Resultater
ABT-263 er en oralt biotilgængelig inhibitor af Bcl-2-familien. De strukturelle træk i ABT-737, der giver uønskede lægemiddelegenskaber, skyldes designelementer, der er afgørende for hæmning af et stort overfladeareal, hydrofob protein-protein-interaktion og reduktion af serumalbuminbinding (4-6). For at forbedre den orale virkning af dette relativt store (MW >800) molekyle var det nødvendigt med en omhyggelig balance mellem målaffinitet, cellulær potens og oral absorption. Der blev identificeret tre nøgleområder langs ABT-737’s rygsøjle, som påvirker ladningsbalancen, metabolismen og den orale absorption (fig. 1). Analoger, der inkorporerer modifikationer på disse positioner, blev optimeret for at maksimere det farmakokinetiske/farmakodynamiske forhold mellem oral eksponering i dyr og effektivitet i humane tumorcellelinjer. Disse bestræbelser resulterede i identifikation af ABT-263.
Kemiske strukturer af ABT-737 (venstre) og ABT-263 (højre).
ABT-263 opretholder en høj affinitet for Bcl-xL, Bcl-2 og Bcl-w, som er under detektionsgrænsen for fluorescenspolarisationsassayet (Ki ≤1 nmol/L), men binder svagere til Mcl-1 og A1 (tabel 1). Dette selektivitetsmønster svarer til det samme som for dets forgænger ABT-737 og BH3-only-proteinet Bad (12). ABT-263’s subnanomolære affinitet for Bcl-xL blev bekræftet af et mere følsomt tidsopløst fluorescensresonans-energitransferassay, der viser, at enantiomeren (en stereoisomer med den modsatte konfiguration af morpholinoethylgruppen, der anvendes som en mindre aktiv kontrol) er ∼40 gange mindre potent.
- Vis inline
- Vis popup
Bindingsaffiniteter til proteiner fra Bcl-2-familien
Den farmakokinetiske profil af ABT-263 er karakteriseret ved lave plasmaclearanceværdier og lave fordelingsvolumener i mus, rotte, hund og abe med plasmaelimineringshalveringstider efter i.v. dosis på 4,6 til 8,4 timer (Supplerende tabel S1). Biotilgængeligheden efter oral gavage var ∼20 % hos alle fire arter. På grund af den lave vandige opløselighed viser ABT-263 en langvarig opløsningshastighedsbegrænset oral absorption. P.o. administration i lipidbaserede formuleringer, hvori stoffet er betydeligt mere opløseligt, giver en forbedret absorption med en biotilgængelighed tæt på 50 % og en oral eliminationshalveringstid på 8,9 timer hos hunde. En repræsentativ plasmakoncentrationskurve for lægemiddelkoncentrationen efter i.v. eller p.o. dosering hos hund er vist i supplerende fig. S1.
ABT-263 udviser mekanismebaseret cytotoksicitet. En række BH3-mimetiske små molekyler er blevet rapporteret til at binde Bcl-2-familiemedlemmer med beskeden affinitet og inducere apoptose i tumorcellelinjer (21-23). Det blev imidlertid for nylig vist, at mange af disse stoffer dræber celler på en Bax/Bak-uafhængig måde, hvilket sætter spørgsmålstegn ved den funktionelle relevans af deres svage affinitet for Bcl-2-proteiner og de virkningsmekanismer, som disse molekyler reelt har (14). Derfor fandt vi det vigtigt at påvise, at den apoptose, der blev induceret af ABT-263, var et direkte resultat af hæmning af proteiner fra Bcl-2-familien. Først blev ABT-263’s cellulære aktivitet evalueret i den interleukin-3 (IL-3)-afhængige prolymphocytiske FL5.12-murincellelinje. Tilbagetrækning af IL-3 inducerer FL5.12 apoptose, til dels ved opregulering af de proapoptotiske faktorer Bim og Puma (24, 25). Overekspression af Bcl-2 (FL5.12-Bcl-2) eller Bcl-xL (FL5.12-Bcl-xL) beskytter mod virkningerne af IL-3-tablukning ved at sekventere Bim og Puma (25). ABT-263, men ikke enantiomeren, vendte den beskyttelse, der blev ydet af overekspression af Bcl-2 eller Bcl-xL (EC50 = 60 og 20 nmol/L, henholdsvis; Fig. 2A). ABT-263 var ineffektiv til at fremkalde celledød i tilstedeværelse af IL-3, hvor FL5.12-celler ikke var udsat for proapoptotiske stimuli. ABT-263’s evne til at dræbe FL5.12-Bcl-2 eller FL5.12-Bcl-xL celler under IL-3 tilbagetrækning blev signifikant svækket i tilstedeværelse af caspaseinhibitoren ZVAD, hvilket indikerer, at celledrab er caspaseafhængigt (Supplerende fig. S2).
Hæmning af de antiapoptotiske Bcl-2-familieproteiner med ABT-263 inducerer mitokondriafhængig apoptose. A, genoprettelse af IL-3-afhængighed i FL5.12-celler, der overudtrykker Bcl-xL eller Bcl-2. Celler ± IL-3 blev behandlet med 0 til 1.000 nmol/L af ABT-263 eller enantiomer-kontrollen, og levedygtigheden blev vurderet med CellTiter Glo. Punkter, gennemsnit (n = 3); søjler, SD. B, forstyrrelse af Bcl-xL/Bcl-xS-interaktioner vurderet ved hjælp af pattedyrs to-hybrid-systemet i HeLa-celler. Cellerne blev behandlet med 0 til 500 nmol/L ABT-263 (lukkede søjler) eller enantiomeren (åbne søjler), og afbrydelsen blev vurderet med BrightGlo. Søjler, gennemsnit (n = 3); søjler, SD. C, aktivering af Bax og frigivelse af cytokrom c (Cyto c) ved hæmning af Bcl-2 og Bcl-xL i H146-celler. i, immunoblots af Bax og cytokrom c i cytosoliske fraktioner isoleret 2 timer efter behandling med forskellige koncentrationer af ABT-263 eller enantiomeren. ii, immunohistokemi af celler med anti-aktiveret Bax (rød) og anti-cytokrom c (grøn) antistoffer. D, tidsafhængig og dosisafhængig aktivering af caspase-3 induceret af 195 nmol/L ABT-263 (lukkede søjler) eller 195 nmol/L enantiomer (åbne søjler) i H146-celler. Søjler, gennemsnit (n = 3); søjler, SD. R.U., relative enheder.
For at bestemme, om ABT-263-induceret cytotoksicitet kan tilskrives forstyrrelsen af intracellulære protein-protein-interaktioner i Bcl-2-familien, blev der udført coimmunopræcipitationsundersøgelser. ABT-263 inducerede et dosisafhængigt fald i Bim:Bcl-xL-interaktioner inden for 2 timer efter behandlingen i FL5.12-Bcl-xL-celler (Supplerende fig. S3). Lignende mønstre blev også observeret for afbrydelsen af Bim:Bcl-2-komplekser i FL5.12-Bcl-2-celler (data ikke vist), hvilket indikerer, at ABT-263 genopretter IL-3-afhængig celledød ved at svække Bcl-xL’s og Bcl-2’s evne til at seponere proapoptotiske faktorer såsom Bim. ABT-263’s evne til at forstyrre Bcl-2-familiens protein-protein-interaktioner blev bekræftet i et pattedyrs to-hybrid-system (Fig. 2B). ABT-263 inhiberede interaktionen mellem VP16-Bcl-xS og Gal4-Bcl-xL (tilsyneladende EC50 ∼50 nmol/L), mens enantiomeren var meget mindre effektiv.
For yderligere at udspørge virkningsmekanismen blev ABT-263’s aktivitet evalueret i en række musebryonale fibroblastceller (MEF), der omfattede wild-type (WT) såvel som celler med mangel på Bcl-x, Mcl-1 og Bax/Bak (DKO). ABT-263 inducerede potent celledød i Mcl-1-/- (EC50 ∼50 nmol/L), men ikke Bcl-x-/- (EC50 ≥10 μmol/L) MEF-celler (Supplerende fig. S4A). Dette bekræfter ABT-263’s evne til funktionelt at hæmme Bcl-xL, men ikke Mcl-1, i en cellulær kontekst og er i overensstemmelse med tidligere observationer med ABT-737 (7, 11, 13, 13, 14, 26). Enantiomeren var ineffektiv i begge systemer. ABT-263 var også ineffektivt (EC50 ≥10 μmol/L) med hensyn til at dræbe enten WT- eller DKO MEF-celler, hvilket stemmer overens med tidligere rapporter (14). I modsætning hertil inducerede etoposid, et generelt cytotoksisk middel, såvel som to rapporterede småmolekylære BH3-mimetika , celledød med lignende EC50’er på tværs af alle fire MEF-celletyper, hvilket tyder på, at disse forbindelser inducerer celledød, i det mindste delvist, ved Bcl-2-familie-uafhængige mekanismer (Supplerende fig. S4C).
For at vurdere ABT-263’s evne til direkte at inducere apoptose i en human tumorcellelinje blev Bax-translokation og frigivelse af cytochrom c overvåget i SCLC-cellelinjen H146. H146 har vist sig at være afhængig af Bcl-2 for at overleve (25). ABT-263 inducerede et dosisafhængigt fald i cytosolisk Bax kombineret med en stigning i cytosolisk cytokrom c inden for 2 timer efter behandlingen (fig. 2C-i). Enantiomeren var ikke i stand til at fremkalde et lignende respons. Bax-aktivering og frigivelse af cytokrom c blev bekræftet ved mikroskopi (fig. 2C-ii). Anti-Bax-antistoffet 6A7, som specifikt genkender den konformationelt aktive form af Bax, blev anvendt til at påvise aktiveret Bax i H146-celler. I overensstemmelse med fraktioneringsundersøgelserne var ABT-263-behandling forbundet med en betydelig stigning i aktiveret Bax. Dette svarede til frigivelse af cytokrom c fra mitokondrierne til cytosolen, hvilket fremgik af mindskede punkterede strukturer og øget cytosolfarvning. ABT-263, men ikke dets enantiomer, inducerede også en tidsafhængig stigning i caspase-3-aktivitet, der kunne påvises ved 2 timer, og som toppede ved ∼6 timer (fig. 2D). Denne virkning var koncentrationsafhængig med en EC50 ∼100 nmol/L på 6 timers tidspunktet (Fig. 2D, indsat). I modsætning hertil var camptothecin, en topoisomerase I-hæmmer, der rapporteres at inducere mitokondriel apoptose og efterfølgende caspaseaktivering (27, 28), kun i stand til at fremkalde en stigning i caspase-3-aktivitet efter 24 timer (data ikke vist). Disse data indikerer, at ABT-263 virker direkte for at hæmme Bcl-2 og Bcl-xL og frigør proapoptotiske faktorer såsom Bim for at inducere en hurtig aktivering af den mitokondrielle apoptosevej.
For at evaluere bredden af ABT-263’s cellulære aktivitet blev et panel af humane tumorcellelinjer, der spænder over en række tumortyper, undersøgt. I overensstemmelse med tidligere rapporter om ABT-737 (12) udviste ABT-263 single-agent-aktivitet i SCLC og hæmatologiske maligniteter, men ikke i størstedelen af andre tumortyper (data ikke vist). For at undersøge aktiviteten inden for disse følsomme tumortyper nærmere blev ABT-263 undersøgt i paneler af cellelinjer, der stammer fra SCLC (n = 22) og hæmatologiske maligniteter (n = 23). I hvert panel udviste ABT-263 en række potenser med 32 % (SCLC) og 48 % (hæmatologiske) af cellelinjerne, der var meget følsomme (EC50 <1 μmol/L; Fig. 3). Enantiomeren var >20 gange mindre aktiv i disse følsomme celler (Supplerende tabel S2).
Cellulær aktivitet af ABT-263 in vitro. EC50-værdier af ABT-263 (lukkede søjler) eller enantiomeren (åbne søjler) mod et panel af SCLC (venstre) eller leukæmi/lymphoma (højre) humane tumorcellelinjer i tilstedeværelse af 10 % humant serum. Søjler, gennemsnit (n ≥ 3); søjler, SD.
Oral dosering af ABT-263 resulterer i regression af SCLC- og ALL xenograft-tumorer in vivo. For at udvide disse observationer in vivo blev ABT-263 evalueret i flankexenograftmodeller, der blev etableret fra nogle af de følsomme SCLC- og hæmatologiske cellelinjer. Når ABT-263 blev doseret p.o. en gang dagligt med 100 mg/kg i 21 på hinanden følgende dage, inducerede ABT-263 hurtige og komplette tumorsvar (CR), der var holdbare i flere uger efter behandlingens afslutning hos alle dyr med H889 (SCLC) eller RS4;11 (ALL)-tumorer (Fig. 4A). Tilsvarende behandling af mus med H146 SCLC-tumorer inducerede hurtige regressioner, hvilket resulterede i CR i 60 % og PR i 40 % af dyrene (Fig. 4A). Gradvis tumorrebound blev observeret begyndende flere uger efter afslutningen af doseringen i denne model. Aktiviteten var dosisafhængig i H146 xenograft-modellen. Behandling med ABT-263 på 50 mg/kg i 21 på hinanden følgende dage inducerede CR hos 22 % og PR hos 44 % af dyrene, mens 25 mg/kg inducerede en statistisk signifikant, men beskeden tumorvæksthæmning uden observerede tumorregressioner. ABT-263 blev godt tolereret (<5% vægttab) ved alle doser.
In vivo aktivitet af ABT-263. Signifikant hæmning af tumorvækst i forhold til vehikelkontrol bestemt med Wilcoxon rank sum test (P < 0,05). Signifikant forbedring i tumorvækstforsinkelse (mediantid til 1-mm3 tumorendepunkt) bestemt med Mantle-Cox log-rank-test; P < 0,001. A, ABT-263 er meget effektiv i xenograftmodeller af SCLC og ALL. Til venstre, H889. Lukkede firkanter, ABT-263 givet p.o. en gang dagligt i 21 d; åbne firkanter, præparat. I midten, H146; dosisrespons af ABT-263. Lukkede cirkler, 100 mg/kg/d; lukkede trekanter, 50 mg/kg/d; lukkede ruder, 25 mg/kg/d; åbne firkanter, middel. Til højre, RS4;11. Lukkede firkanter, ABT-263 givet p.o. en gang dagligt i 21 d; åbne firkanter, præparat. B, ABT-263 i kombination med andre midler. Til venstre, DoHHH2 B-celle lymfom xenograftmodel. Lukkede cirkler, kombinationsmiddel; lukkede trekanter, ABT-263 på 100 mg/kg, p.o., qd ×17; åbne diamanter, rituximab på 10 mg/kg, i.v., qd ×1; lukkede firkanter, ABT-263 + rituximab. I midten, GRANTA-519 mantelcellelymfom xenograftmodel. Lukkede cirkler, kombinationsmiddel; lukkede trekanter, ABT-263 på 100 mg/kg, p.o., qd ×21; åbne ruder, R-CHOP (rituximab på 10 mg/kg, i.v., qd ×1; cyclophosphamid på 25 mg/kg, i.p., qd, qd ×1; doxorubicin på 3 mg/kg, i.v., qd ×1; vincristin på 0,25 mg/kg, i.v., qd ×1; prednison på 0,5 mg/kg, p.o., qd ×1); lukkede firkanter, ABT-263 + R-CHOP. Til højre, OPM-2 multipel myelom xenograftmodel. Lukkede cirkler, kombinationsmiddel; lukkede trekanter, ABT-263 på 100 mg/kg, p.o., qd ×21; åbne ruder, bortezomib på 1 mg/kg, i.v., qd ×3; lukkede firkanter, ABT-263 + bortezomib.
For at korrelere eksponeringen af ABT-263 med antitumoreffektiviteten blev der foretaget en farmakokinetisk undersøgelse ved stationær tilstand, hvor ikke-tumorbærende mus blev doseret p.o. en gang dagligt i 3 dage, og lægemiddelkoncentrationerne i plasma blev bestemt efter den tredje dosis. Både den maksimale plasmakoncentration (Cmax) og arealet under plasmakoncentrationskurven (AUC) var proportionale med dosis og steg nogenlunde lineært (Supplerende tabel S3). En dosis på 100 mg/kg, som gav en samlet responsrate på 100 % (samlet responsrate = CR + PR), gav Cmax- og AUC-værdier på henholdsvis 7,7 μmol/L og 90 μmol/L h. Eksponeringen som følge af en dosis på 50 mg/kg, som fremkaldte en samlet responsrate på 66 %, var 5,4 μmol/L (Cmax) og 54 μmol/L h (AUC). Disse data indikerer, at spidskoncentrationer af ABT-263 i plasmamedicinen på mellem ∼5,4 og 7,7 μmol/L er meget effektive.
ABT-263 forbedrer aktiviteten af kemoterapeutiske midler in vivo. ABT-263’s in vivo-effektivitet blev undersøgt i kombination med almindeligt anvendte terapeutiske midler i flere aggressive modeller af hæmatologiske maligniteter. ABT-263 og rituximab blev undersøgt i DoHHH2 B-celle lymfom flank xenograft-modellen (fig. 4B). Ved daglig dosering på 100 mg/kg p.o. i 17 dage udviste ABT-263 44 % tumorvæksthæmning. En enkelt dosis rituximab på 10 mg/kg fremkaldte 84 % tumorvæksthæmning. Hverken ABT-263 eller rituximab alene opnåede vedvarende tumorregression; kombinationen udviste imidlertid en overlegen effekt, idet der blev opnået 70 % CR og 10 % PR. Denne kombination resulterede også i en signifikant forbedring af tumorvækstforsinkelse (>700%) i forhold til rituximab alene (300%).
Effektiviteten af ABT-263 alene og i kombination med et modificeret R-CHOP-regime blev også evalueret i en GRANTA-519 flank xenograft-model af mantelcellelymfom (Fig. 4B). ABT-263 givet ved 100 mg/kg p.o. i 21 på hinanden følgende dage fremkaldte 40 % tumorvæksthæmning. Til sammenligning hæmmede R-CHOP-behandlingen tumorvæksten med 68 % med 20 % CR. Kombinationen resulterede i dramatiske tumorregressioner og fuldstændige tumorsvar hos alle testede dyr uden tegn på tumorvækst i fire ud af ni evaluerbare tumorer.
Slutteligt undersøgte vi ABT-263’s evne til at forstærke virkningerne af kemoterapi i en model, der er resistent over for ABT-263. I OPM-2 flank xenograft-modellen af multipel myelom (in vitro EC50 = 6,7 μmol/L) hæmmede ABT-263, der blev givet dagligt i 21 dage med 100 mg/kg, ikke tumorvæksten signifikant (fig. 4B). Bortezomib leveret i den maksimalt tolererede dosis (1 mg/kg i.v., qd ×3) hindrede tumorvækst med 70 % uden CR’er. ABT-263 forbedrede virkningen af bortezomib med kombinationen, hvilket resulterede i 95 % tumorvæksthæmning og en CR-rate på 40 %.
ABT-263 inducerer en hurtig men reversibel trombocytopeni. Vi rapporterede for nylig, at ABT-737 inducerer en hurtig og reversibel trombocytopeni hos dyr som følge af hæmning af Bcl-2-familieproteiner og induktion af apoptose i cirkulerende trombocytter uden knoglemarvstoksicitet (29). Som forventet inducerer ABT-263 også trombocytopeni. Efter en enkelt p.o.-dosis hos hunde faldt antallet af cirkulerende trombocytter inden for 2 timer med et trombocytnødpunkt efter 6 timer og tegn på genopblussen inden for 24 timer (fig. 5A). For at bestemme virkningerne af langvarig dosering undersøgte vi det farmakokinetiske/farmakodynamiske forhold efter flere daglige doser hos hund (fig. 5B). ABT-263 blev doseret p.o. med 2 mg/kg/d i 6 dage og derefter øget til 6 mg/kg/d i yderligere 6 dage. Trombocytetal og plasmakoncentrationer af lægemiddelkoncentrationer blev evalueret 6 timer efter behandlingen for at indfange de sandsynlige trombocyt-nedpunkter på dag 1 til 4 og dag 7 til 11. Ved 2 mg/kg faldt antallet af trombocytter fra en initial værdi på ∼250 000/μL til ∼125 000/μL ved anden dosis, hvorefter det holdt sig stabilt i de resterende doser. Plasmamedicinkoncentrationen, der blev opnået 6 timer efter behandlingen (C6h), forblev konstant på værdier mellem 3,6 og 4,2 μmol/L. Baseret på ABT-263’s farmakokinetiske profil (Supplerende fig. S1) er C6h omtrent 2 gange lavere end Cmax, hvilket indikerer, at de maksimale plasmakoncentrationer af lægemiddelkoncentrationer, der opnås efter flere doser på 2 mg/kg, er ∼7 til 8 μmol/L. Disse niveauer svarer til dem, der opnås efter en 100 mg/kg p.o. dosis i mus. Da dosis af ABT-263 blev øget til 6 mg/kg/d, faldt antallet af trombocytter til ∼50.000/μL på anden dagen efter denne højere dosis og forblev relativt konstant i hele undersøgelsens varighed. C6h-værdierne ved dette dosisniveau varierede fra 10,2 til 14,8 μmol/L (Cmax, 20-30 μmol/L). ABT-263 blev godt tolereret i denne undersøgelse uden dødelighed eller kliniske tegn på bivirkninger. Der var dog nogle hæmatomer synlige på stedet for venepunktur, hvilket var i overensstemmelse med ændringer i hæmostase. Disse data viser, at gentagen daglig eksponering af ABT-263 på niveauer, der har vist sig at være meget effektive i murine modeller, resulterer i ∼50 % reduktion af cirkulerende trombocytter hos hunde. Desuden tolereres plasmakoncentrationer, der er flere gange højere end det effektive niveau, godt, idet antallet af cirkulerende trombocytter reduceres til ∼50.000/μL.
Effekt af ABT-263 på cirkulerende trombocytter hos hunde. A, cirkulerende trombocyttalniveauer efter en enkelt p.o. dosis af ABT-263 (5 mg/kg) hos hunde. Søjler, gennemsnit (n = 3); søjler, SE. B, trombocytantal og ABT-263 plasmakoncentrationer efter flere daglige doser (2 mg/kg, dag 1-6; 6 mg/kg, dag 7-11) hos hund. Lukkede firkanter, ABT-263 plasmakoncentrationer; åbne cirkler, antal blodplader på dag 1 til 4 og dag 7 til 11. Punkter, gennemsnit (n = 3); søjler, SD.