4-1BB/4-1BBL-interaktion fremmer fedmeinduceret fedmeinflammation ved at udløse bidirektionel inflammatorisk signalering i adipocytter/makrofager

Abstract

Fedmeinduceret fedmeinflammation er karakteriseret ved rekruttering af makrofager til fedtvævet og frigivelse af inflammatoriske cytokiner. 4-1BB, en kostimulerende receptor, modulerer inflammatoriske processer gennem interaktion med sin ligand 4-1BBL på immuncelleoverflader. I denne undersøgelse undersøgte vi, om et 4-1BB/4-1BBL-interaktion mellem adipocytter og makrofager deltager i fedmeinduceret fedmeinflammation. Vi fandt, at 4-1BB blev udtrykt på adipocytter og blev opreguleret af fedmerelaterede faktorer, hvilket også øgede 4-1BBL-ekspressionen på makrofager. 4-1BB og/eller 4-1BBL agonister aktiverede henholdsvis inflammatoriske signalmolekyler (MAPK/IκBα og MAPK/Akt) i adipocytter og makrofager og øgede frigivelsen af inflammatoriske cytokiner (MCP-1, TNF-α og IL-6). Desuden mindskede afbrydelse af 4-1BB/4-1BBL-interaktionen frigivelsen af inflammatoriske cytokiner fra kontaktkokulturerede adipocytter/makrofager. Disse resultater tyder på, at 4-1BB/4-1BBL-medieret bidirektionel signalering i adipocytter/makrofager fremmer fedmeinflammation. 4-1BB og 4-1BBL kan være nyttige mål for beskyttelse mod fedmeinduceret fedmeinflammation.

1. Introduktion

Fedmeinduceret inflammation anses for at være en potentiel årsag til metaboliske lidelser såsom insulinresistens, type 2-diabetes og hjerte-kar-sygdomme . Adiposevæv deltager aktivt i fedmeinduceret inflammation gennem rekruttering af makrofager og T-celler og frigivelse af inflammatoriske cytokiner (monocyte kemotaktisk protein-1, MCP-1; tumornekrosefaktor alfa, TNF-α; interleukin-6, IL-6), som modulerer adipocytdifferentiering, metabolisme og lokale/systemiske inflammatoriske reaktioner, hvilket forårsager uønskede metaboliske ubalancer . Interessant nok har nyere undersøgelser vist, at direkte kontaktkokultur af adipocytter og makrofager resulterer i en markant forhøjet frigivelse af inflammatoriske cytokiner , hvilket tyder på, at interaktion mellem celleoverflademolekyler på disse celler er vigtig for at fremme deres inflammatoriske reaktioner.

4-1BB (også kendt som CD137 og TNFRSF9) er et klassisk eksempel på et kostimulerende molekyle og en velkendt inflammatorisk receptor, der udtrykkes af aktiverede T-celler på inflammationssteder . Stimulering af 4-1BB på T-celler fører til celleudvidelse, cytokinproduktion og udvikling af cytolytiske effektorfunktioner . 4-1BB-ligand (4-1BBL, også kendt som CD137L og TNFSF9) udtrykkes i høj grad af de fleste immunceller og mange ikke-immune celler og kan modtage og transmittere omvendte signaler til celler som f.eks. makrofager . Der er stadig flere beviser for, at de bidirektionelle 4-1BB/4-1BBL-interaktioner på celleoverfladen i immunceller er kritiske for igangsætning og modulering af forskellige inflammatoriske reaktioner (f.eks. reumatoid arthritis, autoimmun myokarditis og hæmatologiske maligniteter) . Desuden forekommer 4-1BB/4-1BBL-medierede interaktioner også mellem immunceller og ikke-immune celler, hvilket igen påvirker de inflammatoriske reaktioner. For eksempel er interaktion mellem 4-1BB og 4-1BBL på endothelceller og makrofager involveret i vaskulær inflammation , og interaktion mellem de to molekyler på epitelceller og naturlige dræberceller er involveret i iskæmi-reperfusionsskade på nyrerne . Vi har tidligere vist, at ekspression af 4-1BB og 4-1BBL var opreguleret i fedtvæv, der var betændt på grund af fedme, og at ablation af 4-1BB reducerede fedtinflammation . Derfor antog vi, at interaktion mellem 4-1BB og 4-1BBL på fedtceller og immunceller som f.eks. makrofager spiller en rolle i fedtinflammation ved fedme.

I denne undersøgelse viser vi for første gang, at 4-1BB udtrykkes på adipocytter og opreguleres af fedmerelaterede faktorer, og vi viser, at 4-1BB/4-1BBL-medieret bidirektionel signalering i adipocytter/makrofager spiller en afgørende rolle i initiering og fremme af den fedmeinducerede fedmeinflammationskaskade.

2. Materialer og metoder

2.1. Dyr

C57BL/6-mus (han, 8 uger gamle) (Orient Ltd., Busan, Korea) blev fodret med en fedtholdig diæt (HFD, 60 % af kalorierne fra fedt (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA); overvægtige mus) eller en fedtfattig diæt (LFD; 10 % af kalorierne fra fedt (Research Diets); ikke-fedtsyge mus) i 9 uger. Alle dyreforsøg blev godkendt af den dyreetiske komité ved universitetet i Ulsan og var i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health.

2.2. Antistoffer

Nude mus blev primet med pristane og injiceret intraperitonealt med et subklonet hybridom, der producerer et agonistisk monoklonalt antistof (Ab) mod 4-1BB (3E1) for at fremkalde ascitdannelse . Det monoklonale Ab blev oprenset fra ascitesvæsken ved affinitetskolonnekromatografi med protein G-Sepharose (Sigma-Aldrich). Rekombinant 4-1BB Fc (r4-1BB Fc) blev købt hos Adipogen (Seoul, Korea). Antagonistisk monoklonalt Ab mod 4-1BBL (TKS-1) blev købt fra e-Bioscience (San Diego, CA, USA). Immunoglobulin G fra rotte (Rat IgG) og humant IgG1 blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) og anvendt som kontrol.

2.3. Cellekulturer og behandlinger

Den murine makrofagcellelinje Raw264.7 blev opnået fra den koreanske cellelinjebank (KCLB40071, Seoul, Korea). Denne cellelinje blev vedligeholdt i RPMI1640 (Gibco BRL, NY, USA) indeholdende 10 % (vol/vol) FBS (føtal bovin serum) (Gibco BRL, NY, USA) og blev inkuberet ved 37 °C i befugtet 5 % CO2. 3T3-L1 præadipocytter blev holdt i DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) med højt glukoseindhold (Gibco BRL, NY, USA) indeholdende 10 % FBS. Konfluente 3T3-L1 præadipocytter (dag 0) blev inkuberet i DMEM indeholdende 10 μg/mL insulin (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (dexamethason, Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (3-isobutyl-1-methyl-xanthin, Sigma-Aldrich) og 10 % FBS i 2 dage. Kort fortalt blev 3T3-L1-celler differentieret til modne adipocytter ved inkubation i DMEM med 10 % FBS og 5 μg/mL insulin i 2 dage. Modne adipocytter blev vedligeholdt i dette medium, og kulturmediet blev erstattet med frisk medium hver 2. dag. Fri fedtsyre (FFA, palmitinsyreblanding, Sigma-Aldrich) blev opløst i ethanol indeholdende bovin serumalbumin (BSA, 25 μM) og konjugeret med BSA i et 10 : 1-molforhold før brug. 3T3-L1 adipocytter (3 × 105 celler/brønd) eller Raw264.7 makrofager (3 × 105 celler/brønd) i 24-hulsplader blev behandlet med fedmerelaterede faktorer (palmitinsyre : pal, lipopolysaccharid : LPS) i henholdsvis 24 timer eller 4 timer. For at stimulere 4-1BB på adipocytter blev 3T3-L1 adipocytter på 24-hulsplader inkuberet med agonistisk 4-1BB Ab (3E1, 1 μg/mL) eller rotte IgG i 48 h i serumfrit medium. For at immobilisere r4-1BB Fc eller human IgG1 på kulturplader blev r4-1BB Fc eller human IgG1 inkuberet i 24-brøndeplader ved 37 °C i 1 time i et CO2-inkuberingsapparat, og brøndene blev skyllet med fosfatbufferet saltvand (PBS). Pladerne blev derefter inkuberet med RPMI (10 % FBS) ved 37 °C i 1 time i et CO2-inkuberingsapparat, og brøndene blev skyllet med PBS. Rå264.7-makrofager blev inkuberet med 5 × 105 celler/brønd i 24 brønde fladbundede plader præcoated med 100 ng/mL r4-1BB Fc eller human IgG1 i 24 timer.

2.4. Isolering af stromale vaskulære celler fra fedtvæv

For at isolere den stromale vaskulære fraktion (SVF) af fedtvæv blev epidididymiale fedtpuder af C57BL/6-mus (han, 8 uger gamle) hakket og fordøjet i 30 minutter ved 37 °C med type 2 kollagenase (1 mg/mL; Sigma-Aldrich) i DMEM (pH 7,4). De resulterende suspensioner blev centrifugeret ved 500 g i 5 minutter. Pelleterne blev resuspenderet i erytrocytlysisbuffer, og suspensionerne blev inkuberet ved stuetemperatur i 3 minutter og derefter centrifugeret ved 500 g i 5 minutter. Efter vask i DMEM blev suspensionerne passeret gennem sterile 100 μm nylonmasker (SPL Lifescience, Pocheon, Korea). De filtrerede celler blev overført til 100 mm2 skåle indeholdende DMEM suppleret med 10 % FBS og 0,4 % Fungizone og opbevaret i et inkubator ved 37 °C i 5 % CO2. Cellerne fik lov til at sætte sig fast, og flydende celler blev fjernet ved sugning, og kulturmediet blev genopfyldt hver dag. SVF-cellerne blev indsamlet efter 2 dage. SVF-cellerne blev udplottet med 5 × 105 celler pr. brønd i 24 brønde plader. De konfluente SVF-afledte præadipocytter blev differentieret til adipocytter ved behandling med DMEM indeholdende 10 μg/mL insulin (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (Sigma-Aldrich) og 10 % FBS i 2 dage. Modne adipocytter blev vedligeholdt i kulturmediet, der blev erstattet med frisk medie hver 2. dag. For at påvise 4-1BB- og 4-1BBL-ekspression på SVF-afledte adipocytter, der blev udsat for fedmefaktorer, blev disse celler inkuberet med palmitinsyre 250 μM, LPS 100 ng/mL i 24 timer.

2.5. Isolering af peritoneale makrofager

C57BL/6-mus (han, 8 uger gamle) blev intraperitonealt injiceret med 3 ml 3% thioglykolat-bouillon (Difco, Detroit, MI, USA) 4 dage før de blev aflivet. Peritoneale makrofager blev opsamlet ved centrifugering i MEM-medium (Minimum Essential Medium, Gibco), og den resulterende pellet blev vasket og resuspenderet i kulturmedium MEM med 10 % FBS. De peritoneale makrofager blev oprenset ved at klæbe til vævskulturplader i 2 timer . For at påvise 4-1BB- og 4-1BBL-ekspression på peritoneale makrofager, der var udsat for fedmefaktorer, blev disse celler inkuberet med palmitinsyre 250 μM, LPS 100 ng/mL i 4 timer.

2.6. Samkultur af adipocytter og makrofager

3T3-L1 adipocytter blev dyrket og differentieret i 6 dage. Kokultur af adipocytter og makrofager blev udført ved hjælp af to metoder: direkte kontaktkokultur og transwell-kokultur. I det direkte kontaktsystem blev Raw264.7-makrofager (3 × 105 celler: 50 % makrofager, 3 × 104 celler: 10 % makrofager) eller peritoneale makrofager (3 × 105 celler) anbragt i 24-hulsplader indeholdende 3T3-L1 adipocytter (3 × 105 celler). Cellerne blev dyrket i 24 timer i kontakt med hinanden og høstet. Som kontrol blev adipocytter og makrofager også dyrket separat med samme antal celler pr. brønd som i kontaktsystemet, og de blev blandet efter høst. I trans-well-systemet blev cellerne dyrket sammen ved hjælp af trans-well-indsatser med en 0,4 μm porøs membran (Corning, NY, USA) for at adskille adipocytter (3 × 105 celler, nederste brønd) fra makrofager (3 × 105 celler, øverste brønd). Efter inkubation i 4 h, 8 h og 12 h blev supernatanterne høstet.

2.7. Måling af cytokinniveauer

Cytokinniveauerne i kultursupernatanterne blev målt ved hjælp af enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Assays blev udført ved hjælp af OptEIA mus TNFα, et mus MCP-1-sæt (BD Bioscience Pharmingen, CA, USA) og et mus IL-6- og adiponectin-sæt (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) samt IL-10-sæt (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Værdier for cytokinniveauer blev udledt af standardkurver ved hjælp af kurvetilpasningsprogrammet SOFTmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

2.8. Kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR)

Total RNA ekstraheret fra dyrkede celler blev omvendt transskriberet for at generere cDNA ved hjælp af M-MLV omvendt transkriptase (M-MLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA). Realtids-PCR-amplifikation af cDNA’et blev udført i to eksemplarer med et SYBR premix Ex Taq-kit (TaKaRa Bio Inc., Foster, CA, USA) ved hjælp af en Thermal Cycler Dice (TaKaRa Bio Inc., Japan). Alle reaktioner blev udført efter samme procedure: indledende denaturering ved 95 °C i 10 s, efterfulgt af 45 cyklusser på 95 °C i 5 s og 60 °C i 30 s. Alle værdier for gener af interesse blev normaliseret til værdier for husholdningsgener (36B4 for adipocytter; β-actin for makrofager og kokulturer). De anvendte primersekvenser for mus er vist i tabel 1.

Data blev analyseret ved hjælp af Thermal Cycler Dice Real Time System Software (Takara Bio, Inc.). Relative standardkurver blev genereret ved at plotte cykletærskelværdierne (Ct). På grundlag af Ct-værdierne fra hver prøve blev de relative mængder af målgenerne beregnet ved hjælp af standardkurverne med software leveret af Takara Thermal Cycler Dice Real Time System.

2.9. Adskillelse af adipocytter og makrofager

Kokulturerede 3T3-L1 adipocytter og Raw264.7 makrofager i samme antal (som beskrevet tidligere) blev adskilt efter producentens protokol ved hjælp af CD11b MicroBeads-systemet (MACS; Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, USA). Kort fortalt blev kokulturerede celler indsamlet, vasket to gange med buffer (PBS suppleret med 2 mM EDTA og 0,5 % bovin serumalbumin-BSA) og inkuberet med CD11b-mikroperler i 15 min. ved 4 °C. De vaskede og resuspenderede celler blev påført MACS-kolonnen, som tilbageholdt CD11b+-celler og lod negative celler (adipocytter) passere igennem. Kolonnen blev derefter fjernet fra separatoren og anbragt på et egnet opsamlingsrør. Der blev pipetteret en passende mængde kolonnebuffer på kolonnen for at skylle positive celler (makrofager) ud ved hjælp af en stempel, der leveres sammen med kolonnen. Denne metode resulterede i 90-95 % rene CD11b+ celler, som vurderet ved flowcytometri.

2.10. Flowcytometri (FACS)-analyse

3T3-L1 adipocytter og Raw264.7 makrofager behandlet med fedmerelaterede faktorer (som beskrevet tidligere) blev forsigtigt trypsiniseret, vasket to gange i PBS og inkuberet med Fcγ-receptorblokerende antistoffer (24G2) i 10 minutter på is, hvorefter de blev farvet med phycoerythrin (PE) konjugeret anti-4-1BB (eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-4-1BBL (eBioscience) eller anti-Rat (eBioscience), Golden Syrian Hamster IgG (eBioscience) og anti-CD11b (eBioscience) som en kontrol for at definere porten for adipocytter/makrofager. Cellerne blev derefter vasket med FACS-buffer og analyseret på en FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) med CellQuest-software (BD Biosciences). Tallene i graferne angiver procentdelen af positive celler.

2.11. Western Blot-analyse

3T3-L1 adipocytter blev udplottet med 1 × 106 celler/brønd i 6-hulsplader og inkuberet med 3E1 (1 μg/mL) eller rotte-IgG i 3 h. Raw264.7-makrofager blev udplottet med 1 × 106 celler/brønd i 6-hulsplader belagt med r4-1BB Fc eller human IgG i 1 h. De 3E1-behandlede adipocytter og r4-1BB Fc-behandlede makrofager blev skyllet med PBS, resuspenderet ved skrabning i lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM MgCl2, 0,5 % deoxycholat, 1 % IGEPAL og proteasehæmmercocktail) og centrifugeret ved 3000 rpm i 5 minutter. Prøver indeholdende 10-30 μg total protein blev underkastet western blot-analyse med polyklonale antistoffer mod phosphoryleret IKK (I kappa B kinase alpha/beta; p-IKK α/β, Ser180/Ser181), total IKKβ, p-p38 MAPK (mitogen-aktiveret-protein kinase), p-JNK (c-Jun amino-terminal kinase), total JNK, p-Akt (proteinkinase B; Ser473), samlet Akt (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), og IκBα (inhibitor of nuclear factor-κB alpha; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) og β-actin (Sigma).

2.12. Statistisk analyse

Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SEM af tre uafhængige udført i to eksemplarer. Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af Student’s -test eller ANOVA med Duncan’s multiple-range-test. Forskelle blev anset for at være signifikante ved .

3. Resultater

3.1. Ekspression af 4-1BB og 4-1BBL i adipocytter/makrofager og adiposvæv

Vi målte først ekspressionen af 4-1BB under adipogenese på mRNA-niveau ved hjælp af qRT-PCR. Vi fandt, at niveauerne af 4-1BB-transskriptioner var større i SVF-afledte adipocytter efter differentiering (Figur 1(a)). Det er vigtigt, at fedmerelaterede stoffer såsom palmitinsyre og LPS signifikant opregulerede niveauerne af 4-1BB-transskriptioner i SVF-afledte adipocytter og 4-1BBL-transskriptioner i peritoneale makrofager (Figur 1(b)). Opreguleringen af transkriptionerne bekræftes i 3T3-L1 adipocytter og/eller Raw264.7 makrofager (Figur 1(c)). FACS-analyse viste også, at 4-1BB-protein på 3T3-L1 adipocytter og 4-1BBL-protein på Raw264.7-makrofager (Figur 1(d)) blev forøget af disse fedmerelaterede faktorer. Desuden steg 4-1BB- og 4-1BBL-transskriptionerne i kokulturerede adipocytter/makrofager (figur 1(e)) samt i epidididymalt fedtvæv hos overvægtige mus, der fik HFD (figur 1(f)).

3.2. Frigivelse af inflammatoriske cytokiner og aktivering af inflammatoriske signalmolekyler ved 4-1BB- og 4-1BBL-stimulering i adipocytter og makrofager, henholdsvis

For at undersøge, om 4-1BB på adipocytter eller 4-1BBL på makrofager giver et inflammatorisk signal, behandlede vi hver celletype med agonister, der specifikt stimulerer disse molekyler; 3T3-L1 adipocytter blev behandlet med et agonistisk 4-1BB-antistof (3E1) i 48 h, og Raw264.7 makrofager med r4-1BB-Fc i 24 h, og vi målte derefter niveauerne af inflammatoriske cytokiner i de respektive celler. Både 4-1BB-stimulering af adipocytter og 4-1BBL-stimulering af makrofager øgede markant produktionen af proinflammatoriske cytokiner såsom MCP-1, TNF-α og IL-6 på mRNA- (figur 2(a) og 2(c)) og proteinniveau (figur 2(b) og 2(d)). Adiponectinudskillelsen fra adipocytter blev ikke ændret ved 4-1BB-stimulering (data ikke vist). 4-1BBL-stimulering af makrofager mindskede transskriptionerne af IL-10 (figur 2(c)), men der blev ikke observeret nogen ændring i IL-10-proteinfrigivelsen (figur 2(d)).

For at forstå de molekylære mekanismer, hvormed 4-1BB og/eller 4-1BBL aktiverer inflammatorisk signalering i adipocytter og/eller makrofager, undersøgte vi virkningerne af 4-1BB/4-1BBL-stimulering på intracellulære signalmolekyler. Stimulering af 4-1BB på adipocytter øgede fosforyleringen af p38 MAPK og JNK samt fosforyleringen af IKK, opstrømsmolekylet for NF-κB, og inducerede IκBα-nedbrydning (Figur 2(e)), mens stimulering af 4-1BBL øgede fosforylering af Akt og p38 MAPK og JNK (figur 2(f)), men havde ingen virkning på nedbrydning af IκBα-protein (figur 2(f)) og fosforylering af IKK (data ikke vist). I overensstemmelse med tidligere rapporter , 4-1BBL-signalering aktiverede ikke kun p38 MAPK, men inducerede også Akt-aktivering i makrofager, hvilket førte til øget ekspression af inflammatoriske cytokiner.

3.3. Frigivelse af inflammatoriske cytokiner i et kontaktkokultursystem

Da 4-1BB/4-1BBL-stimulering øgede frigivelsen af inflammatoriske cytokiner fra henholdsvis adipocytter og/eller makrofager, undersøgte vi, om celle-celle-interaktion via overflademolekyler, formodentlig 4-1BB/4-1BBL, har en rolle i initiering og udløsning af inflammatoriske reaktioner. Vi dyrkede først 3T3-L1 adipocytter og Raw264.7 makrofager i et direkte kontaktsystem og fandt, at produktionen af inflammatoriske cytokiner IL-6, MCP-1 og TNF-α var korreleret med antallet af makrofager i kulturen (figurerne 3(a)-3(c)) og steg med tiden (figurerne 3(d)-3(f)).

3.4. Virkning af afbrydelse af interaktionen mellem 4-1BB og 4-1BBL på frigivelse af inflammatoriske cytokiner i et kontaktkokultursystem

For at teste, om den 4-1BB/4-1BBL-medierede interaktion mellem adipocytter og makrofager deltager i det inflammatoriske respons i de kontaktkokulturerede 3T3-L1 adipocytter/Raw264.7 makrofager, blokerede vi interaktionen ved hjælp af et neutraliserende antistof (TKS-1). Det neutraliserende monoklonale antistof reagerer specifikt med mus 4-1BBL, hvorved 4-1BBL ikke kan binde til 4-1BB-receptoren og kan afbryde interaktionen mellem 4-1BBL og 4-1BB. Derfor kan både det 4-1BB-medierede signal i adipocytter og det 4-1BBL-medierede signal i makrofager afstumpes ved TKS-1-behandling. Vi fandt, at behandling med TKS-1 signifikant reducerede niveauerne af IL-6, MCP-1 og TNF-α mRNA i kontaktkokulturerede adipocytter/makrofager (Figur 4(a)). Reduktionen i ekspressionen af disse inflammatoriske cytokiner blev bekræftet på proteinniveau (Figur 4(b)). Desuden fandt vi også, at afbrydelse af interaktionen mellem 4-1BB og 4-1BBL reducerede frigivelsen af inflammatoriske cytokiner fra peritoneale makrofager, der var kokultureret med adipocytter (Figur 4(c)). For at undersøge de relative bidrag fra 4-1BB- og 4-1BB-signalering til inflammatorisk genekspression i de kokulturerede adipocytter/makrofager adskilte vi makrofagerne fra adipocytterne og målte niveauerne af inflammatoriske cytokin-transskriptioner i de to celletyper (Figur 4(d)). Det neutraliserende antistof reducerede signifikant stigningen i niveauerne af IL-6, MCP-1 og TNF-α mRNA’er i adipocytterne såvel som i makrofagerne (figur 4(e) og 4(f)).

4. Diskussion

Fedmeinduceret fedtvævsinflammation er karakteriseret ved rekruttering af makrofager i fedtvævet, og makrofagerne er en vigtig kilde til inflammatoriske reaktioner. Celle-cellekontakt mellem adipocytter og makrofager anses for at være vigtig for udløsning af inflammatoriske veje i fedtvæv , selv om det er uklart, hvilke molekyler der er involveret. Nylige undersøgelser har vist, at inddragelse af den co-stimulerende receptor 4-1BB og dens ligand 4-1BBL gennem celle-cellekontakt modulerer forskellige inflammatoriske reaktioner . I tidligere arbejde fandt vi, at 4-1BB-mangel reducerede fedtinflammation ved at nedsætte rekruttering af makrofager og frigivelse af inflammatoriske cytokiner . Baseret på disse fund antog vi, at 4-1BB/4-1BBL-medieret celle-celle-interaktion mellem fedtceller og makrofager kan være vigtig i starten og/eller opretholdelsen af fedmeinduceret fedtinflammation. Interessant nok blev 4-1BB-transskriptioner i adipocytter og 4-1BBL-transskriptioner i makrofager markant opreguleret af fedmerelaterede faktorer (f.eks. FFA og LPS), og deres ekspression var også stærkt forøget i kontaktkokulturerede adipocytter/makrofager. Desuden blev opreguleringen af disse molekyler ledsaget af en øget frigivelse af inflammatoriske cytokiner fra cellerne. Disse resultater sammen med opreguleringen i fedtvæv med fedme og reduktionen af fedtinflammation hos 4-1BB-deficiente fede mus tyder på, at 4-1BB og 4-1BBL deltager i indledningen og/eller fremme af adipocytter/makrofager-inducerede inflammatoriske reaktioner.

For at se, om 4-1BB på adipocytter eller 4-1BBL på makrofager var ansvarlig for de inflammatoriske signaler, der udløste inflammatoriske reaktioner, stimulerede vi cellerne med agonister, som binder specifikt til enten 4-1BB eller 4-1BBL. Vi fandt for første gang, at stimulering af 4-1BB på adipocytter markant øgede frigivelsen af inflammatoriske cytokiner MCP-1, TNF-α og IL-6. Stimulering af 4-1BBL-medieret omvendt signalering, som er kendt for at aktivere makrofager , øgede også niveauerne af inflammatoriske cytokiner. Nylige beviser tyder på, at 4-1BB-signalering resulterer i aktivering af MAPK/NF-κB-vejen, som er TNF-receptor-associeret faktor (TRAF)-2-afhængig i lymfocytter . I adipocytter fandt vi, at stimulering af 4-1BB aktiverede p38 MAPK, JNK, IKK og inducerede IκBα-proteinnedbrydning. På den anden side førte stimulering af 4-1BBL til aktivering af inflammatoriske signalmolekyler såsom Akt og p38 MAPK i makrofager, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser . Endnu vigtigere fandt vi, at behandling med et 4-1BBL-neutraliserende antistof reducerede frigivelsen af inflammatoriske cytokiner i kokulturer på både mRNA- og proteinniveau. Disse resultater tyder sammenlagt på, at den 4-1BB/4-1BBL-medierede interaktion mellem adipocytter og makrofager udløser bidirektionel inflammatorisk signalering og er en potent inducerer af inflammatoriske reaktioner i fedmefedtvæv (Figur 5).

Figur 5

Skematisk fremstilling af den bidirektionelle signaltransduktion, der induceres af 4-1BB/4-1BBL-medieret interaktion mellem adipocytter og makrofager. Frigivelsen af inflammatoriske cytokiner (MCP-1, TNF-α og IL-6) som reaktion på den bidirektionelle signalering synes at deltage i fedtinflammation.

Interessant nok undertrykte afbrydelse af 4-1BB/4-1BBL-interaktionen ikke fuldstændigt frigivelsen af inflammatoriske cytokiner fra kokulturerede adipocytter og makrofager. Dette kan skyldes tilstedeværelsen af andre celleoverflademolekyler, som deltager i celle-celle-interaktioner og medierer inflammatoriske reaktioner. Adipocytter og makrofager udtrykker nemlig mange inflammatoriske receptorer og ligander på deres overflader . F.eks. anses CD40 og herpes virus entry mediator (HVEM), som udtrykkes på adipocytter, for at være mediatorer for kontaktafhængig signalering af makrofager, og ablation af disse receptorer reducerer de fedmeinducerede inflammatoriske reaktioner . Det er således tænkeligt, at andre receptorer og ligander ud over 4-1BB og 4-1BBL også er involveret i interaktionen mellem adipocytter og makrofager, der fører til initiering og vedligeholdelse af inflammatoriske reaktioner.

Sammenfattende har vi for første gang påvist, at den kontaktafhængige interaktion mellem adipocytter og makrofager formidlet af 4-1BB og 4-1BBL, som genererer bidirektionelle signaler, spiller en afgørende rolle for frigivelsen af inflammatoriske cytokiner fra disse celler. 4-1BB og 4-1BBL kan sammen med andre molekyler, der er involveret i celle-celle-interaktion mellem adipocytter og makrofager, være værdifulde mål for forebyggelse af fedmeinduceret fedmeinflammation.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Anerkendelser

Dette arbejde blev støttet af Midcareer forskningsprogrammet gennem National Research Foundation (NRF) Grant KOSEF (2009-0079485), finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (MEST), og Science Research Center program (Center for Food & Nutritional Genomics) Grant (2012-0000643) af NRF of Korea, finansieret af MEST.