Acetylcholin syntetiseres af acetylcoenzym A og cholin ved hjælp af enzymet cholinacetyltransferase. I nervesystemet menes dette enzym primært at eksistere i nerve terminal cytoplasmaet. Coenzym A syntetiseres i mitokondrier og får adgang til kolinacetyltransferase efter transport gennem mitokondriemembranen til cytoplasmaet. Ud over at det syntetiseres i leveren, stammer det cholin, der anvendes i acetylcholinproduktionen, fra fødevarekilder. Der findes et transportsystem i kapillære endothelceller, som er ansvarlig for transporten af cholin i dets frie og fosfolipidform til hjernen. Hydrolyse af cholinholdige fosfolipider kan også frigøre cholin, der anvendes i acetylcholinsyntesen. Da cholinacetyltransferase ikke er mættet af de koncentrationer af acetylcoenzym A og cholin, der skønnes at være til stede i nerve terminalen, ser det ud til, at acetylkolinsyntesens hastighed er afhængig af tilgængeligheden af forløberne. Enzymaktiviteten reguleres også af produktinhibering; ved at binde sig til et allosterisk sted på cholinacetyltransferase hæmmer acetylcholin dets aktivitet. Desuden har massevirkning og neuronal aktivitet indflydelse på acetylcholindannelseshastigheden. Den kortsigtede regulering af enzymaktiviteten opnås delvis ved fosforylering, der induceres af proteinkinaser. Der findes ingen meget specifikke og potente hæmmere af enzymet, og det skal bemærkes, at farmakologisk blokering af dette trin (f.eks. med naphthylvinylpyridin) i acetylcholins livscyklus giver en mindre dybtgående virkning på transmitteren end hæmning af cholintransporten.
En specifik lav-affin acetylcholintransportør er ansvarlig for optagelsen af transmitteren fra cytoplasmaet til vesikler. Generne for kolinacetyltransferase og den vesikulære acetylcholintransporter er organiseret i et enkelt genlokus, og transkriptionen af de to gener er typisk samreguleret. (±)-vesamicol er en selektiv hæmmer af denne transportør, idet L-(-)-vesamicol er mere virksomt end D-(+)-vesamicol. Når acetylcholin er pakket i vesikler, er det genstand for stimulusinduceret frigivelse ved eksocytose. Flere kraftige toksiner påvirker acetylcholinfrigivelsen, navnlig botulinumtoksin, som hæmmer frigivelsen.
Neuronal acetylcholinesterase inaktiverer meget hurtigt størstedelen af det acetylcholin, der frigives i hjernen, selv om butyrylcholinesterase, der findes i gliaceller, kan hydrolyserer en lille del af acetylcholinen i synapsen. I periferien er acetylcholinesterase til stede i muskler, der modtager kolinerg innervation, mens butyrylcholinesterase er mere udbredt. Der findes en række reversible (f.eks. physostigmin, BW284C51) og irreversible (f.eks. iso-OMPA) inhibitorer af acetylcholinesterase, og disse lægemidler har den virkning, at de forlænger acetylkolins synaptiske virkninger. Reversible antikolinesteraser af anden generation såsom donepezil, rivastigmin (ENA 713), eptastigmin og galantamin (galanthamin) anvendes som behandling af Alzheimers sygdom. Nogle andengenerations-kolinesteraser er blevet trukket tilbage fra klinisk brug på grund af uacceptable bivirkninger (f.eks. tacrin, metrifonat). Irreversible acetylcholinesterasehæmmere anvendes som insekticider og kemiske krigsføringsmidler. Cholin, som frigøres fra acetylcholin af acetylcholinesterase, optages igen i de kolinerge terminaler af en transportør med høj affinitet og genbruges i transmittersyntesen. Hemicholinium-3 hæmmer cholintransporten potent og reversibelt, hvilket resulterer i et kraftigt fald i acetylkolindannelsen. I modsætning til hemicholinium-3 er A-4 (en bis 4-methylpiperidin-analog af HC-3) aktiv efter perifer indgift. Nitrogen sennepsanaloger af cholin er potente irreversible inhibitorer af cholinoptagelse med høj affinitet.