5-hydroxymethylcytosin og dets potentielle rolle i udvikling og kræft

Dobbelt rolle for 5-hydroxymethylcytosin som en stabil DNA-base og som et mellemprodukt i DNA-demethylering

Vi ved nu, at 5hmC-niveauerne varierer betydeligt mellem forskellige celletyper og væv og er højest i hjernen, især i neuroner. Da 5hmC er et oxidationsprodukt af 5mC, er det klart, at dannelsen af 5hmC fra 5mC automatisk sænker 5mC-niveauet ved enhver given nukleotidposition eller endog i hele genomet. Det var derfor umiddelbart indlysende, at omdannelsen af 5mC til 5hmC kunne være det første skridt i en vej, der fører til DNA-demethylering. Der er beviser fra forskellige eksperimentelle systemer for, at dette faktisk kan være tilfældet . Slutresultatet af denne demethyleringsvej er passiv eller aktiv fjernelse af den modificerede base og/eller forsvinden af methylgruppen fra cytosin i DNA (figur 1). I den passive demethyleringsvej kan 5hmC ikke kopieres af vedligeholdelses-DNA-methyltransferasen DNMT1, et enzym, der viderefører allerede eksisterende methyleringsmønstre og opererer på hemimeterede CpG-steder . Den aktive demethyleringsproces, der anvender 5hmC som et mellemprodukt, er betydeligt mere kompliceret. I en rapport blev det antydet, at 5hmC kan omdannes til cytosin af DNA-methyltransferaser . Deaminering af 5hmC producerer 5-hydroxymethyluracil , som kan fjernes af baseekskisionsreparationsenzymer, herunder thymin-DNA-glycosylase (TDG) og enkeltstrengsselektiv monofunktionel uracil-DNA-glycosylase (SMUG1) . Det er dog i øjeblikket uvist, hvor effektivt en sådan vej fungerer in vivo. Trinvis oxidation af 5hmC af TET-proteiner producerer 5-formylcytosin (5fC) og derefter 5-carboxylcytosin (5caC) . Dette 5caC, som kan påvises i lave niveauer i DNA, kan derefter fjernes enten ved baseekskisionsreparation, der katalyseres af DNA-glykosylaseaktiviteten i proteinet TDG , eller ved decarboxylering. Teoretisk set burde decarboxyleringsvejen være gunstig, da den ikke kræver brud på DNA-fosfodiesterbindingerne, hvilket sker under TDG-initieret baseekskisionsreparation. Indtil nu er der imidlertid ikke blevet identificeret nogen enzymatisk aktivitet for decarboxyleringstrinnet, selv om decarboxylering synes at forekomme .

Mange væv akkumulerer ganske betydelige niveauer af 5hmC, langt større end man ville forvente, hvis denne base blot var et forbigående mellemprodukt i en sekventiel oxidationsvej, der fører til DNA-demethylering. Derfor kan 5hmC være et epigenetisk modul, der har sine egne unikke biokemiske kodningsegenskaber. Denne funktion kan være negativ eller frastødende, da oxidation af methylgruppen under produktionen af 5hmC vil blokere bindingen af proteiner, som ellers ville interagere med 5mC . Alternativt kan dens funktion være positiv eller instruktiv, hvis der findes proteiner, som specifikt binder til 5hmC. Indtil videre har flere forskellige proteiner vist evne til at genkende 5hmC, i det mindste in vitro, herunder UHRF1 , MBD3 , MeCP2 , og flere andre identificeret ved en proteomisk tilgang . Den biologiske rolle, som deres binding til 5hmC spiller, er dog stadig ikke helt klarlagt. De fleste af disse proteiner har også andre funktioner og er derfor måske ikke entydigt designet til at interagere med 5hmC.

Rollen af 5-hydroxymethylcytosin i pattedyrs udvikling og differentiering

Den funktionelle rolle af 5hmC i pattedyrs genomer er stadig uklar. I begyndelsen af pattedyrs livscyklus, ved befrugtning af oocytter med sædceller, bliver størstedelen af 5mC i det faderlige (sædceller afledte) genom oxideret til at danne 5hmC . Dette oxidationstrin, som tidligere blev anset for at afspejle ægte DNA-“demethylering” , er specifikt for det faderlige genom, mens det moderlige (oocyt-afledte) genom fortsat er beskyttet mod Tet-katalyseret oxidation . Oxidation af det faderlige genom katalyseres af Tet3, som er kodet af det eneste Tet-gen, der udtrykkes i betydelige mængder i oocytter og zygoter . Genetisk knockout af Tet3 hos mus resulterer i mislykket faderlig genomoxidation, kompromitteret udvikling og perinatal dødelighed .

En anden vigtig udviklingsmæssig overgang involverer global DNA-demethylering i primordiale kønsceller (PGC’er), der begynder omkring embryonaldag 8,5 til 9,5 og afsluttes nær embryonaldag 13,5. Mekanismerne for methyleringsudslettelse i PGC’er har været stort set uklare og kontroversielle. Det har længe været antaget, at replikationsuafhængig aktiv DNA-demethylering er en nøglevej, der sandsynligvis er involveret i dette trin . Nyere data er imidlertid til fordel for et passivt tab af methylering forårsaget af manglende vedligeholdelse af methylering under DNA-replikation . Dette passive tab af 5mC kan effektivt indledes ved omdannelse af 5mC til 5hmC . Tet1 og Tet2 er de 5mC-oxidaser, der er mest udtrykt i PGC’er på dette stadium . Efterkommere af mus med mangel på Tet1 og Tet2 har mangler i DNA-demethylering ved præget gene . Tet1/2-deficiente dyr af begge køn var imidlertid fertile, idet hunnerne havde mindre æggestokke og nedsat frugtbarhed. Deletion af Tet1 og Tet2 kan producere levedygtige voksne mus, selv om størstedelen af disse mus dør under embryogenese eller omkring fødslen og udviser forskellige udviklingsdefekter . Dataene tyder på, at Tet1/2-induceret 5mC-oxidation i PGC’er ikke er absolut nødvendig for at producere levedygtigt afkom. De i øjeblikket tilgængelige oplysninger om DNA-demethylering i zygoter og PGC’er mangler stadig en mere specifik analyse af 5hmC på DNA-sekvensniveau, som f.eks. kan opnås ved TAB-sekventering . Det forventes, at sådanne oplysninger vil kunne klarlægge den globale eller lokusspecifikke inddragelse af 5hmC-dannelsen i initieringen af passiv (eller aktiv) DNA-demethylering. Den tidligere inddragelse af base excision repair-processer i kimliniernes reprogrammering , som i sig selv ville udgøre en enorm risiko for opretholdelsen af genomets integritet, hvis den var operativ på globalt niveau, kan have forskellige andre forklaringer. I et scenarie kan forekomsten af baseekskisionsreparationsaktivitet forklares ved kravet om at modvirke falske, ikke-målrettede oxidationsreaktioner, der katalyseres af Tet-oxidaseaktivitet på guaniner på methylerede CpG-steder (guanin er den DNA-base, der er mest modtagelig for oxidation). I en anden sammenhæng kan 5hmC oxideres yderligere, måske ved specifikke sekvenser, af Tet-proteiner for at danne 5caC, som derefter fjernes ved baseekskisionsreparation, der initieres af TDG .

Da 5hmC er mest udbredt i hjernevæv, er det blevet en prioritet at forstå funktionen af denne modificerede base i hjernen. For eksempel er niveauet af 5hmC i DNA fra menneskelig hjernebark ca. 1% af alle cytosiner eller 20 til 25% af alle 5mC-baser . Dette svarer til ca. 6 000 000 5hmC-baser pr. haploid genom. Disse niveauer tyder helt klart på, at 5hmC har en vigtig funktionel rolle i pattedyrhjernen. De undersøgelser, der hidtil er blevet rapporteret, har vist, at 5hmC i hjernevæv er meget udbredt inden for genområder, enten ved promotorer eller i endnu højere grad inden for intrageniske regioner, de såkaldte genlegemer . Det er tænkeligt, at dannelsen af 5hmC ved promotorer, CpG-øer eller CpG-øer fungerer på samme måde som en reparationsproces, der oxiderer og i sidste ende fjerner uhensigtsmæssigt indførte 5mC’er i disse regioner . Aflejring af 5hmC i promotorer eller genlegemer korrelerer ofte positivt med genaktivitet. Mekanismen for, hvordan 5hmC-associeret 5hmC i genlegemer øger transkriptniveauerne, er i øjeblikket ukendt. En mulighed er, at 5mC-oxidation frigør en repressiv virkning på transkriptionen, måske ved at modvirke falsk intragenisk anti-sense-transskription. Andre forklaringer kan omfatte det faktum, at 5hmC har en destabiliserende virkning på DNA-strukturen, der potentielt favoriserer transkriptionsapparatets åbning af dobbeltspiralen.

5hmC, selv om det ikke genkendes af flere methyl-CpG-bindende proteiner, herunder MBD1, MBD2 og MBD4 , er i stand til at binde MeCP2 , et methyl-CpG-bindende protein, der er rigeligt forekommende i hjernen og er muteret i den neurologiske lidelse Rett-syndromet. Tidligere undersøgelser, hvor man anvendte det methyl-CpG-bindende domæne (MBD) af MeCP2 i stedet for det fulde protein i fuld længde, konkluderede ikke, at MeCP2 binder til 5hmC . Årsagerne til disse uoverensstemmelser er uklare. Forbindelsen mellem MeCP2 og 5hmC i hjernen er af særlig interesse, da niveauerne af 5hmC er højest i hjernen, og MeCP2 er et rigeligt forekommende protein i hjernen, der når op på niveauer svarende til niveauerne for histon H1. Af disse grunde kan man forvente en genomdækkende snarere end sekvensspecifik mekanistisk rolle for 5hmC-binding af MeCP2 i hjernen.

Som vist for nylig er dannelsen af 5hmC kritisk for hjernens udvikling. Basen er rigelig i udviklende neuroner, hvor dens niveau stiger i forhold til neurale progenitorceller, og hvor den specifikt lokaliseres til genlegemer af gener, der er vigtige for neuronal differentiering . Tet3 er højest udtrykt i hjernebarken af mus i udvikling efterfulgt af Tet2, og Tet1-niveauet er meget lavt i dette væv. En stigning i niveauerne af Tet2, Tet3 og 5hmC i differentierende neuroner falder sammen med en reduktion af Polycomb H3K27 methyltransferasen Ezh2 og tab af H3K27me3 ved kritiske gener. Reduktion af Tet2- og Tet3-niveauerne eller øget Ezh2-ekspression resulterer i ufuldstændig eller blokeret neuronal differentiering . Således fremmer dannelsen af 5hmC neuronal differentiering ved at modulere ekspressionen af de mest kritiske gener i denne vigtige udviklingsmæssige overgang.

Tab af 5-hydroxymethylcytosin i kræft

Niveauerne af 5hmC i kræft er stærkt reduceret i forhold til det tilsvarende normale væv omkring tumoren . Ved hjælp af væskekromatografi-massespektrometri, anti-5hmC antistof-baserede immuno-dot blots og immunohistokemi påviste vi tumor-associeret tab af 5hmC for kræft i lunge, hjerne, bryst, lever, nyre, prostata, tarm, uterus og melanom . Andre forskere bekræftede denne observation ved at påvise tab af 5hmC i forskellige typer af solide tumorer . Desuden har genindførelse af TET2 vist sig at genoprette 5hmC-niveauet og mindske metastatisk potentiale hos melanomceller . Det er påfaldende, at vi, da vi samtidig immunfarvede vævsafsnit med antistoffer mod 5hmC og mod Ki67-antigenet, som er en markør, der kun findes i prolifererende celler, observerede, at 5hmC og Ki67 næsten aldrig er til stede samtidig i en enkelt celle . På et klinisk diagnostisk niveau kunne en kombineret immunhistokemisk analyse af tab af 5hmC og tilstedeværelsen af Ki67-positive celler udvikles til en biomarkør til kræftdiagnostik. Manglen på eller den kraftige reduktion af 5hmC i tumorer tyder på, at prolifererende celler mister 5hmC. I de fleste tilfælde er hovedparten af tumormassen udtømt for 5hmC, selv når Ki67-positive celler er sjældne, hvilket tyder på, at disse tumorceller har haft en fortid med proliferation, der har ført til tab af 5hmC, som derefter ikke er blevet genetableret . Det replikationsafhængige tab af 5hmC afspejler en situation, der minder om situationen i præimplantationsembryoner, hvor den indledende dannelse af 5hmC i det faderlige DNA efterfølges af replikationsafhængigt tab eller fortynding af dette mærke . På samme måde falder det globale 5hmC-indhold hurtigt, når celler fra normalt væv tilpasser sig til cellekultur . Den enkleste forklaring er, at oxidation af 5mC producerer et hemi-hydroxymethyleret CpG-sted i DNA, som ikke genkendes af DNMT1 under DNA-replikation. En sådan forklaring er i overensstemmelse med in vitro-undersøgelser, der viser, at DNMT1 ikke er i stand til at operere på CpG-steder, der indeholder 5hmC . Andre forklaringer på reduktionen af 5hmC i kræft er imidlertid også mulige. Niveauerne af TET-proteiner kan være lavere i tumorvæv end i det tilsvarende normale vævs modstykke. Selv om vi ikke observerede konsekvente forskelle på RNA-niveau for TET1, TET2 eller TET3 i lunge- og hjernetumorer i forhold til normalt væv , har andre rapporteret om lavere niveauer af TET-genekspression i kræft . En yderligere mulighed er, at kræftceller indeholder kompromitterede metaboliske veje, der er involveret i produktionen af co-faktoren for TET-aktivitet, 2-oxoglutarat (se nedenfor).

Mutation af TET2 i human cancer

TET1 tilhører en familie af proteiner, der er karakteriseret ved at fremme omdannelsen af 5mC til 5hmC i pattedyrs-DNA . Der er tre identificerede familiemedlemmer, der hører til TET-familien: TET1, TET2 og TET3. TET1 er placeret på det menneskelige kromosom 10q21.3, mens TET2 er placeret på kromosom 4q24 og TET3 på kromosom 2p13.1. TET1-enzymet består af et zinkfinger CXXC DNA-bindingsdomæne, et cysteinrigt område og et 2-oxoglutarat- og jern(II)-afhængigt dioxygenase (2OGFeDO)-domæne . TET3 indeholder også et N-terminalt CXXC-domæne . TET2-genet har imidlertid undergået en kromosomal geninversion i løbet af evolutionen, hvorved dets CXXC-domæne blev adskilt fra det katalytiske domæne og der blev skabt et nyt CXXC-domænegen ved navn IDAX/CXXC4, som koder for en negativ regulator af TET2 . Baseret på EST-profiler og ekspressionsarrays viser TET1 den største ekspression under embryogenese og viser ikke relevant ekspression i voksent væv. TET2 udtrykkes mest i hæmatopoietiske celler, og TET3 synes at være ubiquitært udtrykt i voksne menneskelige væv.

Leukæmi er en sygdom, hvor den klonale ekspansion af hæmatopoietiske forløberceller i knoglemarven under normal hæmatopoietisk stamcelledifferentiering påvirkes på et bestemt differentieringsstadium, hvilket forårsager en ubalance mellem differentiering og selvfornyelse. Uhensigtsmæssig ekspansion af hæmatopoietiske forstadieceller skyldes primært en blokering af cellemodningen. Myelodysplastisk syndrom (MDS) forstyrrelser i hæmatopoiese er karakteriseret ved cytopeni (lavt blodcelletal), ineffektiv hæmatopoiese i en eller anden cellelinie og en øget risiko for transformation til akut myeloid leukæmi (AML) . Ved AML fører en hurtig vækst af unormale hvide blodlegemer i knoglemarven til en blokering af produktionen af forskellige celler fra andre cellelinjer.

TET2 er fundet muteret hos patienter med myeloproliferative neoplasmer (MPN), MDS, AML og kronisk myelomonocytær leukæmi (CMML), og er det mest almindeligt muterede gen i MDS . Mutationer af TET1 eller TET3 observeres ikke i MDS, og TET2-mutationen korrelerer heller ikke med flere andre kendte almindelige mutationer . Interessant nok findes isocitratdehydrogenase 1/2 (IDH1/2)-mutationer sjældent sammen med TET2-mutationer, men de har lignende virkninger som TET2-mutationer på hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) . Mens TET2-mutationer er forbundet med reduceret samlet overlevelse i AML sammenlignet med patienter med wild-type TET2, fremmer TET2-mutationer hos MDS- og MPN-patienter progression til AML . TET2-genet består af i alt elleve exoner, der oversættes til et proteinprodukt på 2002 aminosyrer . TET2-mutationer i myeloide kræftformer er oftest blevet observeret inden for exon 3a og 10, som er de længste exoner . Både multipotente og engagerede progenitorceller i den hæmatopoietiske linje er mål for TET2-mutationer i MPN, hvilket antyder, at TET2 spiller en vigtig rolle i myelopoiesen . Deletioner af TET2 og tab af heterozygotitet eller uni-parental disomi blev observeret hos (9 %) MDS/AML-patienter med muteret TET2, hvor det er sandsynligt, at wild-type allelen går tabt under rekombination, hvilket gør det muligt for muteret TET2 at fremme en funktionstabsfænotype. Kosmider et al. observerede, at 50 % af patienterne med muteret TET2 havde genetiske defekter, der var rettet mod de to TET2-kopier. Mutationer i TET2 synes at føre til tab af funktion, hvilket tyder på, at det kan spille en tumorundertrykkende rolle.

Forståelse af de underliggende implikationer af mutant TET2 manglende funktion og dets rolle i myeloide maligniteter er en nuværende forskningsprioritet. Flere laboratorier genererede betingede Tet2 knockout musemodeller, hvor kritiske Tet2 exoner blev rettet mod kritiske Tet2 exoner. Moran-Crusio et al. observerede, at Tet 2-/- mus udviklede splenomegali i 20 ugers alderen og viste fænotyper, der lignede dem, der blev observeret hos menneskelige CMML-patienter med mutant TET2. Dataene fra de forskellige musemodeller førte til lignende observationer. Sletning af Tet2 er ikke embryonalt dødelig. En vigtig observation foretaget af Moran-Crusio et al. og af Ko et al. er, at hæmatopoietiske stamceller fra Tet2-/- mus har en øget evne til at repopulere det hæmatopoietiske kompartment in vivo under konkurrerende rekonstitutionsassays med konkurrence fra HSC’er fra Tet2+/+ celler. Analyse af forskellige organer fra Tet2-/- mus viste, at tab af Tet2 ikke kompenseres af en stigning i Tet1- eller Tet3-ekspression . 5hmC-niveauet er signifikant nedsat i knoglemarv og milt hos Tet2-/–mus . Tet2-/- mus viser en stigning i HSC’er med en lille stigning i myeloide progenitors, hvilket skævvrider hæmatopoiesen i retning af monocyt/makrofagcellefæden . Det foreslås, at en aktiv Tet2 ville regulere normal hæmatopoiese for at sikre korrekt lineagefordeling og kontrolleret differentiering af HSC’er. Af særlig interesse er virkningen af TET2-mutationer på niveauerne og mønstrene af 5mC i genomet. De nuværende data er imidlertid langt fra entydige. Mens en rapport viste, at TET2-mutationer i AML er forbundet med en DNA-hypermethyleringsfænotype , tyder andre data på, at knoglemarvsprøver fra patienter med TET2-mutationer har lave 5hmC-niveauer og DNA-hypomethylering . Situationen kompliceres af det faktum, at hæmatopoietiske maligniteter ofte er karakteriseret ved mutationer i flere epigenetiske modifikatorer, herunder EZH2, IDH1, IDH2, MLL, DNMT3A og ASXL1, hvilket potentielt kan sløre enhver direkte sammenhæng . For eksempel havde otte ud af elleve patienter med DNMT3A-mutationer (73%) i T-celle lymfom i en undersøgelse også TET2-mutationer .

Mutationer i co-faktorveje

5mC-oxidaser er 2-oxoglutarat-afhængige enzymer (Figur 2). Denne cofaktor produceres i tricarboxylsyrecyklussen fra isocitrat af enzymet IDH. Det er interessant, at flere typer af menneskelige tumorer indeholder mutationer i IDH1-genet. IDH1-mutationer er særligt hyppige i gliomer af grad II og III, hvor de findes hos op til 70 % af patienterne . Mutationer i IDH1 og IDH2 ses også i myeloid leukæmi og nogle få andre maligniteter, men med en lavere frekvens . Disse IDH1-mutationer er ikke spredt ud over hele genet, men findes næsten udelukkende ved aminosyreposition 132. Dette resultat tyder på, at dette særlige IDH1-mutantprotein har en funktionsforbedrende egenskab. En overraskende opdagelse var, at IDH1 codon 132 arginin til histidin-mutanten producerer oncometabolitten 2-hydroxyglutarat (2HG) som et reaktionsprodukt i stedet for 2-oxoglutarat . Det ser ud til, at den isocitratoxidationsreaktion, der udføres af denne mutant, er ufuldstændig og kun producerer 2HG. Desuden er 2HG en kompetitiv hæmmer af mange, hvis ikke alle 2-oxoglutarat-afhængige enzymatiske aktiviteter. TET-proteinerne udgør en klasse af sådanne enzymer, og det blev vist, at 2HG er en inhibitor af TET1 og TET2 .

En interessant korrelation af at have muteret IDH1 i gliomtumorer er, at IDH1-mutante tumorer næsten altid er forbundet med rigelige genom-dækkende ændringer i DNA-methylering som indikeret af udbredt hypermethylering af CpG-øer . Denne fænotype er blevet omtalt som CpG-island methylator-fænotype (eller CIMP) . Det er fristende at formode, at CIMP i IDH1-mutante gliomer er forbundet med en manglende 5hmC-produktion i disse tumorer, fordi TET-aktiviteten er kompromitteret af 2HG. Faktisk førte eksperimentel introduktion af et IDH1-mutantkonstrukt i humane astrocytter til fremkomsten af en CIMP-lignende fænotype . Endvidere blev der i betingede knock-in-mus, hvor den mest almindelige Idh1-mutant R132H blev indsat i det endogene Idh1-lokus og udtrykt i hæmatopoietiske celler, observeret DNA-hypermethylering . I en direkte sammenligning af 5hmC-niveauer i DNA mellem IDH1-mutant- og IDH1-wildtype-gliomer observerede vi imidlertid ingen væsentlige forskelle mellem disse to kategorier af hjernetumorer . Derfor skal man huske på, at mutant IDH1 og dets metabolitprodukt 2HG ikke kun påvirker TET-enzymerne, men også hæmmer mange lysin-demethylaser, der er afhængige af 2-oxoglutarat og andre 2-oxoglutarat-afhængige enzymer. Dysfunktion af disse lysin-demethylaser kan have en sekundær indvirkning på DNA-methyleringsmønstre på CpG-øer.