PEI podporuje attachment slabě kotvících buněk a primárních tkání
Buňky PC-12 se v laboratoři používají jako model neuronální diferenciace, neboť ošetření těchto buněk nervovým růstovým faktorem (NGF) vyvolává prodlužování neuritů a expresi biochemických markerů sympatického neuronálního fenotypu . Rostou jako slabě kotvící buňky a pro předpokrytí destiček pro kultivaci buněk PC-12 se často používají kolagenové nebo polylysinové polymery . Buňky PC-12 byly v laboratoři kultivovány v naivních jamkách nebo v jamkách předem potažených různými attachment faktory (multiwell-12 misky pro tkáňové kultury), aby bylo možné sledovat vliv na ukotvení buněk k substrátu. Při absenci jakéhokoli potahovacího činidla vykazovaly buňky charakteristickou tendenci vytvářet shluky buněk, které se hromadí směrem ke středu jamky; tyto buňky jsou pevně přichyceny mezi sebou, ale velmi slabě přichyceny k misce tkáňové kultury (obrázek 1D). To má za následek velmi heterogenní rozložení buněk (směrem k okraji jamek zůstává jen velmi málo buněk) a značnou ztrátu buněk při promývání nebo výměně média. Předběžné ošetření destiček PEI vedlo k výrazně homogennějšímu rozložení buněk v jamkách, přičemž buňky se k destičce pevně přichytily a vykazovaly mnohem menší tendenci ke shlukování (obrázek 1A). Pro srovnání byly destičky také předem ošetřeny dalšími běžně používanými potahovacími látkami, kolagenem (Obrázek 1B) a poly-D-Lysinem (PDL; Obrázek 1C), což rovněž vedlo k pevnějšímu přichycení buněk k destičkám a homogennějšímu rozložení buněk.
Přichycení buněk PC-12 a neuronálních explantátů na kultivační misky. Buňky PC-12 se lépe přichytily k plastovým povrchům, které byly předem ošetřeny faktory podporujícími ukotvení, jako je PEI (panel A), kolagen (panel B) nebo PDL (panel C), ve srovnání s kontrolním neošetřeným plastovým povrchem (panel D), který obsahoval buňky ve shlucích a velmi volně přichycené k substrátu (snímky byly pořízeny uprostřed mezi středem a okrajem destičky). Povlak PEI vedl k homogennímu rozložení buněk pevně připojených k substrátu misky (panel A). PEI podporuje přichycení explantátů sítnice zebřiček ke kultivačním miskám (panel E). Tento faktor přichycení podporoval prodlužování neuritů u explantátů sítnice, které byly připraveny k axonálnímu růstu předkondiční lézí zrakového nervu (panel F). Sloupek ve fotomikrofotografiích odpovídá 25 μm v panelech A-D, 50 μm v panelu E a 100 μm v panelu F.
Pro další testování vlastnosti zesílení ukotvení pozorované při předběžné úpravě kultivačních misek PEI byl použit druhý systém. Při studiu regenerace nervů byly použity explantáty sítnice z teleostovitých ryb . Když se na zrakový nerv ryb aplikuje léze, spustí se regenerační reakce a gangliové buňky sítnice (RGC) sítnice znovu prodlouží svůj axon směrem k cílové tkáni tektonu. Pokud je sítnice takto „primed“ ryby explantována a kultivována, je regenerační odpověď pozorována in vitro zrychleným prodlužováním dlouhých neuritů. Tento jev však vyžaduje použití extracelulární matrice nebo připevňovacích faktorů (například kolagenu nebo PDL povlaku), protože explantáty vykazují velmi nízkou afinitu k nepotaženému plastovému povrchu. Byly provedeny pokusy s cílem zjistit, zda by PEI mohl působit jako attachmentový faktor podporující axonální výrůstek z explantátů sítnice zebřiček. Sítnicové explantáty z kontrolních očí zebřiček byly schopny se přichytit na kultivační misky ošetřené PEI (obr. 1E). Kromě toho byly explantáty sítnice z ryb, které dostaly podmíněnou lézi, schopny intenzivně prodlužovat axony při kultivaci s použitím PEI jako attachment faktoru (Obrázek 1F).
Výsledky s explantáty sítnice naznačují, že neuronální buňky připojené k miskám potaženým PEI se mohou diferencovat a vytvářet neurity, které se dobře připojují k substrátu. K ověření této hypotézy s proneuronálními buňkami PC-12 byly provedeny diferenciační experimenty pomocí ošetření NGF s buňkami připojenými k miskám potaženým PEI. Buňky PC-12 ošetřené NGF zůstaly po několik dní pevně připojeny k misce a vytvářely sítě neuritů (obr. 2). Výsledky naznačují, že PEI je příznivý pro proces diferenciace a pro přichycení neuritů k misce. Diferencované buňky zůstaly pevně ukotvené po celou dobu imunocytochemických experimentů (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García a R. P. Ballestero, nepublikované výsledky).
Diferenciace buněk PC-12 připojených ke kultivačním miskám potažených PEI. Buňky PC-12 připojené k miskám potaženým PEI zůstaly pevně ukotvené na destičce a po ošetření NGF prodlužovaly neurity. Obrázky ukazují průběh diferenciace ošetřených buněk v čase: 0 h (panel A), 24 h (panel B), 48 h (panel C) a 96 h (panel D) po zahájení léčby 100 ng/ml NGF. Sloupek ve fotomikrofotografiích odpovídá 25 μm.
Síla ukotvení eukaryotických buněk na kultivačních miskách předem ošetřených PEI a dalšími attachment faktory
Tři různé buněčné linie byly vybrány k testování schopnosti PEI podporovat silné ukotvení na plastových kultivačních miskách. Buňky PC-12 a HEK-293 byly výše popsány jako slabě kotvící. Naproti tomu buňky MYS jsou primární fibroblasty, které silně přilnou k plastovým kultivačním miskám a rostou tak, že na jejich povrchu vytvoří monovrstvu buněk. Pro testování síly ukotvení různorodých buněk na destičkách byl proveden protokol, při kterém byly provedeny 4 po sobě jdoucí promytí izotonickým pufrem, po nichž následovalo použití kolorimetrického protokolu pro počítání buněk, které zůstaly na destičce (na základě vitálního barviva neutrální červeně). Destičky předem ošetřené různými vazebnými faktory byly porovnány s destičkami, které nebyly předem ošetřeny (neošetřené). Pokusy byly prováděny ve třech opakováních a byly vypočteny průměry množství barviva zachovaného na destičkách, které byly ošetřeny jednotlivými přípravky. Tyto průměry byly normalizovány na průměr získaný při předběžné úpravě PEI, kterému byla ve všech experimentech přiřazena libovolná hodnota 100,0 %. Výsledky reprezentativních experimentů se třemi buněčnými liniemi jsou uvedeny na obrázku 3 (s každou buněčnou linií byly provedeny nejméně tři nezávislé experimenty). Buňky PC-12 se téměř stejně dobře přichytily na destičky potažené PEI, kolagenem nebo PDL (relativní počty buněk 100,0 % ± 5,3 %, 89,3 % ± 5,0 % a 96,3 % ± 5,8 % pro PEI, kolagen a PDL). Významný úbytek buněk byl však pozorován při porovnání neošetřených destiček s destičkami ošetřenými PEI s relativním počtem buněk 43,9 % ± 5,8 % (obrázek 3A). V případě HEK-293 se buňky silně přichytily jak na jamky ošetřené PEI, tak na jamky ošetřené PDL. V reprezentativním experimentu uvedeném na obrázku 3B byly relativní počty u těchto dvou ošetření 100,0 % ± 0,4 % a 96,8 % ± 1,7 %. Velký počet buněk se však ztratil, když byly naneseny do jamek bez ošetření (relativní počet 8,3 % ± 0,6 %) nebo do jamek, které byly předem ošetřeny kolagenem (11,5 % ± 1,2 %), což naznačuje, že se tyto buňky poměrně volně přichytily k plastu nebo k jamkám potaženým kolagenem. A konečně, když byly využity fibroblastové buňky (buňky MYS), zdálo se, že se buňky poměrně dobře přichytávají ke všem čtyřem povrchům, včetně neošetřených jamek (obrázek 3C). Obrázek 3C ukazuje reprezentativní graf, který zobrazuje relativní počty buněk MYS 100,0 % ± 2,2 %, 85,9 % ± 7,8 %, 73,7 % ± 6,6 % a 77,1 % ± 1,4 % u jamek předem ošetřených PEI, kolagenem nebo PDL, resp. u jamek bez ošetření. Tato buněčná linie se tedy poměrně dobře přichytává k neošetřenému plastovému povrchu ve srovnání s buněčnými liniemi PC-12 a HEK-293.
Povlak PEI podporuje pevné přichycení slabě kotvících buněk k substrátu. Ztráta buněk vyvolaná protokolem, který zahrnoval několikanásobné promývání, byla měřena za účelem posouzení pevnosti v přichycení buněk ke kultivačním miskám potaženým faktory, které podporují ukotvení buněk. PEI byl porovnáván s jinými fixačními faktory (kolagen, PDL) a s neošetřenými kontrolními miskami. Relativní počty buněk byly normalizovány přiřazením libovolné hodnoty 100,0 % miskám ošetřeným PEI. Povlak PEI vedl k významnému zvýšení pevnosti ukotvení u buněk PC-12 (graf A) a u buněk HEK-293 (graf B), což je příznivé ve srovnání s jinými běžně používanými upevňovacími faktory. U silně kotvící buněčné linie (buňky MYS, graf C) nebyly pozorovány žádné výhody. Sloupce ukazují průměr ± směrodatnou odchylku trojnásobných testů, které jsou reprezentativní pro nejméně tři různé provedené experimenty (* významně vyšší než neošetřená kontrola, p < 0,01; ** významně vyšší než neošetřená kontrola v prezentovaném experimentu, p < 0,01, ale významnost nebyla zachována v nezávislých experimentech).
Pro představu o variabilitě mezi experimenty byly pro každou buněčnou linii a ošetření vypočteny průměry ± směrodatné odchylky relativních počtů buněk získaných v nezávislých experimentech (všimněte si, že vzhledem k tomu, že ve všech experimentech byl počet pro jamky ošetřené PEI nastaven na 100,0 %, je hodnota pro globální průměr s tímto potahovacím prostředkem přesně 100,0 % pro všechny buněčné linie). Srovnávací výsledky pro ostatní ošetření jsou uvedeny níže. Pro buňky PC-12 byly relativní počty 81,5 % ± 8,8 % pro jamky ošetřené kolagenem (n = 4), 93,9 % ± 21,2 % pro jamky ošetřené PDL (n = 4) a 52,1 % ± 13,7 % pro jamky bez ošetření (n = 4). U buněk HEK-293 byly relativní počty 16,3 % ± 12,7 % pro jamky s kolagenem (n = 3), 99,6 % ± 2,5 % pro jamky s PDL (n = 3) a 9,0 % ± 4,1 % pro neošetřené jamky (n = 3). V pokusech s buňkami MYS byl průměr relativních počtů u jamek ošetřených kolagenem 92,7 % ± 16,2 % (n = 3), 71,1 % ± 6,7 % u jamek ošetřených PDL (n = 3) a 78,4 % ± 11,5 % u jamek bez ošetření (n = 3). Statistická analýza ukazuje, že zvýšení adheze buněk PC-12 i HEK-293 k miskám s PEI-preparovaným plastem oproti neošetřenému plastu je významné (p < 0,05, resp. p < 0,01, analýza t-testem), zatímco u buněk MYS není statisticky významné (p > 0,05).
Pro další charakterizaci vlastností PEI jako attachment faktoru pro slabě kotvící buňky byly provedeny experimenty s cílem analyzovat dávku PEI, která může zajistit optimální ukotvení buněk, rozsah počtu buněk, které mohou mít z přítomnosti PEI prospěch, a stabilitu PEI jako attachment faktoru. Obrázek 4A ukazuje výsledky reprezentativního experimentu testujícího sílu přichycení buněk HEK-293 na misky potažené různými dávkami PEI. Počty buněk byly normalizovány na hodnotu získanou pro ošetření 25 μg/ml PEI, která byla stanovena na 100,0 %. Výsledky ukazují, že koncentrace PEI 2,5 μg/ml nebo vyšší vedly k maximálnímu zesílení přichycení, což naznačuje, že povrch plastové misky je při těchto koncentracích plně pokryt polymerem. Zdá se, že vyšší koncentrace polymeru neměly toxické účinky na buňky, pokud byl přebytek PEI, který zůstal v roztoku, důkladně odstraněn (mírné toxické účinky byly pozorovány u koncentrace 250 μg/ml, pokud nebyl roztok po ošetření zcela odstraněn). Uvedený experiment je reprezentativní pro 4 nezávislé pokusy. Obrázek 4B představuje výsledky získané s různým počtem buněk PC-12 a HEK-293. Obrázek ukazuje relativní počty buněk, kde byla průměrnému počtu získanému z jamek ošetřených PEI s nejvyšším počtem každé buněčné linie (3,2 × 105 buněk HEK-293 a 1,5 × 106 buněk PC-12) přiřazena arbitrární hodnota 100,0 %. Výsledky naznačují, že PEI dobře fungoval jako attachment faktor v širokém rozmezí počtu buněk jak pro buňky PC-12, tak pro buňky HEK-293. Nižší počty buněk nebylo možné spolehlivě testovat, protože se blížily hranici citlivosti testu neutrální červeně. Uvedené výsledky jsou reprezentativní pro nejméně 4 nezávislé experimenty provedené s každou buněčnou linií. Obrázek 4C ukazuje výsledky experimentu provedeného za účelem testování stability PEI jako vazebného faktoru. V tomto experimentu byla sada destiček ošetřena PEI a poté uchovávána v PBS při 4 °C po dobu 10 dnů. V druhém testu byly destičky ošetřeny PEI a uchovávány (s médiem) v CO2 inkubátoru při 37 °C po dobu 3 dnů, přičemž médium bylo měněno každých 24 h. Účinnost PEI na těchto destičkách byla poté porovnána s destičkami ošetřenými PEI pomocí standardního protokolu popsaného u předchozích experimentů. Výsledky ukazují relativní počty buněk normalizované na průměr absorbancí získaných u standardních destiček ošetřených PEI, kterému byla přiřazena arbitrární hodnota 100,0 %. Výsledky ukazují, že povlak PEI zůstává na povrchu plastové misky stabilní po dobu nejméně 10 dnů chlazení a že se neodstraňuje inkubací při 37 °C v médiu ani opakovanou výměnou média. Výsledky jsou reprezentativní pro 4 nezávislé experimenty provedené ve třech opakováních.
Charakterizace vlastností PEI jako attachment faktoru. Graf A: Zvyšující se dávky PEI byly testovány za účelem určení rozsahu koncentrací pro optimální potahování. PEI vykazoval plné zesílení attachmentu při koncentracích 2,5 μg/ml a vyšších. Graf B: PEI podporoval připojení buněk PC-12 i HEK-293 v širokém rozsahu počtu buněk (počty testovaných buněk jsou uvedeny na ose X). Graf C: Povlak PEI zůstal stabilní na povrchu kultivační misky po dlouhou dobu inkubace a změny média (10d-PBS: misky ošetřené PEI inkubované 10 dní v PBS při 4 °C; 96 h-3MC: misky ošetřené PEI inkubované 96 hodin se třemi výměnami média při 37 °C). U všech grafů je ve sloupcích uveden průměr ± směrodatná odchylka trojnásobných testů, které jsou reprezentativní pro nejméně 3 nezávislé experimenty (* významně vyšší než u neošetřené kontroly, p < 0,01).
PředúpravaPEI zvyšuje lipofekci slabě kotvících buněk
Transfekce eukaryotických buněk pomocí lipofekce zahrnuje několik kroků, přidávání a výměnu médií, což si u slabě kotvících buněk může vybrat daň. I když se dbá na to, aby nedošlo ke ztrátě buněk, mohou být slabě ukotvené buňky méně účinné při příjmu transfekčních komplexů. Vzhledem k tomu, že předběžná úprava misek pro buněčné kultury PEI zvýšila pevnost přichycení buněk k těmto povrchům, předpokládalo se, že faktor přichycení může mít pozitivní vliv na výtěžnost transfekce získané lipofekcí. K ověření této hypotézy byly použity tři výše popsané buněčné linie s použitím dříve zkoumaných potahovacích látek. Transfekce byly provedeny pomocí plazmidu kódujícího reportérový enzym β-galaktosidázu. Výtěžnost transfekce byla sledována stanovením aktivity reportérového enzymu v lyzátech z transfekovaných buněk. S každou buněčnou linií byly provedeny nejméně dva nezávislé testy ve třech opakováních. Reprezentativní grafy jsou uvedeny na obrázku 5. Výtěžky (β-galaktosidázové aktivity) byly normalizovány na aktivitu získanou s PEI pre-coatingem, která byla stanovena jako referenční na 100,0 %. Obecně bylo pozorováno, že výtěžky transfekce se zlepšily u slabě kotvících buněk díky předběžnému potažení látkami, které podporují přichycení buněk k destičce. V případě buněk PC-12 vedlo předběžné potažení jamek PEI, kolagenem nebo PDL ke 2 až 3násobnému zvýšení výtěžku transfekce ve srovnání s neošetřenými jamkami: relativní výtěžek 100,0 % ± 1,4 % pro PEI, 87,0 % ± 8,7 % pro kolagen a 100,1 % ± 2,4 % pro PDL oproti 42,9 % ± 2,2 % pro neošetřené jamky (obr. 5A). Zlepšení výtěžnosti transfekce předběžnou úpravou PEI bylo výraznější u buněk HEK-293. Experiment na obrázku 5B ukazuje relativní aktivitu 21,1 % ± 3,4 % pro buňky v neošetřených jamkách ve srovnání se 100,0 % ± 8,4 % pro jamky předléčené PEI (přibližně 5násobné zvýšení). Předúprava kolagenem nebo PDL vedla ke skromnější indukci (přibližně 2- až 3násobné na obrázku 5B). Nejnižší zlepšení bylo pozorováno u kolagenu, podobně jako nižší zvýšení přichycení buněk HEK-293, které bylo dříve pozorováno na obrázku 3B. A konečně, u silně přilnavých fibroblastů MYS nebyl pozorován významný pozitivní účinek při použití faktorů přilnavosti v postupu transfekce. Odchylky byly u všech experimentálních podmínek obvykle menší než 20 %. Reprezentativní experiment uvedený na obrázku 5C ve skutečnosti ukazuje mírně vyšší výtěžnost transfekce u neošetřených jamek než u destiček ošetřených PEI (relativní aktivita 117,7 % ± 3,2 % u neošetřených jamek oproti 100,0 % ± 4 %.8 % pro jamky ošetřené PEI, tedy přibližně 1,2krát vyšší výtěžnost transfekce u kontroly).
PEI zvyšuje transfekci slabě ukotvených buněk. Výtěžek transfekce byl stanoven pomocí β-galaktosidázových testů a normalizován na výtěžek získaný při potažení kultivační misky PEI (kterému byla přiřazena arbitrární hodnota 100,0 %). PEI a další připevňovací faktory zvýšily transfekci volně se připevňujících buněčných linií, jako jsou buňky PC-12 (graf A) a buňky HEK-293 (graf B). U pevně přilnavých buněk, jako jsou fibroblasty MYS (graf C), nebyl pozorován žádný významný účinek. Sloupce ukazují průměr ± směrodatnou odchylku trojnásobných testů, které jsou reprezentativní pro nejméně dva nezávislé experimenty (* významně vyšší než u neošetřené kontroly, p < 0,01).
Při shrnutí výsledků ze všech provedených experimentů byla průměrná násobná indukce (± směrodatná odchylka) pozorovaná u výtěžnosti transfekce buněk PC-12 ukotvených na PEI ve srovnání s buňkami na neošetřených jamkách 2násobná.4násobný (± 0,1násobný; n = 3), zatímco zvýšení u buněk HEK-293 bylo 6,3násobné (± 0,5násobné; n = 2). t-testová statistická analýza ukazuje, že obě zvýšení jsou významná (p < 0,05). Při pokusech s buňkami MYS nebylo pozorováno žádné významné zvýšení transfekce, přičemž průměrná násobná změna byla 1,0násobná (± 0,3násobná; n = 2) při předběžné úpravě PEI (v podstatě totožná s výtěžkem bez úpravy).
.