21-hydroxylase autoantistof (21-OH Ab) ELISA-kittet er kun beregnet til brug af professionelle personer til kvantitativ bestemmelse af 21-OH Ab i humant serum. Autoimmun ødelæggelse af binyrebarken er den mest almindelige årsag til Addisons sygdom, og autoantistoffer mod det binyrebarkenspecifikke enzym steroid 21-hydroxylase er vigtige markører for binyrebarkens autoimmunitet. Dette kan være tilfældet, hvis sygdommen viser sig som Addisons sygdom eller som en del af de autoimmune polyglandulære syndromer (APS) type I eller type II.
I 21-OH Ab-ELISA-sættet får 21-OH Ab i patienters sera, kalibratorer og kontroller lov til at interagere med 21-OH, der er belagt på ELISA-pladens brønde. Efter 16-20 timers inkubation kasseres prøverne og efterlader 21-OH Ab bundet til den 21-OH-belagte 21-OH-belægning på brøndene. 21-OH-Biotin tilsættes i et andet inkubationstrin, hvor 21-OH Ab’s evne til at virke divalent gør, at der dannes en bro mellem 21-OH immobiliseret på pladen og 21-OH-Biotin. Mængden af 21-OH-Biotin, der er bundet, bestemmes derefter i et tredje inkubationstrin, hvor der tilsættes streptavidinperoxidase (SA-POD), som binder specifikt til biotin. Overskydende, ubundet SA-POD vaskes derefter væk, og tilsætning af peroxidasesubstratet 3,3′,5,5,5′-tetramethlybenzidin (TMB) resulterer i dannelse af en blå farve. Denne reaktion stoppes ved tilsætning af en stopopløsning, hvorved indholdet af brønden bliver gult. Absorbansen af den gule reaktionsblanding ved 450nm og 405nm aflæses derefter ved hjælp af en ELISA-pladelæser. En højere absorbans indikerer tilstedeværelsen af 21-OH Ab i testprøven. Aflæsning ved 405nm giver mulighed for at kvantificere høje absorbanser. Det anbefales, at værdier under 1 U/ml måles ved 450nm. Hvis det er muligt at aflæse ved kun én bølgelængde, kan 405nm anvendes. Måleintervallet er 0,3 – 100 U/ml (arbitrære enheder).