Summary
Sucrose-densitetsgradient-ultracentrifugering er en effektiv teknik til fraktionering af makromolekyler som DNA, RNA og proteiner. Til dette formål lægges en prøve, der indeholder en blanding af makromolekyler af forskellig størrelse, i lag på overfladen af en gradient, hvis tæthed stiger lineært fra top til bund. Under centrifugering sedimenterer makromolekyler af forskellig størrelse gennem gradienten med forskellig hastighed. Sedimentationshastigheden afhænger ud over centrifugalkraften også af makromolekylernes størrelse, form og massefylde samt af gradientens massefylde og viskositet. På denne måde adskilles makromolekylerne efter størrelse, idet større makromolekyler sedimenterer mod bunden og lettere makromolekyler forbliver tæt på toppen af gradienten. Metoden har været særlig vellykket til størrelsesfraktionering af store DNA-molekyler og er blevet flittigt anvendt til at måle induktion og reparation af DNA-brud efter eksponering for klastogene faktorer. Her beskriver vi en tilpasning af denne metode, som kan anvendes til analyse af nysyntetiseret DNA, der dannes under DNA-replikation. Ved hjælp af størrelsesanalyse af spirende DNA i alkaliske saccharosegradienter kan variationer i replikationsaktiviteten måles efter eksponering af celler for DNA-skadelige stoffer. Metoden er særlig nyttig, da den gør det muligt at skelne mellem DNA-skade-medierede virkninger på kædeforlængelse vs. replikoninitiering, hvilket er afgørende for en dybtgående analyse af intra-S-fasens kontrolpunkt. Denne evne gør teknikken unik og retfærdiggør dens noget arbejdskrævende karakter.