Test aktivace bazofilů: potravinová výzva ve zkumavce nebo specializovaný výzkumný nástroj?

Zlatým standardem pro diagnostiku potravinové alergie je orální potravinová výzva (OFC) . OFC však vyžaduje požití podezřelé vinné potraviny a může vyvolat akutní alergickou reakci, která je potenciálně závažná . Z tohoto důvodu musí být OFC prováděna v prostředí pod dohledem s vybavením a odbornými znalostmi pro léčbu alergických reakcí a anafylaxe, pokud k nim dojde. OFC může u pacientů, rodičů a dokonce i klinického personálu vyvolat značné obavy, protože s sebou nese značné riziko. Proto, kdykoli je to možné, se diagnóza potravinové alergie stanoví na základě nedávné přesvědčivé anamnézy alergické reakce zprostředkované IgE na vinnou potravinu v kombinaci s důkazem IgE senzibilizace na stejnou potravinu pomocí kožního prick testu (SPT) a/nebo specifického IgE v séru (sIgE) . OFC jsou vyhrazeny pro případy, kdy jsou výsledky SPT a/nebo sIgE nejednoznačné. S rostoucí informovaností a zvýšenou prevalencí potravinové alergie a senzibilizace na potraviny je stále více pacientů testováno na potravinovou alergii. Absence orální expozice alergenním potravinám v anamnéze, která by vedla k alergické reakci nebo k absenci klinických příznaků, může činit interpretaci výsledků SPT a sIgE obzvláště náročnou. Kojenci a malé děti, kteří nikdy nepozřeli některé alergizující potraviny, tvoří značnou část pacientů, kteří se setkávají na alergologických klinikách, a často potřebují OFC k objasnění svého alergického stavu. To vede ke zvyšujícím se nárokům na provádění OFC. Alergologické služby mají problém na tuto poptávku reagovat a pacienti mohou čekat několik měsíců, než jim OFC nabídne přesnou diagnózu potravinové alergie nebo potravinové tolerance, což může vést ke zbytečným dietním omezením a ke značné úzkosti spojené s diagnostickou nejistotou. OFC je také zlatým standardem pro posouzení řešení potravinové alergie, stanovení prahové dávky a sledování klinické odpovědi na imunomodulační léčbu potravinové alergie. Ve výzkumných studiích musí alergičtí pacienti často opakovaně podstoupit OFC, aby bylo možné posoudit, zda došlo ke klinickému zlepšení.

BAT, jakožto funkční test, má potenciál více se podobat klinickému fenotypu pacientů než alergologické testy, které pouze zjišťují přítomnost alergen-specifických IgE. Zjednodušeně lze na BAT pohlížet jako na OFC ve zkumavce, kdy jsou bazofily zapojené do akutních alergických reakcí namísto podávání potravin ústy vystaveny potravinovému extraktu ve zkumavce. Navzdory analogii lze poukázat na rozdíly mezi oběma postupy a jejich klinickým použitím a zde se nabízí otázka, zda BAT může loajálně napodobit zlatý standard OFC, tj. zda BAT může in vitro reprodukovat alergickou reakci, ke které dochází in vivo při pozitivní OFC.

Test aktivace bazofilů

BAT je test založený na průtokové cytometrii, při kterém se měří exprese aktivačních markerů na povrchu bazofilů po stimulaci alergenem -obr. 1. BAT je test založený na průtokové cytometrii. Pozitivní test aktivace bazofilů lze považovat za in vitro náhražku akutní alergické reakce in vivo. Ve studii pacientů alergických na jed blanokřídlých byla pozorována up-regulace markerů aktivace bazofilů jak in vitro po stimulaci jedem žluté sojky nebo včely medonosné, tak ex vivo po pozitivním testu na žihadlo . Ve stejné studii byla zjištěna obecná shoda mezi klinickým obrazem (systémová reakce versus rozsáhlá lokální reakce) a výsledky BAT, což naznačuje, že BAT je potenciálním biomarkerem anafylaxe. Také u pacientů s potravinovou alergií byla zjištěna dobrá shoda mezi výsledky BAT a výsledkem OFC. U pacientů alergických na alfa-gal s opožděnými alergickými reakcemi okamžitého typu na červené maso se aktivace bazofilů ex vivo v krvi odebrané v různých časových bodech shodovala s rozvojem systémových alergických reakcí in vivo během OFC . Výsledky této studie posilují roli bazofilů v alergických reakcích zprostředkovaných IgE z potravin a anafylaxi.

K identifikaci bazofilů v plné krvi lze použít různé markery buněčného povrchu, včetně IgE, CD123 (s HLA-DR), CCR3 nebo CRTH2 (s CD3) nebo CD203c .

V periferní krvi je IgE detekován na bazofilech, dendritických buňkách, eozinofilech, monocytech, makrofázích, buňkách B a trombocytech, není tedy specifický pro bazofily. CD123 je nízkoafinitní (α) podjednotka receptoru IL-3. Je exprimována ve vysoké míře na plazmocytoidních dendritických buňkách a bazofilech a v nízké míře na monocytech, eozinofilech, myeloidních dendritických buňkách a podskupinách hematologických progenitorových buněk. Další barvení pomocí HLA-DR rozlišuje mezi HLA-DR negativními bazofily a HLA-DR pozitivními dendritickými buňkami a monocyty. CCR3 je receptor pro chemokiny typu C-C (např. eotaxin, MCP a RANTES) a je vysoce exprimován na bazofilech a eozinofilech, ale také na buňkách Th1 a Th2. CRTH2 je další marker, který je exprimován bazofily, eozinofily a T-lymfocyty, a proto stejně jako CCR3 vyžaduje k rozlišení bazofilů od T-lymfocytů marker T-lymfocytů, jako je CD3. CD203c je konstitutivně a specificky exprimován na bazofilech, a proto může být použit jako samostatný identifikační marker nebo v kombinaci s jinými markery.

Po stimulaci alergenem je na povrchu bazofilů zvýšena exprese různých proteinů , konkrétně CD63 a CD203c . CD63 je lyzozomálně asociovaný membránový protein (LAMP), který není exprimován na povrchu klidových bazofilů, ale pouze na membráně granulí uvnitř buněk . Když granula během degranulace splynou s plazmatickou membránou bazofilů, začne se CD63 exprimovat na povrchu bazofilů . CD203c je enzym, který štěpí fosfodiesterové a fosfosulfátové vazby a hydrolyticky postupně odstraňuje 5′-nukleotidy z 3′-hydroxy-konců oligonukleotidů. Je výhradně a konstitutivně exprimován v nízkých hladinách na povrchu bazofilů a žírných buněk a jeho exprese se zvyšuje s aktivací buněk. Zdá se, že markery aktivace bazofilů tvoří dvě odlišné skupiny markerů, které jsou současně regulovány: jedna zahrnuje CD63, CD107a a CD107b a druhá CD203c, CD13 a CD164 . CD63 a CD203c jsou nejčastěji používané markery aktivace bazofilů.

Laboratorní postup BAT se skládá ze tří fází: stimulace buněk, barvení buněk a průtoková cytometrie – obr. 1. Krev by měla být zpracována co nejdříve po odběru, protože bazofily časem ztrácejí svou životaschopnost a reaktivitu. Byly však provedeny studie se vzorky uchovávanými při teplotě +4 °C až 24 h . Pro BAT je zapotřebí malý objem krve (cca 1-2 ml v závislosti na počtu podmínek). Ke stimulaci buněk lze použít surové extrakty alergenů nebo purifikované či rekombinantní alergeny. Měly by se používat různé koncentrace alergenů, protože citlivost bazofilů na specifickou stimulaci alergenem se u různých pacientů liší.

Výsledky BAT lze stanovit v procentech bazofilů exprimujících definovaný aktivační marker nebo v průměrné intenzitě fluorescence (MFI) výpočtem stimulačního indexu, tj. poměru mezi MFI vybraného stavu a MFI negativní kontroly. Pro CD63 se obvykle používá první metoda, protože CD63 není exprimován v klidových buňkách a jeho exprese po aktivaci je bimodální. Druhý se obvykle používá pro CD203c, který je exprimován již v klidových buňkách a jeho nárůst po stimulaci alergenem je unimodální – obr. 2.

U alergických pacientů má aktivace bazofilů vyvolaná alergenem obvykle za následek zvonovitou křivku závislosti dávky na odpovědi, přičemž zvyšující se koncentrace alergenu (obvykle rozdíl 5-6 log) vede k postupnému zvyšování exprese markerů aktivace bazofilů až do dosažení plató – obr. 3.

Mezi jednotlivci existuje velká míra variability v odpovědi bazofilů na alergen. K vyjádření této heterogenity a k porovnání reakcí bazofilů mezi různými pacienty lze na základě křivky dávka-odpověď stanovit různé parametry, například CD-max a EC50 (50 % účinné koncentrace) nebo CDsens. CD-max je maximální aktivace a odpovídá maximálnímu podílu aktivovaných bazofilů při jakékoli koncentraci alergenu . EC50 je účinná dávka při 50 % maximální aktivace a lze ji rovněž znázornit jako CDsens. Poprvé ji popsal Johansson , CDsens je převrácená hodnota polomaximální účinné koncentrace, tj. koncentrace, při níž je aktivace bazofilů poloviční oproti maximální aktivaci, krát 100 a lze ji vypočítat podle vzorce: CDsens = 1/EC50 × 100. CDmax a CDsens jsou míry reaktivity bazofilů a citlivosti bazofilů. Reaktivitu bazofilů lze definovat jako stupeň aktivace bazofilů, tj. podíl aktivovaných bazofilů, a lze ji také měřit jako procento CD63 pozitivních bazofilů při různých koncentracích alergenu nebo jako poměr procenta CD63 pozitivních po stimulaci alergenem a anti-IgE. Citlivost bazofilů se týká koncentrace alergenu, při které se bazofily aktivují, a může být vyjádřena jako procento maximální účinné dávky (např. EC5, EC10), kromě již zmíněných EC50 a CDsens. Obrázek 3 znázorňuje reakci bazofilů dvou různých jedinců, jednoho s vyšší reaktivitou a citlivostí bazofilů (modře) a druhého s nižší reaktivitou a citlivostí bazofilů (červeně), tj. s menším podílem bazofilů, které se aktivují v reakci na vyšší koncentrace alergenu. Shreffler a Patil navrhli nový parametr pro měření reakce bazofilů, plochu pod křivkou reakce na dávku, jehož výhodou je kombinace reaktivity a citlivosti bazofilů.

Využití testu aktivace bazofilů k diagnostice potravinových alergií

V nedávno publikované studii , jsme hodnotili užitečnost BAT k diagnostice alergie na arašídy v dobře charakterizované populaci dětí alergických na arašídy, senzibilizovaných na arašídy a nesenzibilizovaných. BAT prokázala vysokou přesnost (97 %) při diagnostice alergie na arašídy a umožnila snížit počet potřebných OFC o 66 %. Diagnostické hraniční hodnoty jsme ověřili u prospektivně a nezávisle rekrutované populace a diagnostická výkonnost BAT byla i v této druhé studované populaci velmi dobrá. V posledních několika letech další studie hodnotily výkonnost BAT při diagnostice alergie na různé potraviny, včetně arašídů , kravského mléka , vajec , pšenice , lískových oříšků , korýšů a broskví , a také při diagnostice pylově-potravinových syndromů -Tabulka 1. Kazuistiky a malé série případů naznačují, že BAT může být užitečná také při diagnostice alergie na sezam a na méně běžné vyvolávače potravinových alergických reakcí zprostředkovaných IgE, jako je rýže a galaktooligosacharidy s krátkým řetězcem obsažené v prebiotikách . Nedávno zveřejněné stanovisko Evropské akademie alergologie a klinické imunologie podává přehled klinických aplikací BAT .

Různé faktory mohou ovlivnit diagnostickou účinnost a hraniční hodnoty BAT v různých studiích, některé se týkají studované populace, některé se týkají plánu studie, některé se týkají laboratorního postupu a metodiky přijaté pro analýzu dat-Tabulka 2. Existující studie jsou ve většině těchto aspektů různorodé, což omezuje jejich srovnatelnost a širší použití diagnostických hraničních hodnot stanovených v konkrétních studiích. Kritéria pro diagnostiku jednotlivých potravinových alergií jsou specifická pro jednotlivé alergeny a diagnostická přesnost nemusí být u různých alergenů stejná. Navíc hraniční hodnoty stanovené v jedné populaci nemusí být nutně přímo přenositelné na jinou populaci z jiné geografické lokality hodnocenou v jiném alergologickém centru. Jedním z omezení BAT je skutečnost, že malá část testovaných pacientů má nereponderské bazofily (tj. bazofily, které reagují na pozitivní kontrolu nezprostředkovanou IgE, ale nereagují na stimulátory zprostředkované IgE), a proto mají neinterpretovatelný výsledek testu. Další problémy při převádění BAT z výzkumné metody na diagnostický test v klinice se týkají standardizace testu a jeho reprodukovatelnosti a také nákladové efektivity zařazení BAT do diagnostického přístupu k pacientům s podezřením na potravinovou alergii. Tyto aspekty dosud nebyly stanoveny a vyžadují další výzkum.

Metodika přijatá k provedení laboratorního postupu a k analýze dat průtokové cytometrie může mít významný vliv na výsledky získané pro BAT a následně na její diagnostickou přesnost. Například identifikace bazofilů pomocí protilátky anti-IgE může aktivovat buňky a změnit výsledky získané jinou metodou identifikace bazofilů. Exprese některých markerů identifikace bazofilů, jako jsou CCR3 a CD123, se může po aktivaci bazofilů změnit. V nedávné studii jsme popsali, že přibližně u čtvrtiny pacientů může být exprese CD123, zjištěná průtokovou cytometrií, po aktivaci bazofilů snížena, a vést tak k významnému úbytku aktivovaných buněk při použití metod, které se na tento marker při identifikaci bazofilů spoléhají. To by mohlo vést ke zvýšenému počtu chybných diagnóz, zejména falešně negativních, což by mělo závažné důsledky pro jednotlivé pacienty. Přidání specifického bazofilního markeru CD203c do strategie gatingu zachovalo počet buněk a umožnilo snížit počet falešně negativních výsledků (z 5 % na 1 %). Upravená strategie gatingu zlepšila citlivost (z 88 % na 98 %) i specifičnost (z 94 % na 96 %) BAT, což vedlo k celkovému zvýšení přesnosti BAT při diagnostice alergie na arašídy z 91 % na 97 % – obr. 4. Pro úspěšné provádění a interpretaci BAT platí, že „ďábel se skrývá v detailu“, proto je velmi důležité pečlivě zvážit metodické aspekty BAT.

Celkově BAT jako diagnostický test prokázal vysokou specificitu a pozitivní prediktivní hodnotu. Ověřili jsme diagnostické hraniční hodnoty stanovené pro alergii na arašídy v nezávislé prospektivně rekrutované populaci a specificita a pozitivní prediktivní hodnota BAT dosáhla 100 %. Vysoká specificita je důležitým doplňkem ke stávajícím testům na alergii, jako jsou SPT a sIgE, které mají vysokou citlivost, ale nejsou příliš specifické. Vysoká specificita znamená, že pozitivní výsledek BAT s jistotou potvrzuje diagnózu potravinové alergie, ale negativní výsledek BAT nemusí diagnózu nutně vyloučit. V závislosti na poměru nákladů a přínosů a na bezpečnostních aspektech lze OFC provádět u pacientů, u nichž BAT poskytuje neprůkazný výsledek (konkrétně u pacientů s nereaktivními bazofily), nebo u pacientů, u nichž BAT poskytuje neprůkazný výsledek, a u pacientů, u nichž byla BAT negativní.

Přístup k rozhodování o nutnosti provedení OFC po BAT závisí také na tom, jak se výsledek BAT posuzuje v kontextu výsledků ostatních alergologických testů, a to buď v kombinaci, kdy se posuzují všechny dostupné výsledky současně, nebo postupně, kdy se BAT provádí pouze u pacientů, kteří měli nejednoznačné nebo nesouhlasné výsledky ostatních alergologických testů. V naší dříve citované studii o arašídech jsme porovnávali výsledky BAT s výsledky ostatních alergologických testů prováděných paralelně. BAT měl lepší výsledky než SPT, specifické IgE na arašídy a specifické IgE na Ara h 2 a další složky arašídů. S ohledem na jednotlivé testy byl nejpřesnějším diagnostickým testem BAT. Aby se co nejlépe využily dostupné informace, lze výsledky BAT použít v kombinaci s výsledky jiných testů . Obecně však platí, že čím více testů se použije, tím vyšší je diagnostická nejistota (a vyšší počet OFC) vzhledem k tomu, že různé testy mohou poskytovat protichůdné výsledky . Lepší než kombinovat výsledky alergologických testů současně může být použít BAT postupně v rámci diagnostiky potravinové alergie u pacientů, kteří měli neprůkazný výsledek jiných alergologických testů . Tento přístup může být výhodný i z hlediska proveditelnosti, vezmeme-li v úvahu praktické problémy spojené s prováděním BAT, konkrétně potřebu čerstvé krve a potřebné zdroje a technické znalosti. Nebylo by praktické nebo dokonce nutné provádět BAT u všech pacientů vyšetřovaných pro podezření na potravinovou alergii. BAT lze vyhradit pro vybrané případy, zejména pro případy, kdy není prokázána orální expozice potravině nebo je klinická anamnéza nejasná a výsledky SPT a specifických IgE jsou neprůkazné. BAT lze v obtížných případech použít jako druhý krok v diagnostickém postupu po klinické anamnéze a SPT a/nebo sIgE, než se rozhodne, zda je nutné provést OFC -obrázek 5. Diagnostickou přesnost a nadřazenost BAT nad kožním prick testem a specifickým IgE je třeba posoudit u jiných alergenů a v jiných klinických podmínkách.

Kromě rozlišení pacientů s potravinovou alergií a potravinovou tolerancí mohou výsledky BAT poskytnout další informace o charakteristikách reakcí vyvolaných potravinami, které mohou být užitečné při léčbě alergických pacientů . Bylo prokázáno, že různé parametry BAT odrážejí různé charakteristiky alergických reakcí, přičemž podíl aktivovaných bazofilů (reaktivita bazofilů) odráží závažnost alergických příznaků a dávka, při které bazofily reagují na alergen in vitro (citlivost bazofilů), odráží dávku potravinového proteinu, na kterou pacienti reagovali během OFC . Tato zjištění u alergie na arašídy byla zopakována v následně publikované studii a mohou být použitelná i u jiných potravinových alergií. V každém případě je třeba při posuzování pacientů s potravinovou alergií brát výsledek BAT v kontextu dalších klinických znaků a rizikových faktorů závažnosti.

Využití testu aktivace bazofilů ke sledování získání tolerance na potraviny a klinické odpovědi na imunomodulační léčbu potravinové alergie

Věrně odráží klinický fenotyp alergických a tolerantních pacientů, BAT může být užitečná při posuzování přirozeného odeznění potravinových alergií, které běžně časem odezní, jako jsou alergie na kravské mléko , vejce a pšenici, a při určování, kdy je třeba pacienty znovu vyzvat k posouzení, zda lze danou potravinu znovu zavést do stravy. BAT prokázala, že umožňuje rozlišit různé fenotypy pacientů s alergií na kravské mléko a vejce, konkrétně pacienty, kteří tolerují extenzivně zahřívané formy těchto potravin a zároveň reagují na nezahřívané potraviny, od pacientů, kteří reagují jak na extenzivně zahřívané, tak na nezahřívané mléko nebo vejce .

BAT byla také použita ke sledování klinické odpovědi na imunomodulační léčbu potravinové alergie ve výzkumných studiích. Celkově ve studiích imunoterapie na potraviny, jako jsou arašídy , kravské mléko a vejce , BAT prokázala snížení reaktivity bazofilů na příslušné potravinové alergeny při léčbě, které je patrné zejména při nižších koncentracích alergenu, což odráží snížení citlivosti bazofilů. Je zajímavé, že Thyagarajan et al. prokázali, že během OIT na arašídy ke snížení aktivace bazofilů nedocházelo pouze v reakci na arašídy, ale také na vedlejší vaječný alergen (u pacientů alergických na vejce) a na anti-IgE, ale ne na pozitivní kontrolu, která není zprostředkována IgE, fMLP (formyl-methionyl-leucyl-fenylalanin), což naznačuje, že cesta za receptorem IgE se stala anergickou. Ve studii omalizumabu u pacientů s alergií na arašídy , exprese CD203c v BAT během léčby poklesla a po ukončení této léčby se vrátila na úroveň před léčbou. A konečně čínský bylinný lék FAHF-2 rovněž prokázal významný inhibiční účinek v reakci bazofilů u pacientů s alergií na různé potraviny souběžně s klinickým zlepšením.

Souhrnně tyto studie ilustrují, že BAT lze u stejných pacientů v průběhu času opakovat, aby bylo možné posoudit změny v imunitní odpovědi na potravinové alergeny při nějakém druhu intervence, ať už se jedná o perorální imunoterapii, sublinguální imunoterapii, omalizumab nebo jiné imunomodulační léčebné nebo preventivní strategie.

Perspektivy do budoucna

S ohledem na použití BAT při diagnostice potravinové alergie v klinické praxi je zapotřebí dalšího výzkumu s cílem definovat a validovat diagnostické hraniční hodnoty pro specifické alergeny a u různých populací pacientů. Důležitá by byla standardizace laboratorních postupů, která by umožnila srovnatelnost výsledků BAT mezi jednotlivými centry. To by vyžadovalo standardizaci protokolu pro test in vitro a metod průtokové cytometrie a analýzy dat. Použití podobné metodiky pro BAT by umožnilo porovnávat výsledky BAT v různých centrech, a to jak pro klinické, tak pro výzkumné účely, včetně multicentrických studií.

Po vhodné validaci pro diagnostiku specifických potravinových alergií lze BAT použít ke sledování klinické odpovědi na imunomodulační léčbu, jako je alergen-specifická imunoterapie a biologické přípravky. BAT má také obrovský potenciál pro mechanistické studie, které zlepší naše chápání úlohy bazofilů v imunitních mechanismech potravinové alergie a potravinové tolerance.

.