Zvýšené plazmatické hladiny 8-hydroxy-2′-deoxyguanosinu (8-OHdG) u pacientů s pseudoexfoliačním glaukomem

Abstrakt

Účel. Za účelem zkoumání systémového poškození DNA vyvolaného oxidačním stresem u pacientů s pseudoexfoliačním glaukomem (PXG) jsme hodnotili plazmatické hladiny 8-hydroxy-2′-deoxyguanosinu (8-OHdG) jako markeru oxidačního poškození DNA ve srovnání s kontrolami. Kromě toho jsme také zkoumali kombinovaný vliv stavu polymorfismu lysyloxidázy podobné 1 (LOXL1) a hladin 8-OHdG na riziko PXG. Materiál a metody. Byla provedena retrospektivní studie případů a kontrol s cílem stanovit plazmatické hladiny 8-OHdG u 41 pacientů s PXG a 45 nelaukomatózních kontrol pomocí enzymatického imunosorbčního testu (ELISA). Test byl proveden duplicitně na automatickém analyzátoru ELISA. Dva běžné polymorfismy (rs1048661 a rs3835942) v genu LOXL1 byly genotypizovány pomocí Sangerova sekvenování. Výsledky. Průměrné a mediánové hladiny 8-OHdG byly významně zvýšené u případů PXG () a u mužů (). Osoby s hladinami vyššími než třetí kvartil (75% percentil) vykazovaly významně zvýšené riziko PXG (odds ratio = 4,06, 95% interval spolehlivosti (CI = 1,11-14,80, )). Srovnání v rámci skupiny a mezi skupinami ukázalo, že průměrné hladiny byly vyšší u jedinců nesoucích rizikovou variantu LOXL1 (G/G), ale nebylo to statisticky významné. V logistické regresní analýze vykazovaly jak 8-OHdG (), tak rs3835942 () statisticky významný vliv na výsledek PXG. Při zahrnutí věku, pohlaví a rs1048661 se však tento účinek ztratil. Významná pozitivní korelace byla pozorována mezi hladinami 8-OHdG a nitroočním tlakem (, ) a poměrem pohár/disk (, ). Při analýze operačních charakteristik přijímače byla navíc plocha pod křivkou statisticky významná () s hodnotou 0,635 (95% CI = 0,518-0,751). Závěr. Studie prokazuje souvislost zvýšených plazmatických hladin 8-OHdG u pacientů s PXG, což podporuje roli oxidačního stresu a zvýšené oxidační poškození DNA při vzniku PXG.

1. Úvod

Glaukom je jednou z hlavních příčin nevratné slepoty na celém světě , včetně Saúdské Arábie. V důsledku zablokovaného odtoku vodnatého moku v trabekulární síťce (TM) je zvýšený nitrooční tlak (IOP) považován za primární rizikový faktor, který vyvolává odumírání gangliových buněk sítnice (RGC) a postupnou ztrátu axonů RGC, což způsobuje glaukomatózní neuropatii zrakového nervu . Pseudoexfoliační glaukom (PXG) je často charakterizován hromaděním abnormálních fibrilárních extracelulárních materiálů v předním segmentu oka, především podél hranice zornice, což je považováno za patologický znak onemocnění . Ve srovnání s častěji se vyskytujícím primárním glaukomem s otevřeným úhlem (POAG) vykazují pacienti s PXG často agresivnější klinický průběh s vyšší IOP, většími kupulacemi, závažnými defekty zorného pole a horší prognózou s rychlou progresí onemocnění . V literatuře chybí systematické epidemiologické studie, které by zjistily přesnou prevalenci PXG v Saúdské Arábii. Bylo však zjištěno, že z přibližně 600 nových případů glaukomu registrovaných na našem glaukomovém oddělení Univerzitní nemocnice krále Abdulazíze v Rijádu je méně než 10 % těchto případů diagnostikováno s PXG.

PXG představuje komplexní a multifaktoriální onemocnění dospělých. Onemocnění zahrnuje jak genetické, tak environmentální faktory, které přispívají k etiologické patofyziologii onemocnění . Lysyloxidáze podobný gen 1 (LOXL1) je silným kandidátním genem, o němž se uvádí, že přispívá k riziku vzniku PXG u mnoha etnických skupin, včetně Saúdských Arabů. LOXL1 se podílí na tvorbě a stabilitě extracelulární matrix . Existují silné důkazy naznačující roli mechanismu (mechanismů) oxidačního stresu v patogenezi PXG . Oxidační stres je obecně vyvoláván tvorbou reaktivních forem kyslíku (ROS), jako jsou superoxid, peroxid a hydroxylové radikály, které mohou iniciovat a šířit volné radikály . Hromadění hladiny ROS v buňkách vyvolává oxidační poškození makromolekul, jako jsou lipidy, proteiny, RNA, DNA a mitochondrie, což vede k jejich buněčné dysfunkci a/nebo apoptóze . Bylo prokázáno, že oxidační stres způsobuje zvýšení IOP tím, že iniciuje degeneraci TM, a tím brání cestě odtoku vody . Mutace, haploskupiny a snížená respirační aktivita v mitochondriích byly rovněž spojeny s různými typy glaukomu . Kromě toho byl s glaukomem spojen také polymorfismus v genu pro glutathion S-transferázu (GST), což je enzym podílející se na detoxikaci peroxidovaných lipidů a různých škodlivých toxinů . Snížená aktivita GST může narušovat detoxikaci oxidativních metabolitů a zhoršovat škodlivé účinky oxidativního stresu na zrakový nerv . Celkový antioxidační stav (TAS) biologických vzorků je důležitým ukazatelem oxidačního stresu a užitečným nástrojem pro předpověď oxidačního stavu . Naše předchozí studie ukázala, že plazmatické hladiny TAS byly u pacientů s PXG ve srovnání s kontrolami významně nízké, což podporuje roli oxidačního stresu v patogenezi PXG . Kromě toho jsme také zaznamenali kombinovaný účinek alel LOXL1 a sníženého TAS, který může přispívat k celkovému riziku PXG. U lidí experimenty in vivo prokázaly, že oxidativní poškození DNA je významně hojnější v buňkách TM pacientů s glaukomem. Kromě toho jak zvýšená IOP, tak poškození zorného pole významně souvisely s množstvím oxidativního poškození DNA postihujícího buňky TM . Oxidační stres/ROS může vyvolat zlomy nebo modifikace bází v DNA, což vede k uvolňování produktů oxidace DNA, včetně 8-hydroxy-2′-deoxyguanosinu (8-OHdG) . 8-OHdG je jedním z mnoha produktů oxidace DNA, který lze snadno kvantifikovat, a běžně se používá jako biomarker pro hodnocení oxidačního poškození DNA .

Cílem této studie bylo prozkoumat systémové poškození DNA vyvolané oxidačním stresem u pacientů s PXG. Hodnotili jsme plazmatické hladiny 8-OHdG jako markeru oxidačního poškození DNA a porovnávali jsme je s nelaukomatickými zdravými kontrolami. Kromě toho jsme také zkoumali kombinovaný vliv stavu polymorfismu LOXL1 a hladiny 8-OHdG na riziko PXG.

2. Materiál a metody

2.1. Materiály a metody Studovaná populace

Studie dodržovala zásady Helsinské deklarace a byla schválena institucionální revizní komisí a etickou komisí pro výzkum (číslo schválení č. 08-657). Na základě písemného informovaného souhlasu byli do studie v Univerzitní nemocnici krále Abdulazize v Rijádu v Saúdské Arábii přijati účastníci saúdského původu se stanovenou klinickou diagnózou PXG () a etnicky odpovídající zdravé kontroly (). Kritéria pro zařazení a vyloučení pacientů a kontrol byla popsána dříve .

2.2. Příprava plazmy a DNA

Vzorky plazmy byly získány z krve EDTA po odstředění při 5500 ×g po dobu 5 minut. DNA byla extrahována z buffy vrstvy pomocí soupravy illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Až do použití se uchovávala při -80 °C.

2.3. Odhad plazmatických hladin 8-Hydroxy 2′-Deoxyguanosinu

Odhad hladin 8-OHdG byl proveden pomocí komerční soupravy (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) založené na kompetitivním sendvičovém enzymovém imunosorbčním testu (ELISA). Test byl proveden ve dvou opakováních na automatickém analyzátoru ELISA ChemWell-T (Awareness Technology Inc., FL, USA) podle pokynů výrobce. Hladiny 8-OHdG byly stanoveny s využitím standardní křivky a vyjádřeny v ng/ml.

2.4. Sekvenování LOXL1 podle Sangera

Vzorky DNA byly sekvenovány pro dva běžné polymorfismy genu LOXL1 (rs1048661 a rs3825942) s použitím primerů a amplifikačních podmínek, jak je popsáno jinde .

2.5. Sekvenování LOXL1 podle Sangera. Statistická analýza

Údaje jsou prezentovány jako průměr ± SD a medián pro spojité proměnné a jako počty a procenta pro kategorické proměnné. Testování normality pro hladiny 8-OHdG bylo provedeno pomocí Kolmogorov-Smirnovova testu. Průměrné rozdíly mezi skupinami byly testovány Studentovým t-testem. Pro porovnání mediánů hodnot mezi pacienty a kontrolami byl použit Mannův-Whitneyho U test. Kategoriální proměnné byly testovány pomocí chí-kvadrát testu a případně Fisherova přesného testu. Korelační testování bylo provedeno pomocí Pearsonovy metody. K odhadu vlivu a účinku průměrných hladin 8-OHdG a dalších rizikových faktorů na výsledek onemocnění byla provedena binární logistická regresní analýza. Byla vytvořena křivka ROC (receiver operating characteristic) a hodnota plochy pod křivkou (AUC) byla analyzována pomocí Mannova-Whitneyho testu. Byl vypočten poměr šancí (OR) a interval spolehlivosti (CI) byl stanoven na 95 %. Všechny statistické testy byly oboustranné a hodnota menší než 0,05 byla považována za statisticky významnou. Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru SPSS verze 19.0 (IBM Corp., Armonk, New York, USA) a softwaru StatView verze 5.0 (SAS Institute, Cary, NC).

3. Výsledky

3.1. Statistická analýza výsledků Studovaná populace a hladiny 8-OHdG

Jak je uvedeno v tabulce 1, mezi případy PXG a kontrolami nebyl zjištěn žádný významný rozdíl z hlediska věku, pohlaví, stavu systémového onemocnění, kouření a rodinné anamnézy glaukomu. Testování normality pro hladiny 8-OHdG ukázalo zkreslené rozdělení (). Průměrné i mediánové hladiny 8-OHdG byly u případů PXG a u mužů ve srovnání s kontrolami významně zvýšené (tabulka 1). Na obrázcích 1(a) a 1(b) je znázorněno krabicové znázornění hladin 8-OHdG podle stavu onemocnění a rozložení podle pohlaví.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

3.2. Zjištěné rozdíly mezi oběma skupinami jsou uvedeny v tabulce 1. Hladiny 8-OHdG a riziko PXG

Pro posouzení rizika PXG spojeného se zvyšujícími se hladinami 8-OHdG byly koncentrace 8-OHdG dichotomizovány (nekategorizovány jako případy a kontroly) na 50. percentil (nebo mediánovou hodnotu) a podle kvartilů (tabulka 2). Celkový medián mezní hodnoty hladiny 8-OHdG byl 17,68 ng/ml. Ačkoli případy vykazovaly při této hladině zvýšené riziko onemocnění (OR = 1,76, 95% CI = 0,75-4,15), rozdíl nebyl významný (). Podobně byly pomocí kvartilového rozdělení identifikovány dvě hraniční hladiny: 10,08 ng/ml (první kvartil neboli 25. percentil) a 27,72 ng/ml (třetí kvartil neboli 75. percentil). Na základě těchto dvou mezních hodnot pak byly subjekty rozděleny do tří skupin: méně než první kvartil, mezikvartil a více než třetí kvartil (tabulka 2). Celkově nebyl zjištěn žádný významný aditivní účinek zvyšujících se hladin 8-OHdG a výsledku PXG (χ2 = 4,87, df = 2; ). Kromě toho ve srovnání s hladinami 8-OHdG nižšími než první kvartil (<10,08 ng/ml) vykazovaly osoby s mezikvartilovými hladinami nesignifikantně zvýšené riziko onemocnění (OR = 2,50, 95% CI = 0,81-7.63, ), zatímco subjekty s hladinami vyššími než třetí kvartil (75. percentil) vykazovaly významné zvýšené riziko PXG (OR = 4,06, 95% CI = 1.11-14,80, ).

3.3. Riziko pseudoexfoliačního glaukomu. Hladiny 8-OHdG a polymorfismy LOXL1

Dále jsme zkoumali vliv genotypu polymorfismů rs1048661 (g.5758 G>T) a rs3825942 (g.5758 G>A) v genu LOXL1 na hladiny 8-OHdG u případů PXG a kontrol. Celkově, jak ukazuje tabulka 3, nebyl zjištěn žádný významný rozdíl mezi hladinami 8-OHdG a různými genotypy pro oba polymorfismy LOXL1 (obr. 1c) a 1d).

U rs1048661 byl nejčastějším genotypem G/G, následovaný G/T a T/T. V případě rs1048661 byl nejčastějším genotypem G/G, následovaný G/T a T/T. V případě rs1048661 byl nejčastějším genotypem G/G. Ve skupině pacientů nebyla pozorována žádná homozygotnost T/T ve srovnání s jedinou u kontrol. Průměrné hladiny 8-OHdG byly pozorovány jako nejvyšší u genotypů G/G ve srovnání se skupinami G/T, T/T nebo G/T + T/T. V případě genotypů G/G a T/T byla zjištěna nejvyšší hladina 8-OHdG. Tyto hladiny se však významně nelišily ani v rámci srovnání studovaných skupin, ani mezi nimi.

Podobně u rs383592 byl nejčastějším genotypem G/G, následovaný genotypy G/A a A/A, přičemž druhý jmenovaný genotyp se u pacientů s PXG nevyskytoval. G/G byl nejčastějším genotypem vykazujícím nejvyšší hladiny 8-OHdG v porovnání se skupinami G/A, A/A nebo G/A + A/A. Ve srovnání se skupinami G/A, A/A a G/A + A/A byl G/G nejčastějším genotypem vykazujícím nejvyšší hladiny 8-OHdG. U genotypů G/G se hladiny mezi případy a kontrolami významně nelišily (). Kromě toho srovnání v rámci skupiny u kontrol také neprokázalo žádný významný vliv genotypu na 8-OHdG u genotypů G/A (), A/A, () a G/A + A/A () ve srovnání s genotypem G/G.

3.4. Vliv genotypu na 8-OHdG u případů s genotypem G/A (), A/A, () a G/A + A/A (). Hladiny 8-OHdG a další rizikové faktory

S cílem prozkoumat vliv věku, pohlaví, polymorfismů LOXL1 a hladin 8-OHdG u pacientů s PXG byla provedena binární logistická regresní analýza s použitím nemocný/nemocný jako závislé proměnné (výsledek). Analýza ukázala, že jak 8-OHdG (), tak rs3835942 () mají statisticky významný vliv na výsledek onemocnění. V kombinované analýze s věkem, pohlavím, 8-OHdG, rs1048661 a rs3835942 však žádný z těchto rizikových faktorů nevykazoval významný vliv na PXG (tabulka 4).

3,5. Korelace mezi 8-OHdG a dalšími glaukomovými ukazateli u pacientů s PXG

Byla pozorována významná pozitivní korelace mezi 8-OHdG a IOP (, ) a poměrem pohár/disk (, ), na rozdíl od žádné korelace s věkem (, ) a počtem antiglaukomových léků (, ).

3.6. Korelace mezi 8-OHdG a IOP (, ) a poměrem pohár/disk (, ). Křivka ROC a 8-OHdG

ROC křivka analýzy hladin 8-OHdG u pacientů s PXG a kontrol ukázala AUC 0,635 (95% CI = 0,518-0,751), která byla statisticky významná (), což naznačuje, že plazmatické hladiny 8-OHdG mohou uspokojivě rozlišovat mezi pacienty s PXG a kontrolami.

4. Diskuse

Zvýšené ROS, oxidační poškození a nerovnováha mezi prooxidačním a antioxidačním stavem jsou kritickými faktory, které významně přispívají ke glaukomatózní neurodegeneraci . Tato studie uvádí zvýšené hladiny systémového 8-OHdG, markeru poškození DNA vyvolaného oxidačním stresem, u pacientů s PXG.

Poškození DNA může být způsobeno vnějšími i vnitřními činiteli, jako je ionizující záření, ultrafialové záření, toxické chemické látky/kovové ionty a ROS vznikající jako důsledek normálního buněčného metabolismu kyslíku . Endogenní procesy, které mohou pravděpodobně přispívat k probíhajícímu poškození DNA in vivo, zahrnují oxidativní metylaci, depurinaci a deaminaci . Poškození vyvolaná ROS zahrnují léze bází a cukrů, příčné vazby proteinů a DNA a jednořetězcové/dvouřetězcové zlomy. Kromě toho je báze guanin nejnáchylnější k oxidačním modifikacím kvůli svému nejmenšímu redoxnímu potenciálu . Nejčastějším vedlejším produktem vznikajícím v důsledku oxidační modifikace guaninu hydroxylovým radikálem je 8-hydroxyguanin (8-OH-Gua) a jeho 2′-deoxynukleosidový ekvivalent, 8-OHdG, který je navrhován jako vynikající marker oxidačního poškození DNA . Řada studií poskytla přesvědčivé důkazy o souvislosti mezi zvýšenou hladinou 8-OHdG a glaukomatózní optickou neuropatií .

Počáteční studie na lidských vzorcích TM získaných během filtrační operace prokázaly přítomnost vysokých hladin 8-OHdG u pacientů s glaukomem . Ve studii Sorkhabiho a kol. zahrnující 15 pacientů s POAG a 13 pacientů s PXG byly u pacientů ve srovnání s kontrolami vysoké hladiny 8-OHdG ve vodném moku (AH) i v séru . Podobně byly zaznamenány vysoké hladiny 8-OHdG v séru u pacientů s primárním glaukomem s uzavřeným úhlem ve srovnání s normálními jedinci . Yuki a Tsubota uváděli, že zvýšená hladina 8-OHdG/kreatininu v moči souvisí s progresí glaukomatózního zorného pole u osob s glaukomem s normálním napětím . Podobně v další nedávné studii Mohantyho a kol. byly plazmatické i AH hladiny 8-OHdG významně vyšší u pacientů s POAG ve srovnání s kontrolními osobami s kataraktou . Tento efekt byl přisuzován snížené expresi DNA reparačních enzymů dráhy opravy excize bází . Kromě toho studie také zaznamenala silnou pozitivní korelaci mezi systémovými (plazmatickými) hladinami 8-OHdG a hladinami AH 8-OHdG, což naznačuje, že systémové hladiny 8-OHdG by mohly předpovídat lokální hladiny 8-OHdG v oku .

Přesná role 8-OHdG a/nebo oxidačního stresu vedoucí k rozvoji a progresi glaukomatózní optické neuropatie je stále spekulativní. 8-OHdG patří mezi nejlépe charakterizované oxidační léze a může vést ke vzniku transverzních mutací C : G na A : T . Některé léze v DNA podléhají buněčné opravě pomocí mechanismů opravy DNA in vivo, které poškozenou DNA odštěpují . Selhání opravy těchto poškození však může mít závažné biologické důsledky a může vést ke karcinogenezi nebo rozvoji neurodegenerativních poruch . 8-OHdG může také významně indukovat zkracování telomer, které může přispívat k fyziologickým a patologickým stavům in vivo . Kromě toho se předpokládá, že 8-OHdG může mít v buňkách vystavených oxidačnímu stresu regulační úlohu podobnou epigenetické regulaci genové transkripce . Kromě toho byly dobře zdokumentovány abnormální účinky oxidačního stresu a ROS v patogenezi glaukomu prostřednictvím zvýšené IOP a/nebo hypoxie, degenerace TM, poškození gliových buněk, autofagie, poškození mtDNA, aktivace nukleární kappa B, peroxynitritového stresu a oční hemodynamiky stimulující apoptózu a zánětlivé dráhy podporující smrt RGC a poškození zrakového nervu . Zvýšené hladiny 8-OHdG pozorované v naší studii mohou pravděpodobně přispívat k patogenezi PXG podobným mechanismem (mechanismy).

Silná asociace dvou missense variant, rs1048661 a rs3825942, v genu LOXL1 s PXG byla konzistentně replikována u mnoha etnických skupin včetně Saúdských Arabů . Úplné pochopení této genetické asociace s patologií PXG není dosud známo; byla však postulována řada mechanismů. Patří mezi ně jeho vliv na tvorbu elastinu, změněná exprese LOXL1, splicing-efekt nebo možnost jejich asociace/spojení se skutečnou neidentifikovanou funkční alelou . Zkoumali jsme genotypový vliv těchto dvou běžných variant na 8-OHdG a jejich kombinovaný vliv na riziko PXG. Nebylo zjištěno, že by genotypy ovlivňovaly hladiny 8-OHdG, ačkoli u rizikových variant (G/G) byly hladiny vysoké. Bylo zjištěno, že jak 8-OHdG, tak rs3835942 jsou významnými rizikovými faktory pro PXG. Tento význam se však ztratil v kombinované analýze, která zahrnovala také věk, pohlaví a genotypy rs1048861. Pravděpodobným vysvětlením této ztráty a absence jakéhokoli významného účinku by mohl být nedostatečný počet v jednotlivých skupinách genotypů.

Zvýšená IOP a poškození zorného pole byly významně korelovány s množstvím oxidačního poškození DNA v buňkách TM . Podobně i IOP a poměr pohár/disk vykazovaly v naší studii významnou pozitivní korelaci s hladinou 8-OHdG, což naznačuje jeho možnou využitelnost jako markeru závažnosti onemocnění. Kromě toho řada zpráv potvrzuje existenci inverzního vztahu mezi antioxidačním obranným mechanismem (mechanismy) a oxidačním stresem v patofyziologii glaukomu . Naše skupina také dříve zaznamenala významně snížený celkový antioxidační stav (TAS) v plazmě u pacientů s PXG ve srovnání s kontrolami . Je zajímavé, že hladiny TAS byly k dispozici u pacientů s PXG (nikoli u kontrol; údaje nejsou uvedeny) zahrnutých do této studie, která prokázala významnou negativní korelaci mezi 8-OHdG a TAS u pacientů s PXG (, ), což podporuje pravděpodobnou roli zvýšeného oxidačního stresu a snížených antioxidačních obranných mechanismů u PXG.

Zjištění této studie vyžadují opatrnou interpretaci vzhledem k jejím určitým omezením. Zaprvé musíme vzít na vědomí skutečnost, že systémové zvýšení 8-OHdG nemusí přesně odrážet situaci v přední komoře oka, kde jsou buňky/tkáně neustále vystaveny většímu množství inzultů volných radikálů, a tudíž se přímo podílejí na vzniku a progresi glaukomu prostřednictvím mechanismů oxidačního stresu. To by vyžadovalo další ověření ve vzorcích AH. Za druhé, studie má čistě popisný charakter a neposkytuje žádné časové nebo mechanistické důkazy ani nenaznačuje žádné kauzální důsledky zvýšené hladiny 8-OHdG u PXG. A konečně, v této studii byl zkoumán relativně malý počet vzorků. Replikace na mnohem větším souboru by pozorování této studie jistě posílila. Nicméně vzhledem k průměrnému rozdílu (velikosti účinku) 13 ng/ml v koncentraci 8-OHdG, jak byl pozorován mezi případy PXG a kontrolami, s průměrnou směrodatnou odchylkou 20 a chybou typu I 0,05 (oboustranná), vykazuje tato studie sílu >80 %.

5. Závěr

Závěrem lze říci, že studie prokazuje zvýšenou hladinu systémového 8-OHdG u pacientů s PXG, což podporuje souvislost tohoto markeru s PXG a pravděpodobnou roli oxidačního stresu a zvýšeného oxidačního poškození DNA v etiologii PXG.

Data Availability

Veškeré údaje podporující závěry tohoto článku jsou uvedeny v článku.

Etické schválení

Studie se řídila zásadami Helsinské deklarace a byla schválena Institutional Review Board a Research Ethics Committee of College of Medicine, King Saud University, Riyadh, Saudská Arábie.

Souhlas

Písemný informovaný souhlas byl získán od všech účastníků před jejich zařazením do této studie.

Konflikty zájmů

Autoři neuvádějí žádné konflikty zájmů. Financující subjekt se nepodílel na návrhu studie, na sběru, analýze a interpretaci dat ani na psaní rukopisu. Za obsah a napsání článku jsou zodpovědní výhradně autoři.

Poděkování

Autoři by rádi poděkovali proděkanovi pro vědecký výzkum a katedře pro výzkum gluakomu v oftalmologii na Univerzitě krále Saúda, jejichž prostřednictvím byla tato práce podpořena.

.