.2. Syntéza 3-(4-hydroxy)fenylmethylen-2,4-pentanedionu (6). Michaelova adice arylmethylen-β-ketoesterů a arylmethylen-2,4-pentanedionů na 4-hydroxykumarin

Druhým krokem reakce je adice získaných arylmethylen-β-ketoesterů se 4-hydroxykumarinem pomocí Michaelovy reakce za použití methoxidu sodného nebo piperidinu jako základního činidla . Tuto reakci lze vyjádřit jako na obrázku 4.

Obrázek 4

Michaelova adice 4-hydroxykumarinu a arylmethylen-β-ketoesterů.

Obrázek 5

Michaelova adice 4-hydroxykumarinu a 3-(4-hydroxy)fenylmethylen-2,4-pentanedionu (6).

2.2. Molekulární dokování

Byla zkoumána interakce HIV-1 proteázy pomocí molekulárního dokování s některými nově syntetizovanými deriváty 4-hydroxykumarinu. Pro srovnání byly použity experimentální údaje o aktivitě některých 4-hydroxykumarinů.

Předběžné molekulární dokování bylo provedeno na základě známých 4-hydroxykumarinových derivátů, které mají inhibiční aktivitu HIV-1 proteázy (tabulka 1) . Mřížka byla zvolena tak, aby převyšovala velikost ligandu, který je předem navázán na enzym (v tomto případě byla zvolena velikost mřížky 7 Å).

Touto metodou byly získány hodnoty 𝐺-skóre a E-modelové funkce. Nazývají se skórovací funkce a jsou abstraktními ekvivalenty funkce Δ𝐺bind. Tyto funkce zohledňují volnou energii způsobenou účinky rozpouštědla, konformační změny proteinu a ligandu, interakce mezi proteinem a ligandem (vodíkové vazby, iontové interakce a van der Waalsovy síly), ztrátu volné energie zmrazení vnitřní rotace proteinu a ligandu, ztrátu volné energie v translační a rotační energii, způsobenou asociací obou molekul, a volnou energii způsobenou změnami vibračního módu (obvykle se ignoruje). Pokud jsou tyto hodnoty pro jeden ligand zápornější, znamená to, že vazebná schopnost tohoto ligandu je lepší. Pokud ligand vykazuje vazebnou schopnost v jedné určené konformaci, program ji zobrazí jako „dobrou pózu“.

Tento enzym se skládá ze dvou polypeptidových řetězců a je z rodiny aspartylových proteáz se dvěma aspartátovými zbytky ležícími ve spodní části aktivního místa. Použili jsme krystalografickou strukturu retrovirové HIV-1 proteázy navázané na peptidomimetický inhibitor BEA369 z Protein Data Bank s pdb kódem 1EBY.

Lze konstatovat, že ligand (1) má nejsilnější vazebnou schopnost na HIV-1 proteázu. Výsledky molekulárního dokování potvrzují experimentální údaje o ligandu (1).

V případě ligandů (1)-(5) jsou hodnoty 𝐺-skóre a E-modelu z molekulárního dokování, pro skupinu testovaných sloučenin, uvedeny v tabulce 2.

Interakce mezi zkoumanými deriváty 4-hydroxykumarinu a aktivními místy enzymu HIV-1 proteázy jsou realizovány vodíkovou vazbou a van der Waalsovými interakcemi. Nejaktivnější sloučeninou s nejlepší vazebnou aktivitou je například sloučenina (10) podle ligandů (1)-(4) (na základě hodnot skórovacích funkcí). Tato skutečnost pravděpodobně vyplývá z tvorby vodíkových vazeb mezi kyslíkovým atomem pyranu, karbonylovým kyslíkem laktonu a jednou z hydroxylových skupin (v metapozici) připojených k aromatickému kruhu z postranního řetězce. K dobré vazbě přispívají také van der Waalsovy přitažlivé síly. Podle ligandu (5) je nejaktivnější sloučenina (7). U sloučeniny (7) existují dvě vodíkové vazby za účasti pyranového kyslíkového atomu, karbonylového kyslíkového atomu z laktonového kruhu a jednoho a příslušného proteinového fragmentu. Podstatné pro vazbu jsou van der Waalsovy přitažlivé interakce, kterých se pravděpodobně účastní m-nitroskupina s jedním ze svých kyslíkových atomů. Sloučenina (7) se zdá být aktivnější než experimentální ligandy.

2.3 Sloučenina (7) se zdá být aktivnější než experimentální ligandy. Biologická aktivita v buněčných kulturách (buňky MT-4)

Po prokázání aktivity některých derivátů 4-hydroxykumarinu vůči izolovanému HIV-PR v experimentech molekulárního dokování by bylo zajímavé je dále testovat na buňkách MT-4 infikovaných virem HIV-1. Hodnocení anti-HIV účinku bylo provedeno in vitro rychlým a citlivým mikrotitračním infekčním testem založeným na kvantifikaci cytolýzy pomocí vychytávání vitálního barviva (MTT) jako koncového bodu infekce . Kromě toho byl účinek inhibitorů na endogenní aktivitu reverzní transkriptázy (RT) supernatantů MT-4 infikovaných virem HIV-1 III B považován za ukazatel schopnosti blokovat replikaci HIV-1 . Buňky MT-4 byly infikovány a inkubovány s každým inhibitorem po dobu 72-96 hodin a poté byla v buněčných supernatantech měřena aktivita RT podle pokynů v testu HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Švédsko). Byla rovněž provedena studie přímého účinku nově syntetizovaných 4-hydroxykumarinů na exogenní rekombinantní RT (rRT). Dále byly všechny sloučeniny testovány na anti-HIV-1 PR aktivitu. Tabulka 3 představuje výsledky mikrotitračního infekčního testu s použitím MTT a inhibice aktivity HIV-1 PR. Experimenty byly prováděny v maximální netoxické koncentraci (MNC) pro každou sloučeninu.

Především je vidět, že sloučeniny (8), (7) a (12) mají vyšší MNC, což znamená, že jsou cytotoxičtější než ostatní tři sloučeniny. Pouze dvě z nich (10) a (7) inhibovaly replikaci viru v buňkách MT-4, přičemž inhibice vyvolaná (7) byla pozoruhodná (78 %). Při použití desetinásobného ředění viru byla stanovena IC50 na 0,01 nM. Žádná sloučenina nevykazovala účinek jak na endogenní, tak na exogenní RT. To znamená, že RT nebyl cílem antivirového působení. Jak předpokládaly studie molekulárního dokování, aktivita HIV-1 PR byla inhibována 24-25 % (7) (bylo provedeno 5 samostatných hodnocení). Nesoulad zjištěný u (7) mezi údaji týkajícími se inhibice infekčnosti (asi 75 %) a proteázové aktivity (25 %) by mohl být vysvětlen jinou aktivitou, např. l antiintegrázovou. Je dobře známo, že některé deriváty 4-hydroxykumarinu jsou inhibitory integrázy.

Experimenty popsané v tomto článku rozšiřují dříve uvedené, že deriváty 4-hydroxykumarinu by mohly sloužit jako nové nepeptidické PI. Podobně jako tipranavir a darunavir by mohly být účinné u pacientů s rozvinutou rezistencí na peptidické PI. Zejména (7) by mohl být dále využit jako farmakofor k syntéze nových účinnějších derivátů vůči HIV-1 proteáze.

3. Závěr

Šest 4-hydroxykumarinových sloučenin bylo syntetizováno dvoustupňovou syntézou. Prvním krokem je Knoevenagelova reakce mezi aromatickými aldehydy a ethylacetátem nebo acetylacetonem. Druhým krokem je Michaelova adice získaného arylmethylen-β-ketoesteru nebo arylmethylen-2,4-pentanedionu se 4-hydroxykumarinem. Produkty jsou identifikovány a charakterizovány pomocí 1H NMR, EI-MS, FTIR a prvkové analýzy.

Studium jejich vazebné aktivity na HIV-1 PR bylo provedeno pomocí molekulárního dokování. Byl použit krystal HIV-1 PR vázaný s peptidomimetickým inhibitorem BEA369. Nejvyšší vazebnou aktivitu vykazuje sloučenina (10), podle experimentálních ligandů (1), (2), (3) a (4) a sloučenina (7), podle ligandu 5. Tato skutečnost je pravděpodobně způsobena tvorbou vodíkových vazeb mezi kyslíkovým atomem pyranu, karbonylovým kyslíkem laktonu a jednou z hydroxylových skupin (v metapozici) připojených k aromatickému kruhu z postranního řetězce. K dobré vazbě přispívají také van der Waalsovy přitažlivé síly.

Všech šest sloučenin bylo testováno na anti-HIV-1 PR aktivitu v buňkách MT4 infikovaných HIV-1. Sloučeniny byly testovány na anti-HIV-1 PR aktivitu. Přežití buněk bylo hodnoceno pomocí MTT testu a také bylo měřeno % inhibice HIV-1 PR. Nejvyšší inhibici HIV-1 PR (25 %) a nejvyšší přežití MT4 buněk (78 %) prokázala sloučenina (7). Sloučenina (7) by mohla být dále použita jako farmakofor k syntéze nových účinnějších derivátů vůči HIV-1 PR.

4. Experimentální část

4.1. Sloučenina (7). Syntéza derivátů 4-hydroxykumarinu

4.1.1. Materiály a metody

Všechny výchozí materiály byly zakoupeny od společností Merck, Sigma-Aldrich a Fluka. Použily se bez dalšího čištění. Teploty tání jsou měřeny v otevřených kapilárách na přístroji Büchi 535 pro měření teploty tání. IR spektra byla zaznamenána na spektrometru Shimadzu FT-IR 8101 M v nujolu a frekvence jsou vyjádřeny v cm-1. 1H NMR spektra byla zaznamenána na přístroji Brucker 250 MHz v DMSO-d6 nebo acetonu s použitím TMS jako vnitřního standardu (chemické posuny jsou uvedeny v jednotkách ppm, vazebné konstanty (𝐽) v Hz). Zkratky jsou následující: s: singlet, d: dublet, dd: dvojitý dublet, dq: dvojitý kvartet, dqui: dvojitý kvintet, t: triplet a m: multiplet.

Masově-spektrální analýza byla provedena elektronovou ionizací na masovém spektrometru Hewlett-Packard 5973 při 70 eV.

4.1.2. Hmotnostní analýza Obecný postup přípravy arylmethylen-β-ketoesterů

Aromatický aldehyd a ethylacetoacetát se v ekvimolárním množství smíchají v baňce s kulatým dnem. Do reakční směsi se rovněž přidá piperidin (0,03 mol) a ledová kyselina octová (0,04 mol). Ta se míchá při pokojové teplotě po dobu 90 minut. Po přidání 20 ml etheru a/nebo 150 ml destilované vody do reakční směsi se vytvoří krystaly různých barev. Tyto krystaly se zfiltrují a promyjí. Poté se vysuší při pokojové teplotě a rekrystalizují ve vhodných rozpouštědlech – hlavně v alkoholech (ethanol, propanol a 2-propanol) a ve vodě.

4.1.3. Postup přípravy 3-(4-hydroxy)-fenylmethylen-2,4-pentandionu (6)

4-hydroxybenzaldehyd (3,66 g, 0,03 mol) a acetylaceton (5,14 ml, 0,05 mol) se smíchají v baňce s kulatým dnem. Do reakční směsi se rovněž přidá piperidin (0,03 mol) a ledová kyselina octová (0,04 mol). Ta se míchá při pokojové teplotě po dobu 120 minut. Poté se k reakční směsi přidá 150 ml destilované vody. Vznikají krystaly různých barev. Tyto krystaly se odfiltrují a promyjí. Poté se vysuší při pokojové teplotě a rekrystalizují v methylenchloridu.

4.1.4. Obecný postup přípravy kondenzačních produktů se 4-hydroxykumarinem

Arylyden-β-ketoester, získaný v předchozí reakci, a 4-hydroxykumarin se smíchají v ekvimolárním množství v 25-30 ml methanolu (použitého jako rozpouštědlo). K činidlům se také přidá methoxid sodný (0,003 mol) jako bazické činidlo. Reakční směs se vaří a míchá 60 hodin pod refluxem. Reakce se kontroluje pomocí TLC (hexan : aceton = 2 : 1 nebo hexan : aceton : chloroform : methanol = 5 : 3 : 2 : 1). Po vyčerpání množství činidel bylo zahřívání zastaveno. Zbytek reakční směsi byl odfiltrován a promyt horkou vodou, aby se odstranil 4-hydroxikumarin, který nezreagoval. Poté se zbytek vysušil při pokojové teplotě a rekrystalizoval ve vhodném rozpouštědle (methanol, ethanol nebo 2-propanol).

4.1.5. Michaelova adice mezi 3-(4-hydroxybenzyliden)-2,4-pentanedionem (SS-23) a 4-hydroxykumari

3-(4-hydroxybenzyliden)-2,4-pentanedion (1,02 g, 0,005 mol) a 4-hydroxykumarin (0,81 g, 0,005 mol) se smísí v mírném přebytku 4-hydroxykumarinu v 15-25 ml methanolu. K činidlům se také přidá piperidin (0,003 mol) jako bazické činidlo. Reakční směs se vaří a míchá 60 hodin pod refluxem. Reakce se kontroluje pomocí TLC (hexan : chloroform : kyselina octová = 10 : 10 : 4, hexan : chloroform : kyselina octová = 10 : 10 : 2, hexan : aceton = 2 : 1). Po vyčerpání množství činidel bylo zahřívání zastaveno. Zbytek reakční směsi byl odfiltrován a promyt horkou vodou, aby se odstranil 4-hydroxikumarin, který nezreagoval. Poté se zbytek vysušil při pokojové teplotě a rekrystalizoval v acetonu.

4.2. Zbytek se vysušil při pokojové teplotě a rekrystalizoval v acetonu. Molekulární dokování

Všechny výpočty molekulárního dokování se provádějí s programy Maestro Macromodel Glide z balíčku Schrodinger . Všechny struktury (experimentálně testované i nové) jsou minimalizovány programem Macromodel s použitím silového pole OPLS2005 a 5000 iterací. Rentgenová struktura enzymu HIV-1 proteázy spolu s inhibitorem BEA369 je získána z databáze Protein Data Bank s kódem PDB 1EBY.

4.3. Buněčné linie a viry

MT-4-a lidská lymfoblastoidní suspenzní buněčná linie, kterou laskavě poskytl Gianfranco Pancino- Institute Pasteur, (Unite de Regulation des Infections Retrovirales, Paříž, Francie) představuje klasický model pro experimentální produktivní infekci kmenem HIV-1 III B a používá se jako běžný cíl pro studium účinku předpokládaných inhibitorů HIV v buněčné kultuře .

Jako zdroj HIV-1 byly použity supernatanty linie H9/HTLV III B – dar Dr. R. Galla (NIH, USA). Supernatanty byly odebrány a odstředěny k odstranění buněk a byly připraveny zásoby viru se známým obsahem antigenu p24 (460 pg/ml, test Murex HIV Antigen mAB), aktivitou RT (565,3 pg RT/ml, HS-Lenti RT Activity Kit, Cavidi, Švédsko) a infekčností (2 × 106 infekčních virionů/ml, mikrotitrační infekční test) . Buňky MT-4 a H9/HTLV III B byly pěstovány v RPMI 1640 doplněném 10 % FCS (invitrogen).

4.4. Testy cytotoxicity a antivirové testy v buněčných kulturách

Studované sloučeniny byly nejprve rozpuštěny v DMSO a dále ředěny v buněčném růstovém médiu bez fetálního séra. Všechny roztoky byly připraveny ex tempore.

Studovány byly následující parametry: cytotoxická koncentrace 50-CC50, kde to bylo možné (koncentrace zabraňující smrti 50 % buněk MT-2), maximální netoxická koncentrace-MNC a inhibiční koncentrace 50-IC50 (koncentrace inhibující o 50 % replikaci viru). CC50 a MNC byly zjišťovány pomocí testu vychytávání MTT . IC50 byla studována na buňkách MT-4 mikrotitračním infekčním testem zkoumajícím ochranu buněk před cytopatickým účinkem HIV měřeným pomocí testu MTT . Experimenty za podmínek akutní infekce byly prováděny v 96jamkových mikrotitračních destičkách s 6-8 paralelami/experiment. Při každém experimentu byly provedeny buněčné kontroly (buňky MT-4 pouze s médiem) a virové kontroly (buňky MT-4 infikované virem). Pro antivirové testy byl do každé jamky přidán HIV, aby se dosáhlo multiplicity infekce 0,1 s výjimkou buněčných kontrol. Připojení viru bylo povoleno po dobu jedné hodiny při 37 °C/5 % CO2. Destičky byly inkubovány 72-96 hodin při 37 °C/5 % CO2. Poté byl proveden MTT test podle popisu a absorbance životaschopných buněk byla měřena kolorimetricky při vlnové délce A540 nm. U všech experimentů byla vypočtena průměrná hodnota každého sloupce (pouze pokud se hodnoty v A540 nelišily v rozmezí ±10 %). U antivirových testů byly porovnány průměrné hodnoty experimentálních a kontrolních řádků a procento chráněných buněk (přežití buněk) při příslušné koncentraci látky bylo vyneseno do grafu proti koncentraci látky, aby se získala hodnota IC50. Přežití buněk (% ochrany buněk) bylo vypočteno podle následujícího vzorce: =%cellprotectionA540𝑋-A540ControlHIVA540CellControl-A540ControlHIV×100,(1) kde 𝑋 je průměrná hodnota A540 buněk infikovaných HIV ošetřených příslušnou koncentrací zkoumané látky; kontrolní HIV je průměrná hodnota A540 buněk infikovaných HIV bez přidání jakékoliv látky; kontrolní buňka je průměrná hodnota A540 buněk neinfikovaných a neošetřených inhibitorem.

Jako referenční látka byl použit ABC (Abakavir – dobře známý nukleosidový inhibitor reverzní transkriptázy – NRTI) a pepstatin.

4.4.1. Inhibitory reverzní transkriptázy a pepstatin Endogenní aktivita RT a přímý účinek sloučenin na RT

Byla testována pomocí testu HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Švédsko). Souprava obsahuje rekombinantní RT (rRT) jako standard, který umožňuje kvantifikaci RT. Pro stanovení endogenního RT byly testovány supernatanty HIV-1 infikovaných/neinfikovaných buněk MT-4 po inkubaci s/bez sloučenin podle pokynů výrobce. Úroveň aktivity RT v supernatantu byla vypočtena (v pg/ml) ze standardu HIV-1 rRT stanoveného v každé soupravě. Přímý účinek sloučenin na aktivitu rRT byl měřen stejnou soupravou a jeho cílem bylo prokázat RT jako cíl protivirového účinku. Příslušná stupňová ředění inhibitoru byla připravena v kontrolním pufru a přidána do reakční směsi. Reakce probíhala po dobu 3 hodin při 33 °C. Aktivita RT standardních ředění byla porovnána s aktivitou, do které byly přidány sloučeniny, nebo s kontrolní směsí (do které byla přidána pouze inkubační směs bez sloučenin).

4.4.2. Detekce antiproteázové aktivity pomocí testů využívajících nativní virovou PR

Metoda popsaná dříve Broglia et al. v roce 2006 , pro detekci aktivity rekombinantní proteázy, byla modifikována tak, aby využívala nativní virovou proteázu. Jako zdroj nativní proteázy HIV-1 byla opět použita suspenze koncentrované virové zásoby (50x) z chronicky infikovaných supernatantů buněk H9/HTLV IIIB. Lýza virových částic a uvolnění aktivního enzymu (proteázy) bylo provedeno pomocí disrupčního (lyzačního) pufru obsahujícího 2,5 % Tritonu X-100 ve fosfátovém pufru. Koncentrace tekutiny tkáňové kultury obsahující virus byla provedena ultracentrifugací v přístroji Biofuge Stratos, Heraeus, po dobu 1 hodiny při 4 °C a 35 000 ot/min. Peleta byla resuspendována, aby se získal 50x koncentrát v disrupčním pufru.

Pro každý experiment byla připravena následující reakční směs : 1000 𝜇L fosfátového pufru (20 mM, pH 6.0); 20 𝜇L HIV proteázového substrátu III (1 𝜇g/ml, 760 𝜇M; Bachem, Švýcarsko) v DMSO, připraveno ex tempore; 20 μL enzymu (zásobní HIV) odebraného z roztoku obsahujícího 25 𝜇L disrupčního (lyzačního) pufru + 100 μL HIV-zásoby, inkubováno 40 min při 37 °C před experimentem.

Aktivita HIV-1 PR byla měřena pomocí přímého spektrofotometrického odečtu využití substrátu enzymové reakce při 300 nm, při pokojové teplotě a délce dráhy 1 cm, pomocí spektrofotometru T80 + UV-Vis (PG instruments). Počáteční reakční rychlost (V0) byla nastavena na 0,0020-0,0030 ΔAbs/min změnou aktivity enzymu (koncentrace viru). Testovaná sloučenina a referenční inhibitor (zde použitý pepstatin) byly přidány do reakční směsi před enzymem, aby bylo možné provést screening inhibičního účinku. IC50 byla definována jako koncentrace testované sloučeniny, která snižuje rychlost reakce o 50 % počáteční rychlosti bez testované (referenční) sloučeniny.