Acetylcholin je syntetizován z acetylkoenzymu A a cholinu pomocí enzymu cholinacetyltransferázy. V nervovém systému se předpokládá, že tento enzym existuje především v cytoplazmě nervových terminálů. Koenzym A je syntetizován v mitochondriích a k cholin acetyltransferáze se dostává po transportu přes mitochondriální membránu do cytoplazmy. Kromě syntézy v játrech pochází cholin používaný při výrobě acetylcholinu z potravních zdrojů. V endoteliálních buňkách kapilár existuje přenašečový systém, který je zodpovědný za transport cholinu ve volné a fosfolipidové formě do mozku. Hydrolýzou fosfolipidů obsahujících cholin se také může uvolňovat cholin, který se používá při syntéze acetylcholinu. Jelikož cholin acetyltransferáza není nasycena koncentracemi acetylkoenzymu A a cholinu, které jsou podle odhadů přítomny v nervovém terminálu, zdá se, že rychlost syntézy acetylcholinu závisí na dostupnosti prekurzorů. Aktivita enzymu je rovněž regulována inhibicí produktu; vazbou na alosterické místo na cholin acetyltransferáze inhibuje acetylcholin její aktivitu. Kromě toho ovlivňuje rychlost tvorby acetylcholinu hmotnostní působení a neuronální aktivita. Krátkodobé regulace aktivity enzymu je částečně dosaženo fosforylací vyvolanou proteinkinázami. Neexistují žádné velmi specifické a účinné inhibitory enzymu a je třeba poznamenat, že farmakologická blokáda tohoto kroku (např. pomocí naftylvinylpyridinu) v životním cyklu acetylcholinu má na transmiter méně výrazný účinek než inhibice transportu cholinu.
Za vychytávání transmiteru z cytoplazmy do vezikul je zodpovědný specifický nízkoafinitní acetylcholinový transportér. Geny pro cholin acetyltransferázu a vezikulární acetylcholinový transportér jsou uspořádány v jednom genovém lokusu a transkripce obou genů je obvykle regulována společně. (±)-vesamicol je selektivní inhibitor tohoto transportéru, přičemž L-(-)-vesamicol je účinnější než D-(+)-vesamicol. Jakmile je acetylcholin zabalen ve vezikulech, podléhá uvolňování vyvolanému podnětem pomocí exocytózy. Na uvolňování acetylcholinu má vliv několik silných toxinů, zejména botulotoxin, který inhibuje jeho uvolňování.
Neuronální acetylcholinesterasa velmi rychle inaktivuje většinu acetylcholinu uvolněného v mozku, ačkoli butyrylcholinesterasa obsažená v gliových buňkách může hydrolyzovat malou část acetylcholinu v synapsích. Na periferii je acetylcholinesterasa přítomna ve svalech, které dostávají cholinergní inervaci, zatímco butyrylcholinesterasa je rozšířenější. Je známa řada reverzibilních (např. fyzostigmin, BW284C51) a ireverzibilních (např. iso-OMPA) inhibitorů acetylcholinesterázy, které mají za následek prodloužení synaptických účinků acetylcholinu. Jako léčba Alzheimerovy choroby se používají reverzibilní anticholinesterázy druhé generace, jako je donepezil, rivastigmin (ENA 713), eptastigmin a galantamin (galanthamin). Některé cholinesterázy druhé generace byly z klinického použití staženy pro nepřijatelné vedlejší účinky (např. takrin, metrifonát). Nevratné inhibitory acetylcholinesterázy se používají jako insekticidy a bojové chemické látky. Cholin, který je acetylcholinesterázou uvolňován z acetylcholinu, je transportérem s vysokou afinitou přijímán zpět do cholinergních terminálů a znovu využíván při syntéze transmiterů. Hemicholinium-3 účinně a reverzibilně inhibuje transport cholinu, což vede k hlubokému poklesu tvorby acetylcholinu. Na rozdíl od hemicholinia-3 je A-4 (bis 4-methylpiperidinový analog HC-3) aktivní po periferním podání. Analogy dusíkatých hořčíků cholinu jsou silnými ireverzibilními inhibitory vysokoafinitního vychytávání cholinu
.